周芷錦 穆 琳

浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，杭州310020

1929年英國(guó)科學(xué)家在培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)無(wú)意中發(fā)現(xiàn)了青霉素的存在，自此抗生素出現(xiàn)在人類歷史上，幫助人類和動(dòng)物戰(zhàn)勝了很多疾病。20 世紀(jì)50年代前后，抗生素促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和預(yù)防疾病的作用在養(yǎng)殖中被發(fā)現(xiàn)，自此抗生素作為促生長(zhǎng)劑在養(yǎng)殖業(yè)中大量使用。據(jù)Thomas 等[1]估計(jì)，2010年全球每年生產(chǎn)牛、雞、豬產(chǎn)品所消耗抗生素的用量為45 mg/kg，148 mg/kg 和172 mg/kg，到2030年，這一數(shù)據(jù)將會(huì)增加67%。而在我國(guó)，據(jù)中科院公布的數(shù)據(jù)，2013年我國(guó)的抗生素總使用量為16.2 萬(wàn)t，居世界第一，遠(yuǎn)超第二位的美國(guó)，其中獸用抗生素占52%?？股氐氖褂脴O大提高了人類生存率和養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)效能，但其大量使用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性的問題日趨嚴(yán)重，已成為威脅公共衛(wèi)生的國(guó)際問題。為了遏制耐藥性進(jìn)一步發(fā)展，結(jié)合抗生素使用分布現(xiàn)實(shí)，獸用抗生素的減量化，特別是抗生素促生長(zhǎng)劑的減量化甚至禁用成為了必然。1986年瑞典率先禁用了抗生素促生劑，隨后歐盟各國(guó)開始對(duì)抗生素促生長(zhǎng)劑進(jìn)行不同程度的限制[2]，到2006年1月1日歐盟撤銷了所有抗生素的促生長(zhǎng)用途。面對(duì)我國(guó)細(xì)菌耐藥性的問題，特別是我國(guó)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的不斷發(fā)展，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194 號(hào)公告，到2020年年底前，我國(guó)將退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)藥物飼料添加劑。根據(jù)丹麥的國(guó)家豬生產(chǎn)委員會(huì)（NCPP）的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，促生長(zhǎng)藥物飼料添加劑禁用后，豬體內(nèi)的潛在病原菌出現(xiàn)耐藥性的概率的確下降了，但豬的生產(chǎn)性能在不同生長(zhǎng)階段同樣出現(xiàn)不同程度的下降，對(duì)于斷奶仔豬的影響較大，生產(chǎn)速率下降了18 g/d，斷奶后死亡率也較禁用前提高0.6%，同時(shí)腹瀉和感染其他疾病的發(fā)生率也有明顯提高[2]。在這一形勢(shì)下，為了促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的健康高效有序的發(fā)展，養(yǎng)殖業(yè)中抗生素替代物的研究，包括微生態(tài)制劑、中草藥等成為了研究熱點(diǎn)。

1 微生態(tài)制劑（益生菌）替代抗生素的研究

微生態(tài)制劑，又叫活菌制劑、益生素、益生菌等，最早在1974年由Parker 提出與“抗生素”相對(duì)的新概念[3]，1989年Fuller[4]對(duì)微生態(tài)制劑做了具體的定義，定義微生態(tài)制劑是一類能夠促進(jìn)腸道內(nèi)微生物平衡，對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的活的微生物添加劑。1994年在德國(guó)召開的國(guó)際會(huì)議上，對(duì)微生態(tài)制劑的定義進(jìn)一步完善，定義微生態(tài)制劑是指含活菌或死菌，包括其組分和產(chǎn)物的細(xì)菌制品，經(jīng)口或其他黏膜途徑投入，旨在改善黏膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特異性或非特異性免疫機(jī)制[5]。國(guó)外早在20 世紀(jì)20年代就開始研究微生態(tài)制劑。目前，美國(guó)允許直接飼喂動(dòng)物的微生物制劑有43 種，包括嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌等。日本主要采用枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、乳酸桿菌等作為微生態(tài)制劑。我國(guó)微生態(tài)制劑的研究起步于20 世紀(jì)70年代[6]。經(jīng)過(guò)不斷地發(fā)展和增補(bǔ)，2013年底我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布了2045 號(hào)公告（飼料添加劑品種目錄（2013）），按照該目錄我國(guó)目前可用的微生物添加劑一共有34 種，包括地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、釀酒酵母等[7]。在使用量上，20 世紀(jì)70年代，美國(guó)微生態(tài)制劑的年產(chǎn)量已在8 000 t 以上。近年來(lái)已經(jīng)達(dá)到約5萬(wàn)t/年。我國(guó)這方面發(fā)展較晚，但2010年微生態(tài)制劑也達(dá)到4 萬(wàn)t[8]。

