許靖，張舒，肖中，王海濤，蔡峰

(上海市第七人民醫(yī)院 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200137)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和肺癌是吸煙人群最常見的慢性呼吸道疾病。近年來，我國COPD和肺癌的年發(fā)病率居高不下，目前COPD患者已達9 990萬，20歲以上人群COPD的患病率達8.6%，2008—2018年，40歲以上人群COPD的患病率增長了67%，40歲以上人群COPD發(fā)病率已達10%；預(yù)計到2020年，COPD可能成為全球死亡的第三大原因[1]。研究表明，全世界每年新發(fā)肺癌約135萬例，肺癌占所有惡性腫瘤的12%，自2008年起居惡性腫瘤發(fā)病率的首位，居男性惡性腫瘤的第一位，女性惡性腫瘤第二位[2]。近年來，肺癌每年死亡人數(shù)超過100萬，雖然靶向藥物和免疫治療已應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，但肺癌的發(fā)病率和病死率仍較高；且COPD患者肺癌的發(fā)病率明顯升高，50%～80%的肺癌患者有明確的COPD病史[3]。目前COPD患者并發(fā)肺癌的機制尚不清楚。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，染色體位點15q25、4q31和6q31在有吸煙史肺癌及COPD患者的疾病篩查中顯著重復(fù)[4-6]?？梢?，在染色體位點15q25、4q31和6q31編碼的基因可能是肺癌和COPD共發(fā)生的候選基因，染色體位點15q25編碼的煙堿型乙酰膽堿受體基因、染色體位點4q31編碼的Hedgehog相互作用蛋白(Hedgehog-interacting protein，HHIP)和血型糖蛋白A基因是研究較多的與COPD患者肺癌相關(guān)的候選基因[7]。其中，HHIP基因作為Hedgehog(Hh)信號通路的關(guān)鍵調(diào)解因子成為COPD并發(fā)肺癌關(guān)系的研究熱點?，F(xiàn)就HHIP基因與COPD患者并發(fā)肺癌關(guān)系的研究進展予以綜述。

1 Hh信號通路及HHIP基因的生理作用

Hh信號通路是多種臟器生長發(fā)育的重要信號通路。對果蠅胚胎Hh信號通路的研究表明，Hh信號通路參與了胃腸道、肺等多個臟器的組織發(fā)生及損傷后修復(fù)等病理生理過程[8]。Hh信號通路在胚胎期果蠅胃腸道、肺組織均明顯表達；對于內(nèi)胚層來源的組織，Hh信號通路在相關(guān)組織發(fā)育及分化過程中起關(guān)鍵作用。研究證實，哺乳動物的Hh信號通路由分泌性蛋白Hh因子3種Shh配體(Shh、Dhh、Ihh)、2個跨膜受體[含12個跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白受體Ptch(patched)以及Smo(Smoothen，含1個7次跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于G蛋白偶聯(lián)受體FZ SMO超家族成員)]和3個轉(zhuǎn)錄因子(Glil、Gli2、Gli3和下游的靶基因)組成[9]。當(dāng)Hh蛋白低表達或沉默時，膜蛋白受體Ptch抑制Smo，此時Gli-3與SuFu在細胞質(zhì)內(nèi)形成復(fù)合物，同時SuFu促進Gli-3水解，從而抑制Gli-l和Ptch的Hh信號通路中目的基因的表達。當(dāng)Hh蛋白與Ptch結(jié)合時，Ptch對Smo的抑制作用被解除，并經(jīng)過一系列反應(yīng)引發(fā)下游事件[10-11]，因此Gli-1表達被認(rèn)為是Hh信號通路激活的標(biāo)志。

