李精華，張革紅

(1.山西醫(yī)科大學研究生院，太原 030000； 2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院腫瘤科，太原 030000)

胰腺癌是一種病死率很高的惡性腫瘤[1]，其發(fā)病率不斷上升，預計到2030年會成為美國和歐洲第二大癌癥死亡原因[2]。在胰腺癌中，胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)出現(xiàn)的概率超過90%，但5年生存率低于8%[3]。PDAC對放、化療和靶向治療等均不敏感，且還存在多種免疫抵抗機制，如改變遺傳和表觀遺傳、復雜且密集的腫瘤微環(huán)境以及腫瘤微環(huán)境中存在不同類型的免疫細胞等，而這些免疫細胞可以促進腫瘤的進展及復發(fā)，同時與腫瘤治療過程中耐藥性的出現(xiàn)存在密切聯(lián)系[4]。目前，惡性腫瘤免疫治療主要包括免疫檢查點抑制劑、嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)T細胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T細胞)、主動免疫和被動免疫等，CAR-T細胞療法作為腫瘤免疫治療中的重要方式之一，在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中實現(xiàn)了一定突破。近年來，隨著腫瘤靶點的不斷發(fā)現(xiàn)，CAR-T細胞療法成為實體腫瘤新的治療手段。CAR-T細胞可以識別腫瘤的特異性抗原，防止自身出現(xiàn)免疫耐受介導的現(xiàn)象，發(fā)生免疫逃逸[5]，CAR-T細胞的這一優(yōu)良特性顯示了其治療實體腫瘤的巨大前景?，F(xiàn)就CAR-T細胞治療PDAC的研究進展予以綜述。

1 CAR-T細胞概述

1.1CAR-T細胞的作用機制 CAR-T細胞是一種通過基因工程來表達針對某種特定抗原嵌合受體的T細胞，利用非組織相容性復合體限制的方法與腫瘤抗原特異性結(jié)合，啟動活化增殖后，特異性地殺傷腫瘤細胞。CAR作為T細胞受體中的嵌合分子，由抗原識別域和胞內(nèi)信號域組成，其中抗原識別域由單克隆抗體的單鏈可變區(qū)片段(single-chain variable fragment，scFv)構(gòu)成，多肽或其他蛋白質(zhì)也可作為其組成部分，能夠?qū)μ禺愋缘哪[瘤抗原進行識別，而胞內(nèi)信號會刺激T細胞活化并增殖，利用細胞溶解和細胞因子釋放等對腫瘤細胞進行消除[6]。

1.2CAR-T細胞的分類和發(fā)展 根據(jù)細胞內(nèi)的信號結(jié)構(gòu)區(qū)域CAR可分為三代，第一代CAR只包括細胞外結(jié)構(gòu)域(scFv)和細胞內(nèi)CD3ζ信號鏈；第二代CAR具有來自CD28或4-1BB分子的獨特的共刺激結(jié)構(gòu)域，通過提高改良T淋巴細胞的存活率，提高臨床療效[7]；第三代CAR由具有3個或更多細胞共刺激結(jié)構(gòu)域的分子組成，除了CD28和4-1BB(CD137)外，CD27、可誘導共刺激分子或OX40也可能被耦合，這在理論上增加了基因工程T淋巴細胞的激活、存活和效力[8]。CAR-T細胞療法目前已發(fā)展至第四代，其中二代CAR-T細胞治療血液系統(tǒng)腫瘤的成就最引人矚目。2017年，美國食品藥品管理局批準了兩種CAR-T細胞藥物，即用于治療兒童和年輕成年患者急性淋巴細胞白血病的Kymriah以及用于治療復發(fā)性、難治性大B細胞淋巴瘤成人患者的Yescarta，應用這兩種藥物治療的總體緩解率均能達80%以上[9]，但這種療法目前尚未在國內(nèi)獲批，仍需大量臨床試驗證明其療效及安全性。目前，關(guān)于實體腫瘤(如卵巢癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、神經(jīng)母細胞瘤以及肝癌)，CAR-T細胞療法在動物模型和臨床試驗中均已顯現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果。