1.1 微生態(tài)制劑的促生長(zhǎng)、提高生產(chǎn)性能作用研究

動(dòng)物的胃腸道是一個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)，本身存在大量的微生物，形成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。微生態(tài)制劑的活菌作為腸道的有益菌，在進(jìn)入腸道后，增加了腸道有益菌總量，與腸道內(nèi)源的有益菌形成優(yōu)勢(shì)菌群，改善腸道壞境，如調(diào)節(jié)腸道pH 值，維持腸道厭氧環(huán)境等，對(duì)動(dòng)物消化道系統(tǒng)的發(fā)育和生理功能、免疫器官的發(fā)育等產(chǎn)生重要影響，同時(shí)對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)起到一定的緩和作用。李雪莉等[9]設(shè)計(jì)以對(duì)照組、抗生素組和微生態(tài)制劑組來(lái)研究植物乳桿菌為主的微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能、器官的重量和胃腸道發(fā)育的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明：在生產(chǎn)性能上，微生態(tài)制劑可顯著提高斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量，降低料重比；在器官重量上，微生態(tài)制劑顯著提高斷奶仔豬脾臟相對(duì)重量，對(duì)胃、十二指腸、肝臟等器官的重量也有增加的趨勢(shì)；在腸道形態(tài)發(fā)育上，顯著增加斷奶仔豬十二指腸絨毛高度，顯著降低十二指腸、空腸、回腸絨隱比。該試驗(yàn)同樣表明抗生素組與微生態(tài)制劑組在促生長(zhǎng)和提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能上無(wú)顯著差異。鐘光等[10]通過(guò)對(duì)雄性肉仔雞注射地塞米松應(yīng)激，研究微生態(tài)制劑對(duì)其生產(chǎn)性能和腸道健康影響。研究發(fā)現(xiàn)：應(yīng)激能破壞腸道微環(huán)境，降低生產(chǎn)性能，抑制免疫器官發(fā)育；微生態(tài)制劑能使死淘率顯著降低，29日齡胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)分別提高14.29%、16.67%和20.00%，29日腸道絨毛高度增加33.3%，微生態(tài)制劑能顯著緩解應(yīng)激對(duì)腸道絨毛的損傷。另外有益菌定植在腸道內(nèi)，其代謝產(chǎn)酸、產(chǎn)維生素、產(chǎn)氨基酸等影響腸道內(nèi)容物化學(xué)成分組成，影響或參與動(dòng)物體內(nèi)的代謝途徑，其自身會(huì)分泌產(chǎn)生包括蛋白酶在內(nèi)的各種消化酶，有利于提高動(dòng)物的采食效率，蛋白的轉(zhuǎn)化率等，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。崔闖飛等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)蛋后期的蛋雞飼糧中添加8×109cfu/g 的枯草芽孢桿菌時(shí)，顯著降低了平均日采食量和料蛋比；顯著增加了蛋殼厚度、強(qiáng)度和殼重比，顯著降低了破、軟蛋率，增加了蛋殼中鈣含量，但對(duì)產(chǎn)蛋率和平均蛋重?zé)o顯著影響。王曉峰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在海蘭褐蛋雞的飼糧中添加0.05%以枯草芽孢桿菌為主的微生態(tài)制劑，蛋雞的產(chǎn)蛋率提高10.2%，降低了料蛋比和不合格蛋率，提升了A 級(jí)蛋的比例，從49.54%到59.35%。張進(jìn)紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在荷斯坦奶牛飼料中按1.0 g/kg 比例添加乳酸菌、芽孢桿菌等組成的復(fù)合微生態(tài)制劑，平均日產(chǎn)奶量提高1.9 kg，降低料奶比，改善奶牛泌乳性能；乳脂率提高0.18%，乳蛋白率提高0.16%，顯著改善奶牛的乳品質(zhì)。

1.2 微生態(tài)制劑的預(yù)防疾病作用研究

抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中大量使用除了用于治療具體動(dòng)物疾病以外，另一個(gè)重要原因是長(zhǎng)期低劑量的飼喂抗生素可以預(yù)防疫病的發(fā)生，降低養(yǎng)殖損耗率。微生態(tài)制劑如要代替抗生素在飼料中大量添加使用，則同樣需要有保護(hù)動(dòng)物健康，減低疫病發(fā)生概率的作用。目前關(guān)于微生態(tài)制劑預(yù)防疾病，起健康保護(hù)作用的表現(xiàn)主要包括保護(hù)腸道上皮細(xì)胞和加強(qiáng)上皮細(xì)胞間緊密度的機(jī)械屏障；對(duì)腸道黏膜占位保護(hù)，分泌有機(jī)酸等抑制致病菌的生物屏障；改善上皮細(xì)胞免疫功能和調(diào)節(jié)腸道免疫細(xì)胞的免疫屏障；產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物和酶形成的化學(xué)屏障[14]。魏銀萍等[15]研究比較了嗜酸乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和糞腸球菌在致病菌對(duì)HT-29 細(xì)胞和粘蛋白粘附作用方面的抑制效果，試驗(yàn)證明：三者分別可使致病性大腸桿菌粘附率由6.7%下降到2.85%，0.214%，1.9%；使傷寒沙門氏菌粘附率由32.49%下降到16.95%，12.93%，20.33%，具有較好的抑制作用。張丹等[16]研究發(fā)現(xiàn)側(cè)孢短芽孢桿菌S62—9 利用其自身的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制和產(chǎn)生抗菌肽的拮抗作用，對(duì)試驗(yàn)的27 株細(xì)菌中大多數(shù)致病性細(xì)菌及部分真菌產(chǎn)生抑菌作用。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的效果好于革蘭氏陰性菌，尤其對(duì)致病性金黃色葡萄球菌、鏈球菌、單增李斯特氏菌的抑菌效果最明顯。Baron 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30 能夠提高T 細(xì)胞中腫瘤壞死因子的含量，可用來(lái)防治腺病毒和甲型流感病毒等特定病毒感染。目前微生態(tài)制劑已經(jīng)應(yīng)用在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，在預(yù)防疾病，提高動(dòng)物機(jī)體免疫力方面有一定的成效。陳西風(fēng)等[18]對(duì)金霉素和復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)肉仔雞腸道菌群和免疫功能影響的研究發(fā)現(xiàn)，微生態(tài)制劑可顯著增加胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)、IgA 含量和IgG 含量，顯著降低腸道內(nèi)大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)，當(dāng)添加量在0.1%、0.2%時(shí)，與添加量0.05%金霉素比較，效果更優(yōu)于金霉素。薛俊龍等[19]對(duì)1～5日齡的雛雞飼喂微生態(tài)制劑，在6日齡進(jìn)行雞白痢沙門氏菌攻毒實(shí)驗(yàn)，微生態(tài)制劑的保護(hù)率為94%，攻毒對(duì)照組保護(hù)率為76%，早期雛雞飼喂微生態(tài)制劑能有效預(yù)防雞白痢。

1.3 微生態(tài)制劑替代抗生素存在的問題與展望

目前研究中微生態(tài)制劑存在的問題與研究方向：有益菌菌種的選擇：目前可應(yīng)用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌株很多，菌株的抑菌效果也屢見報(bào)道[15-17]，但菌株進(jìn)入腸道的定植效果仍需進(jìn)一步研究，有些菌株在進(jìn)入腸道后因?yàn)槟c道本身的環(huán)境并不能形成優(yōu)勢(shì)菌群，怎么選擇培育優(yōu)勢(shì)菌種是微生態(tài)制劑生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。有效活菌數(shù)的保持：微生態(tài)制劑要起到良好的效果需要達(dá)到一定的活菌數(shù)[20]。影響活菌數(shù)主要包括了2 個(gè)方面：一方面日前有報(bào)道不同的生產(chǎn)工藝對(duì)活菌存活率有很大影響[21]，怎樣改進(jìn)生產(chǎn)工藝是微生態(tài)制劑廠家未來(lái)研究的重點(diǎn)；另一方面活菌制劑從出廠到養(yǎng)殖場(chǎng)的運(yùn)輸過(guò)程以及在養(yǎng)殖場(chǎng)保藏期間怎么做到活菌數(shù)的保持，活菌制劑在使用時(shí)是否還具有有效性的相關(guān)研究還較少。此外，活菌制劑在與抗生素同時(shí)使用后是否還能保持腸道內(nèi)的益生菌數(shù)量也需要進(jìn)一步研究?；罹苿┑哪退幮裕夯罹苿┍旧硎抢糜幸婢趧?dòng)物腸道內(nèi)與致病菌競(jìng)爭(zhēng)，以達(dá)到抑制致病菌的作用，從而替代抗生素使用，減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。但活菌制劑中的菌株，如糞腸球菌等，是否會(huì)與耐藥菌株發(fā)生耐藥基因的傳遞，反而增加耐藥菌株是未來(lái)需要研究的問題。