2 CAR-T細胞作用于PDAC的相關(guān)靶點

CAR-T細胞療法針對的是腫瘤的特異性抗原，特異性越高，其有效性和安全性越高。CAR定向的理想靶抗原應是只在癌細胞中高表達的腫瘤特異性抗原，但目前發(fā)現(xiàn)的抗原基本屬于腫瘤相關(guān)抗原，而且腫瘤相關(guān)抗原在正常組織中存在不同程度的表達，此類抗原與CAR-T細胞結(jié)合后會攻擊正常組織，導致組織損傷，甚至會出現(xiàn)免疫缺陷的現(xiàn)象[10]。因此，尋找與PDAC相關(guān)的具有較高敏感性和特異性的抗原，增強惡性腫瘤治療的靶向性，可以防止正常組織損傷，減少治療過程中出現(xiàn)的不良反應。

2.1間皮素 間皮素是一種細胞表面的糖蛋白，其因在正常間皮細胞中的低表達和在廣譜實體腫瘤中的高表達而成為腫瘤免疫治療的一個重要靶點[11]。免疫組織化學和基因表達分析顯示，基本上所有的胰腺癌組織和細胞系中均有間皮素表達，但在正常的胰腺組織中一般沒有表達[12]。雖然間皮素在胰腺癌進展中的確切作用目前尚不明確，但對胰腺癌組織的前期研究表明，間皮素可能在推動胰腺癌細胞增殖、延緩細胞凋亡、增強癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[13]。已有相關(guān)研究進行動物模型實驗，為靶向間皮素的CAR-T細胞在胰腺癌治療中的潛在臨床應用提供了依據(jù)和經(jīng)驗，如He等[14]發(fā)現(xiàn)，靶向間皮素的CAR-T細胞可顯著抑制腫瘤生長，并能夠產(chǎn)生高水平的γ干擾素；此外，腫瘤緩解后更多靶向間皮素的CAR-T細胞分化為記憶性T細胞，對主要器官損傷較小。2015年，治療胰腺癌的首個CAR-T細胞藥物CARTmeso問世，研究者們用CARTmeso對6例化療難治性轉(zhuǎn)移性PDAC患者進行了Ⅰ期臨床研究，以評價CAR-T細胞療法的安全性和有效性，結(jié)果顯示4例患者發(fā)生了疾病進展，2例患者疾病穩(wěn)定，6例患者均未發(fā)生細胞因子釋放綜合征或神經(jīng)癥狀的不良反應，同時不存在劑量限制的毒性[15]。這表明，針對胰腺癌的CARTmeso治療具有可行性和安全性，但其抗腫瘤活性時間短暫，可能會出現(xiàn)疾病進展，因此需要聯(lián)合治療來加強CARTmeso的有效性和延長持續(xù)時間。目前，二代CARTmeso正在研究中，可能會更進一步優(yōu)化CARTmeso的療效。

2.2癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA) CEA也屬于一種腫瘤相關(guān)抗原，CEA在胰腺癌中表達的陽性率超過70%，是CAR-T細胞治療PDAC的理想靶點[16]。臨床前試驗結(jié)果證明，CEA-CAR-T細胞對腫瘤的生長具有顯著的抑制作用，同時發(fā)現(xiàn)重組人白細胞介素-12能夠在體內(nèi)提高CEA-CAR-T細胞的抗腫瘤活性，促進CEA-CAR-T細胞的增殖，表明CEA是治療PDAC的一個很有前途的靶點，聯(lián)合應用CEA-CAR-T細胞和重組人白細胞介素-12可以克服單純應用抗癌藥物的局限性，為實體腫瘤的治療提供新策略[17]。但也有報道顯示，靶向CEA的CAR-T細胞治療后，有患者出現(xiàn)明顯的呼吸系統(tǒng)不良反應，原因可能為肺上皮細胞表達CEA，而CAR-T細胞釋放的細胞因子γ干擾素同時也會上調(diào)細支氣管上皮細胞，使其表達更多的CEA，加重不良反應，因此在使用靶向CEA的CAR-T細胞治療時要謹慎衡量，防止出現(xiàn)嚴重不良反應[18]。

2.3前列腺干細胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA) PSCA是由人體自然產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)編碼基因，在60%～80%的PDAC中高表達，第一例PSCA-CAR-T細胞是基于人源化的7F5 scFv的第一代CAR，對PSCA陽性的膀胱癌細胞具有有效的體外細胞溶解活性[19]。有學者對第三代PSCA-CAR-T細胞(包含OX40和CD28共刺激結(jié)構(gòu)域)用于治療表達PSCA的黑色素瘤細胞進行了研究[20]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)共刺激信號域可以決定CAR對腫瘤抗原表達的敏感性，與含有CD28共刺激信號域的PSCA-CAR相比，PSCA-CAR中的4-1BB細胞共刺激信號域提高了對腫瘤抗原密度的選擇性，減少了T細胞耗竭表型，并具有同等的腫瘤殺傷能力[21]。