2 中藥替代抗生素的研究

中藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的寶貴財(cái)富，相比抗生素，中藥有副作用相對(duì)較小，不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，同時(shí)中藥也可以很好地避免養(yǎng)殖業(yè)抗菌藥物應(yīng)用導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品藥物殘留的問題。隨著抗生素耐藥性問題的發(fā)生，社會(huì)對(duì)無(wú)抗動(dòng)物產(chǎn)品的呼聲不斷提高，養(yǎng)殖業(yè)的抗生素使用量必將大幅度降低。在這個(gè)背景下，中藥作為我國(guó)的傳統(tǒng)藥物，其在養(yǎng)殖業(yè)中抗生素替代物的研究以及應(yīng)用上可發(fā)揮的作用更為值得關(guān)注。近年來(lái)，我國(guó)的中獸藥整體規(guī)模在不斷擴(kuò)大，2016年我國(guó)中獸藥生產(chǎn)企業(yè)有1 313家，實(shí)現(xiàn)總產(chǎn)值45.45 億元，占化藥企業(yè)總產(chǎn)值的12.80%，是2008年的近3 倍。中獸藥的劑型包括有散劑、片劑、注射劑、顆粒劑和合劑（含口服液）。除此之外，中獸藥在養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用還有作為飼料添加劑、中藥提取物等[22]。隨著醫(yī)藥生產(chǎn)工藝的不斷進(jìn)步，還出現(xiàn)了中藥超微粉[23]等新中獸藥產(chǎn)品。

2.1 中藥對(duì)提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能作用的研究

各項(xiàng)研究證明，中藥作為飼料添加劑添加到飼喂日糧中可以顯著提高畜禽的生長(zhǎng)性能，包括提高日增重、日采食量、降低其料重比，效果與抗生素相當(dāng)[24-25]?？梢蕴岣唢暳橡B(yǎng)分的消化率，李麗等[26]對(duì)比了金霉素組和中藥組（黃芪、陳皮、蒼術(shù)等）與對(duì)照組對(duì)飼料養(yǎng)分的消化率，2 組粗蛋白、粗纖維、粗脂肪的表觀消化率分別比對(duì)照組提高了4.43%、10.27%、5.36% 和4.65%、8.82%、4.86%，中藥組與金霉素組的效果無(wú)顯著差異。此外，中藥對(duì)于畜禽的應(yīng)激反應(yīng)有很好的緩解保護(hù)作用。武果桃等[27]研究發(fā)現(xiàn)，以刺五加、黃芪、元胡、黨參、五味子、山楂、甘草等藥物按一定比例組方的中藥可以使高溫應(yīng)激雞的肝臟中HSP70 mRNA 表達(dá)顯著增加，HSP70熱休克蛋白在細(xì)胞內(nèi)的合成，可以抵抗應(yīng)激造成的組織細(xì)胞損傷，提高機(jī)體熱耐受水平，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞作用。

目前，對(duì)于中藥促生長(zhǎng)的機(jī)制研究相對(duì)較少，主要包括中藥對(duì)腸道健康保護(hù)作用，提高機(jī)體抗氧化能力的作用，對(duì)血清激素水平的作用等。張偉等[28]通過(guò)研究豬血清中抗氧化酶活性、丙二醛和腸道菌群變化以探索中藥對(duì)豬促生長(zhǎng)的機(jī)制，結(jié)果表明添加中藥飼喂后豬血清中還原性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性顯著提高，丙二醛的含量顯著降低，并顯著改善豬腸道的微生物多樣性，提高了有益菌，特別是乳酸菌的豐度比例。胡丹等[29]研究同樣證明了中藥能提高肥育豬的總抗氧化能力，顯著降低血清中的丙二醛濃度，90日齡、110日齡、130日齡較對(duì)照組血清MDA 濃度分別降低了35.2%、39.4%、37.0%。霍書英等[30]以肉仔雞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究中藥對(duì)血清中激素水平的影響。研究表明：中藥使促進(jìn)器官組織分化的甲狀腺素T3、T4 的水平顯著提高，且T3、T4 水平高的中藥組增重速度也較快；中藥組血清中GH 的水平顯著低于對(duì)照組，與生長(zhǎng)速率成反比。另外該研究發(fā)現(xiàn)中藥組的尿酸、尿素氮水平顯著低于對(duì)照組，證明了中藥可以改善蛋白質(zhì)的代謝情況，促進(jìn)蛋白質(zhì)的吸收、代謝和沉積。

2.2 中藥抗菌作用的研究

1）中藥抑菌作用。中藥作為傳統(tǒng)藥物，其抗菌作用得到廣泛的認(rèn)可，研究發(fā)現(xiàn)，中藥的抗菌作用主要來(lái)源其生物活性成分，目前認(rèn)為中藥的抗菌活性成分包括黃酮類、生物堿類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、多糖類、皂苷類、蒽醌類、萜類等[31]。從中藥的抑菌機(jī)制來(lái)分，主要包括破壞細(xì)菌的生物被膜改變細(xì)胞的通透性、抑制菌體內(nèi)酶的活性、影響細(xì)菌蛋白質(zhì)核酸的合成以及提高機(jī)體的免疫作用[32]。從中藥制劑來(lái)看，中藥有單方和復(fù)方之分，在抑菌作用上不只是某一種有效成分，還存在多種成分協(xié)同作用的效果。李美發(fā)等[33]通過(guò)研究黃芪、何首烏、黃連、金銀花、大黃、白頭翁、五倍子、葛根等8 種中草藥的提取液對(duì)豬腸道大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用來(lái)探究中藥組方對(duì)抑菌效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：?jiǎn)畏教砑狱S連、金銀花和五倍子對(duì)大腸桿菌抑菌效果較好；單方添加黃芪、黃連和大黃對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果較好；單方添加黃連和大黃對(duì)沙門氏菌抑菌效果較好。復(fù)方添加以黃芪0.25 mg/mL+黃連0.5 mg/mL+大黃0.25 mg/mL 體外抑菌效果最好，對(duì)3 種菌均有抑制作用。智曉艷等[34]研究發(fā)現(xiàn)黃連、黃芩、丹參和連翹對(duì)鏈球菌具有較好抑菌作用，最小抑菌濃度（MIC 值） 分別為32.0、32.0、16.0 和125.0 g/L，最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC值）分別為32.0、64.0、32.0 和125.0 g/L，以其為主藥組成的復(fù)方呈現(xiàn)協(xié)同抗菌作用。

2)中藥的耐藥性消除作用。研究發(fā)現(xiàn)，中藥除了本身具有抑菌作用外，對(duì)耐藥菌株的耐藥性也具有一定的消除作用。韋嬪等[35]對(duì)豬源致病性大腸桿菌的抑菌效果以及對(duì)慶大霉素耐藥性消除情況的研究表明除魚腥草外，黃連、金銀花、艾葉、五倍子表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，五倍子的抑菌效果最好；對(duì)慶大霉素耐藥性消除方面，黃連、金銀花、艾葉和五倍子均能消除致病性大腸桿菌對(duì)慶大霉素的耐藥性，其中五倍子對(duì)菌株耐藥性的平均消除率最高，作用24 h 后，平均消除率為12.53%，其最高消除率可達(dá)22.33%；作用48 h 后其平均消除率為13.68%，最高消除率可達(dá)24.4l%。中藥消除耐藥性的機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面：消除耐藥R 質(zhì)粒、抑制耐藥菌的抗生素主動(dòng)外排泵機(jī)制、抑制耐藥基因的表達(dá)。郭威等[36]研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM 轉(zhuǎn)錄表達(dá)的抑制作用使其可恢復(fù)部分抗菌藥物的敏感性，實(shí)驗(yàn)證明頭孢他啶、頭孢匹羅、左氧氟沙星、美羅培南對(duì)PAO1、Mex1、Mex2、Mex3 株菌的最小抑菌濃度（MIC 值）分別降低50%、75%、75%和50%～75%。蔣加進(jìn)等[37]以煎煮法制備的黃連提取液，進(jìn)行了耐藥質(zhì)粒(R 質(zhì)粒)消除試驗(yàn)，結(jié)果表明，黃連提取液對(duì)雞源多重耐藥大腸桿菌耐藥性有一定的消除作用，其消除率跟作用時(shí)間有一定關(guān)系，24 h 和48 h 的耐藥性消除率分別達(dá)到4.5%和13.25%。任玲玲等[38]研究發(fā)現(xiàn)連翹作用后多重耐藥大腸埃希菌編碼主動(dòng)外排泵系統(tǒng)的AcrA 基因發(fā)生了24 個(gè)堿基突變，改變了AcrA 基因的編碼序列，從而有效抑制多重耐藥大腸埃希茵的生長(zhǎng)，減弱其耐藥性。