2.4黏蛋白1 (mucin 1，MUC1) MUC1屬于一種在上皮細胞根尖表面表達的跨膜糖蛋白，被國家癌癥研究所確認為第二大靶向抗原[22]。異常腫瘤相關(guān)MUC1(tumor-associated mucin 1,tMUC1)在80%的人PDAC中表達[23]，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子；tMUC1高表達發(fā)生在疾病的早期，與PDAC患者的預后不良有關(guān)[24]。臨床前實驗結(jié)果表明，胰腺癌細胞表面過度表達一種突變的Tn-MUCl抗原，用5E5-CAR-T細胞特異性識別Tn-MUCl治療PDAC荷瘤小鼠，能使小鼠的惡性腫瘤大部分消退，生存時間增加，且存活率超過60%[25]。研究還發(fā)現(xiàn)，利用單克隆抗體TAB 004的可變片段研制的新型CAR-T細胞可在PDAC細胞上與tMUC1特異性結(jié)合，具有較強的殺傷活性，但并不結(jié)合或殺死正常的上皮細胞，進一步證明tMUC1-CAR-T細胞在體內(nèi)能夠抑制胰腺原位腫瘤的生長[26]。但是，眾所周知PDAC對包括免疫治療在內(nèi)的多種治療方法存在耐藥性[27]。因此，發(fā)現(xiàn)PDAC對tMUC1-CAR-T細胞治療不敏感以及耐藥后并不奇怪，對與免疫耐受相關(guān)基因進行的實時熒光定量聚合酶鏈反應分析顯示，吲哚胺2，3-雙加氧酶-1、環(huán)加氧酶1/2以及半乳糖凝集素-9在耐藥的PDAC細胞中均過度表達，表明CAR-T細胞與吲哚胺2，3-雙加氧酶、環(huán)加氧酶1/2、半乳糖凝集素-9等生物抑制劑的結(jié)合可顯著增強CAR-T細胞對PDAC細胞的殺傷作用[26，28]。基于以上研究，MUC1可以作為治療胰腺導管腺癌的一個很有希望的CAR-T細胞的靶點。

2.5人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2) HER2屬于一種跨膜糖蛋白，在發(fā)育中的胚胎和成體組織中能夠介導細胞的增殖和分化[29]。HER2可對細胞凋亡進行抑制，誘導新生血管形成，增強細胞運動能力，從而促進腫瘤的快速生長增殖和浸潤轉(zhuǎn)移[30]。HER2在正常組織(尿道、胃腸道、呼吸道等組織)中的表達水平不同，在7%～58%的胰腺癌組織中能夠檢測到HER2過表達[31]，因此HER2可作為胰腺癌CAR-T細胞治療的特異性靶點。目前針對HER2-CAR-T細胞治療的Ⅰ期臨床試驗已完成，評價了治療晚期胰腺癌的可行性和安全性，試驗中11例患者使用白蛋白結(jié)合型紫杉醇和環(huán)磷酰胺進行預處理后，接受1～2周期HER2-CAR-T細胞灌注，其中1例患者獲得4.5個月的部分緩解，5例患者疾病穩(wěn)定，且HER2-CAR-T細胞輸注后相關(guān)的不良事件均為輕、中度；輸注后的毒性反應包括：1例患者在CAR-T細胞-HER2細胞灌注11 d后出現(xiàn)了可逆的嚴重上消化道出血，2例患者出現(xiàn)1～2級遲發(fā)性發(fā)熱，同時伴有C反應蛋白和白細胞介素-6釋放[32]。因此，CAR-T細胞-HER2可作為治療晚期胰腺癌的特異性靶點，但需注意相關(guān)毒性反應。

2.6成纖維活化蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP) FAP作為一種跨膜絲氨酸蛋白酶，高度表達于胰腺癌外基質(zhì)中的一個抗原表位，F(xiàn)AP-CAR-T細胞的主要作用機制之一為增強內(nèi)源性CD8受體T細胞的抗腫瘤反應[33]。目前，針對胰腺癌的CAR-T細胞研究已完成臨床前試驗。研究證明，F(xiàn)AP-CAR-T細胞介導的腫瘤基質(zhì)破壞能夠促進藥物的傳遞，抑制腫瘤的進展，且與單獨治療相比，聯(lián)合吉西他濱化療具有更強的抗腫瘤活性；同時研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP-CAR-T細胞能夠?qū)⒁恍┠[瘤外基質(zhì)細胞進行清除，以達到抑制胰腺腫瘤生長的目的[34]。FAP-CAR-T細胞療法有望聯(lián)合放、化療和免疫檢查點抑制劑，提高胰腺癌治療的有效率。