2.3 中藥替代抗生素存在的問題與展望

根據(jù)目前的研究報(bào)道，中藥在替代抗生素應(yīng)用中存在的問題：中藥成分不明確在應(yīng)用上講究的是君臣佐使的配伍，復(fù)方藥劑的效果往往好于單一藥劑[33-34]。目前研究中從中藥提取到了一部分具有抑菌作用的活性成分，如黃酮類，但對(duì)于藥材中其他成分在抗菌治療中的效果不明確，對(duì)復(fù)方藥劑成分的相互作用不明確，對(duì)成分是否有毒副作用不明確。中藥提取方式對(duì)抑菌效果的影響：中藥提取方式包括了干燥，粉碎，醇提，超聲等。據(jù)報(bào)道，不同的提取方式對(duì)抑菌效果影響極大，單一的提取方式的抑菌效果不如多方式結(jié)合的抑菌效果，甚至?xí)贸鱿喾吹慕Y(jié)果[33,39-40]。另外，目前研究報(bào)道的中藥抑菌作用的研究對(duì)象基本為中藥的提取物，對(duì)于直接使用中藥材添加到養(yǎng)殖動(dòng)物的飼糧中能否起到抑菌作用尚不明確。中藥抑菌作用研究大多還局限在體外試驗(yàn)，對(duì)于中藥在動(dòng)物體內(nèi)作用的研究還比較少?；谏鲜鲈?，中藥要替代抗生素在養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用還不成熟，中藥的抑菌作用還需進(jìn)一步研究，特別是中藥如何在動(dòng)物體內(nèi)達(dá)到體外試驗(yàn)效果的研究還需大量的試驗(yàn)證明。

3 噬菌體替代抗生素的研究

噬菌體是一類廣泛存在于自然界中，能感染細(xì)菌、真菌類、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱。1915年英國(guó)微生物學(xué)家Twort[41]首次報(bào)道了其在葡萄球菌培養(yǎng)物的濾液中發(fā)現(xiàn)了可裂解葡萄球菌的物質(zhì)，觀察到了清晰的裂菌斑。隨后，1917年法籍加拿大微生物學(xué)家D′HerelletS[42]正式提出了“噬菌體”這一概念。噬菌體自發(fā)現(xiàn)就被應(yīng)用于人體治療包括痢疾、霍亂等由細(xì)菌感染造成的疾病[43]。20世紀(jì)70、80年代，Smith 等[44]經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道了噬菌體對(duì)小牛、仔豬和羊羔大腸桿菌感染的治療作用。研究表明噬菌體可以顯著減少腸道內(nèi)致病性大腸桿菌的數(shù)量，有效防治大腸桿菌感染導(dǎo)致的腹瀉，降低死亡率。但隨著抗生素時(shí)代的到來(lái)，抗生素大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)和其廣譜的抗菌效果，成為了時(shí)代的主導(dǎo)，關(guān)于噬菌體的研究逐步停滯。近年來(lái)，抗生素大量使用造成了細(xì)菌耐藥的問題，噬菌體因?yàn)槠涮禺愋詮?qiáng)，不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒副作用，且不會(huì)破壞機(jī)體正常的菌群、引發(fā)嚴(yán)重的內(nèi)毒血癥等特點(diǎn)[45]，被認(rèn)為是一類重要的抗生素替代物，特別是針對(duì)耐藥菌株的抗生素替代物，得到了重新重視。

3.1 噬菌體的分類

自然界中噬菌體的種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)的噬菌體超過(guò)5 100 種。按其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征分為有尾結(jié)構(gòu)的噬菌體、立方體結(jié)構(gòu)的噬菌體、絲狀結(jié)構(gòu)的噬菌體、多形結(jié)構(gòu)的噬菌體，其中有尾結(jié)構(gòu)的噬菌體最多，占96%。在有尾結(jié)構(gòu)的噬菌體中，長(zhǎng)尾噬菌體又占61%[46]。按照噬菌體對(duì)宿主的作用方式的不同，可分為兩大類，即烈性噬菌體和溫和型噬菌體[47]。烈性噬菌體感染宿主菌后，會(huì)在宿主菌細(xì)胞內(nèi)迅速大量繁殖，進(jìn)而裂解宿主菌并釋放，進(jìn)一步侵染其他宿主菌。溫和型噬菌體在侵染宿主菌細(xì)胞后，噬菌體本身的遺傳物質(zhì)與宿主的核染色體會(huì)整合到一起，隨著宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的復(fù)制而復(fù)制，正常情況下噬菌體不會(huì)大量增殖，也不會(huì)裂解宿主菌[48]。

3.2 噬菌體對(duì)動(dòng)物抗細(xì)菌感染的應(yīng)用研究

目前噬菌體對(duì)抗動(dòng)物源細(xì)菌感染的研究主要包括致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等。Sheng 等[49]以小鼠為模型，飼喂噬菌體/細(xì)菌比率為2:102 的特異性噬菌體SHI 或SHI 與KH1 的混合物，結(jié)果表明噬菌體組小鼠在飼喂2～6 d后，糞便中無(wú)法檢出大腸桿菌O157:117，而對(duì)照組小鼠在10 d 后仍檢出大腸桿菌。隨后，把該噬菌體應(yīng)用于荷斯坦奶牛，實(shí)驗(yàn)證明，噬菌體同樣可以減少奶牛腸道內(nèi)的大腸桿菌O157:117，但不能完全消除。孫宇杰等[50]研究發(fā)現(xiàn)噬菌體SYJ4 對(duì)痢疾志賀菌（S.dysenteriae）CMCC(B)51105 引起的雞痢疾有一定的治療效果，在灌服噬菌體11 h 后，雞糞便中的志賀氏菌數(shù)就降到喂菌前103 CFU/g 水平，與鏈霉素的效果相當(dāng)，并在控制雞腸道志賀氏菌群數(shù)量上優(yōu)于鏈霉素。Atterbury 等[51]從2004-2005年分離到的232 株沙門氏菌噬菌體中挑選了3 株具有較寬噬菌譜的噬菌體進(jìn)行了抑制雞體內(nèi)的3 種血清型沙門氏菌（Salmonella enterica serotypesEnteritidis,Hadar,and Typhimurium）的試驗(yàn)，結(jié)果顯示3 株噬菌體可有效地清除雞體內(nèi)的沙門氏菌（Salmonella enterica serotypesEnteritidis,Hadar,and Typhimurium），試驗(yàn)同時(shí)提示選擇合適的噬菌體、優(yōu)化給藥時(shí)機(jī)和給藥方式是獲得抑菌效果的關(guān)鍵因素。李躍等[52]在患乳腺炎的奶牛中分離得到金黃色葡萄球菌4P-1，并利用4P-1 建立小鼠乳腺炎模型。通過(guò)灌乳的方式用噬菌體2Y-10 對(duì)該模型進(jìn)行了治療，結(jié)果表明噬菌體可以使乳腺組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著下降，緩解乳腺組織病變，有效地降低炎癥反應(yīng)。

3.3 噬菌體對(duì)耐藥菌株的抑菌作用研究

噬菌體對(duì)于耐藥菌株同樣擁有有效的殺菌作用。閆李俠等[53]以SPF 級(jí)昆明小鼠建立小鼠感染泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌的模型，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組使用噬菌體AB46 治療，對(duì)照組給同等體積的肉湯治療。結(jié)果顯示：泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌1∶10稀釋試驗(yàn)組與對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；1∶2、1∶5 稀釋組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；1∶50 稀釋的試驗(yàn)組與對(duì)照組均無(wú)小鼠死亡，脾菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果P=0.026，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。證明，噬菌體可有效地治療泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌重癥感染的小鼠，明顯提高小鼠的生存率，在感染較輕的情況下則可以明顯降低小鼠的脾菌數(shù)。Biswas 等[54]利用噬菌體對(duì)耐萬(wàn)古霉素腸球菌（ancomycin—resistant enterococci，VRE）進(jìn)行治療試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給試驗(yàn)小鼠腹腔注射109CFU VRE 48 h后，小鼠全部死亡；但當(dāng)在感染后，僅給小鼠一次性注射3x108PFU 噬菌體即可100%存活；即使當(dāng)感染發(fā)生24 h 后，小鼠瀕臨死亡，噬菌體治療也可獲得50%的生存率。