2.7自然殺傷細胞2族成員D配體(natural killer group 2 member D ligand，NKG2DL) 目前已經(jīng)鑒定出兩個NKG2DL家族，包括主要組織相容性復合體 Ⅰ 類鏈相關(guān)蛋白A/B和UL16結(jié)合蛋白(UL16-binding protein，ULBP)[35]。NKG2DL在正常細胞中一般不表達或表達極少，但當細胞受到感染或發(fā)生癌變時，NKG2DL的表達量會大幅上升，許多不同組織來源的腫瘤細胞系和原發(fā)腫瘤均表達NKG2DL，提示NKG2DL可能是實體腫瘤和血液病的治療靶點，其中主要組織相容性復合體 Ⅰ 類鏈相關(guān)蛋白A/B在胰腺癌的表達中占68%～89.3%[36]。針對胰腺癌的自然殺傷細胞受體(natural killer cell receptor,NKR)-2 CAR-T細胞治療已經(jīng)完成了臨床前試驗，結(jié)果表明，NKR-2 CAR-T細胞能夠抑制胰腺癌細胞的增殖，且NKR-2 CAR-T細胞療法在治療急性髓細胞性白血病和多發(fā)性骨髓瘤者的 Ⅰ 期臨床試驗中表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性，目前NKR-2 CAR-T細胞療法治療胰腺癌的 Ⅰ 期臨床試驗正在進行[35]。

3 CAR-T治療PDAC存在的挑戰(zhàn)

雖然CAR-T細胞免疫療療法在過去幾年取得了臨床上的成功，但這種治療方法仍存在諸多挑戰(zhàn)。CAR-T細胞治療常見的挑戰(zhàn)有細胞因子釋放綜合征、脫靶效應、非腫瘤效應、腫瘤免疫微環(huán)境的抑制以及CAR-T細胞插入的突變等，其中最致命的為細胞因子釋放綜合征，這是因為大量的CAR-T細胞被激活后導致細胞因子過度分泌，嚴重者可引起急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭等危及生命。但在目前的臨床實踐中，細胞因子釋放綜合征在血液腫瘤的CAR-T細胞治療中更為常見，研究發(fā)現(xiàn)CAR-T細胞免疫療法在治療實體腫瘤的過程中，可通過聯(lián)合使用大劑量糖皮質(zhì)激素、血管升壓素和白細胞介素-6受體抗體進行治療來預防細胞因子釋放綜合征以及其他不良反應[37]。此外研究表明，在CAR-T細胞治療前，采用清除T細胞的方法對機體進行預處理可顯著減少不良反應[38]。

有報道顯示，患者的T細胞質(zhì)量會影響CAR-T細胞療法的成敗，其成功的關(guān)鍵為T細胞的擴增能力，多數(shù)患者在接受CAR-T細胞療法時已接受了多個周期細胞毒藥物的治療，已經(jīng)造成了記憶性T細胞和天然T細胞的大量損失，特別是在經(jīng)過多次化療后CD27/CD28表達丟失的淋巴瘤患者中尤為顯著，胰腺癌患者也面臨同樣狀況[39]。由于CAR-T細胞目前尚不是治療實體腫瘤的一線療法，因此，多次化療后機體內(nèi)環(huán)境的變化也應作為影響因素，在使用CAR-T細胞治療前予以考慮。

4 小 結(jié)

CAR-T細胞療法屬于新興腫瘤免疫治療，在治療血液腫瘤及非血液系統(tǒng)腫瘤中均取得了一定突破。目前已經(jīng)存在的研究成果為未來的胰腺癌研究提供了相關(guān)的治療經(jīng)驗及參考。今后的研究方向仍集中于開發(fā)新的特異性靶點、攻克腫瘤微環(huán)境以及減少脫靶效應，同時構(gòu)建基于免疫治療的聯(lián)合治療方案，通過與傳統(tǒng)化放療、分子靶向治療、免疫檢查點抑制劑、生物抑制劑、腫瘤疫苗等有效聯(lián)合，發(fā)揮更好的臨床效用。另外，增強CAR-T細胞特異性殺傷腫瘤細胞的能力，發(fā)現(xiàn)更多的特異性腫瘤抗原，可以為未來CAR-T細胞治療PDAC提供更多依據(jù)。