3.4 噬菌體的制劑研究

目前研究噬菌體制劑的方向主要包括全菌噬菌體制劑、遺傳學(xué)改造的噬菌體制劑和噬菌體裂解酶制劑等。

全菌噬菌體制劑包括單一噬菌體制劑和雞尾酒制劑。由于噬菌體的高宿主特異性，單一的噬菌體制劑在臨床應(yīng)用上有很大的局限性，將具有不同噬菌譜的多種噬菌體制成混合制劑，稱為雞尾酒，且因其具有廣譜性、可降低耐受細(xì)菌出現(xiàn)的頻率，是全菌噬菌體制劑的主要研究方向[43]。2006年，美國(guó)FDA 批準(zhǔn)了首個(gè)噬菌體雞尾酒制劑ListexTMP100(Micreos 公司生產(chǎn))，用作食品添加劑[55]。

遺傳學(xué)改造的噬菌體制劑是旨在通過(guò)分子生物學(xué)的手段，對(duì)噬菌體的基因進(jìn)行編輯，以期能改變或擴(kuò)展噬菌體的宿主譜，延緩免疫系統(tǒng)對(duì)噬菌體的清除速度，減少內(nèi)毒素的釋放以及增強(qiáng)抗生素的療效，使其能更有效地應(yīng)用于臨床治療[56]。

噬菌體裂解酶制劑中的裂解酶是噬菌體編碼的產(chǎn)物，噬菌體通過(guò)裂解酶裂解宿主細(xì)胞完成殺菌作用。裂解酶主要作用于宿主的細(xì)胞壁，按作用于細(xì)胞壁肽聚糖共價(jià)鍵位點(diǎn)的不同，可將噬菌體裂解酶分為葡糖苷酶、酰胺酶、內(nèi)肽酶和轉(zhuǎn)糖基酶。裂解酶制劑具有特異性、高效性、較高的穩(wěn)定性、安全性以及潛在的廣譜殺菌性能，在特異性殺死宿主菌的同時(shí)，不易產(chǎn)生耐藥性[57]。

3.5 噬菌體替代抗生素存在的問題與展望

噬菌體在替代抗生素的應(yīng)用研究中存在的主要問題：噬菌體的安全性評(píng)價(jià)。噬菌體作為一種細(xì)菌病毒，其病毒的本質(zhì)是其作為治療藥物的障礙，噬菌體是否能感染機(jī)體正常細(xì)胞，免疫系統(tǒng)對(duì)噬菌體的應(yīng)答反應(yīng)，噬菌體在裂解宿主菌時(shí)是否會(huì)釋放大量?jī)?nèi)毒素和釋放的內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的影響，是否會(huì)導(dǎo)致內(nèi)毒血癥等疑慮一直存在，雖然目前已開始有大量安全性評(píng)價(jià)研究[45]，但其在制成制劑應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)上的安全性仍需進(jìn)一步研究；噬菌體的選擇：噬菌體的高特異性是優(yōu)點(diǎn)也是缺點(diǎn)，作為替代抗生素的制劑，相對(duì)于抗生素的廣譜抗菌性，其噬菌譜較窄，單一噬菌體制劑難以起到很好的效果，噬菌體雞尾酒制劑雖然在一定程度上可以解決這個(gè)問題，但是雞尾酒制劑仍需及時(shí)更新和進(jìn)行不同的組合[43]，其離應(yīng)用于大規(guī)模養(yǎng)殖業(yè)的路還有很長(zhǎng)距離；噬菌體制劑給藥劑量、給藥方式和給藥時(shí)間的把握是噬菌體治療效果的關(guān)鍵因素[49,51]，給養(yǎng)殖業(yè)具體操作者構(gòu)成了使用障礙；噬菌體的抗性問題：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單一培養(yǎng)的菌株可在數(shù)小時(shí)或數(shù)天內(nèi)發(fā)展產(chǎn)生噬菌體抗性[58]。面對(duì)上述問題，未來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)噬菌體遺傳物質(zhì)的研究，如基因改造等以及噬菌體殺菌機(jī)制的研究等方面將是未來(lái)研究的重要方向[59]。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著耐藥細(xì)菌的不斷發(fā)現(xiàn)，甚至是“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)，人類對(duì)于抗生素使用量的控制會(huì)越來(lái)越嚴(yán)格，落實(shí)到養(yǎng)殖業(yè)上，抗生素作為促生長(zhǎng)劑和預(yù)防疾病用藥的時(shí)代必將過(guò)去。在此形勢(shì)下，涌現(xiàn)出了包括微生態(tài)制劑、中草藥制劑、噬菌體制劑等抗生素替代物，其各有優(yōu)點(diǎn)，但完全替代抗生素還存在很多問題，需要各國(guó)科學(xué)工作者進(jìn)一步研究。