Hh蛋白激活HHIP基因的表達，進而反饋抑制Hh信號通路的活性。激活的HHIP基因生成相應(yīng)HHIP蛋白，與Hh信號通路中分泌性蛋白因子Hh因子結(jié)合，導(dǎo)致Hh因子無法與Rtch結(jié)合并失活[12]。此負反饋調(diào)節(jié)機制是組織正常發(fā)育所必需，如哺乳動物肺組織發(fā)育過程中，通過Hh信號通路反饋激活HHIP蛋白，HHIP蛋白與Shh蛋白結(jié)合可抑制Hh信號通路的活化，當(dāng)Hh信號通路表達受到抑制，成纖維細胞生長因子及Wnt等信號通路出現(xiàn)表達，進一步誘導(dǎo)肺芽形成[13]。動物實驗表明，HHIP基因干擾小鼠支氣管分支和肺泡上皮分化出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變和肺組織發(fā)育不全；敲除HHIP基因小鼠的Hh信號通路持續(xù)活化，小鼠出生后因肺發(fā)育不全導(dǎo)致呼吸窘迫而死亡[14]。

2 COPD患者發(fā)生肺癌的關(guān)鍵分子學(xué)機制

Hh信號通路持續(xù)異常活化可能是COPD患者發(fā)生肺癌的關(guān)鍵分子學(xué)機制。COPD患者往往存在吸煙史，甚至是長期吸煙史。COPD患者吸煙過程中所產(chǎn)生的尼古丁等多種有害物質(zhì)可通過局部炎癥反應(yīng)破壞呼吸道上皮的防御機制，進而損傷呼吸道上皮，導(dǎo)致Hh信號通路再次被激活。有學(xué)者認(rèn)為，Hh信號通路再激活與尼古丁等有害物質(zhì)對氣道上皮產(chǎn)生損傷的免疫應(yīng)答相關(guān)[15]。激活的Hh信號通路通過調(diào)控呼吸道上皮干細胞及祖細胞的定向分化使再生的肺間質(zhì)細胞分化為平滑肌細胞和呼吸道上皮細胞，促進呼吸道受損上皮的完整修復(fù)[16-17]。和胚胎發(fā)育期一樣，Hh信號通路可被其激活的HHIP基因表達產(chǎn)物負反饋調(diào)控，若HHIP基因異常表達下調(diào)，可能導(dǎo)致Hh信號通路負反饋機制異常，使上述分化過程失調(diào)，導(dǎo)致呼吸道上皮細胞分化缺陷，從而進一步加重氣道重構(gòu)及肺泡結(jié)構(gòu)破壞。研究發(fā)現(xiàn)，HHIP基因下調(diào)小鼠出生后，其小腸上皮呈泛平滑肌化[18]。小氣道泛平滑肌化可能影響氣道平滑肌的厚度，可在一定程度上引起氣流受限，進而導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)塌陷引起肺通氣功能障礙。Zhou等[19]對COPD患者肺組織與正常肺功能吸煙者肺組織中的HHIP基因表達水平進行研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者肺組織信使RNA(messenger RNA,mRNA)和蛋白的表達水平均較后者顯著降低。

若Hh信號通路持續(xù)處于激活狀態(tài)，將出現(xiàn)Shh、Glil及Gli2過度表達，細胞增殖紊亂進一步加重，甚至可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[20]。上皮細胞中再激活的Hh信號通路需要HHIP基因的負反饋抑制。Hh信號通路的異常持續(xù)活化及HHIP表達下調(diào)與包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤相關(guān)，約1/3的人類腫瘤需要Hh信號通路的活化來維持腫瘤細胞的生存活性[20]。研究表明，肺癌患者手術(shù)切除組織可檢測到Hh信號通路中Shh和Glil的異常高表達[21]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中HHIP基因出現(xiàn)不同程度的表達下調(diào)，提示無論何種原因引起的HHIP基因反饋抑制Hh信號通路活化功能缺失均可導(dǎo)致Hh信號通路持續(xù)活化，這可能是肺癌細胞不斷增殖、生長的主要原因之一[20]。Shh抗體可阻斷Hh信號通路的持續(xù)活化，抑制腫瘤細胞生長，促進其凋亡[22]。研究發(fā)現(xiàn)，HHIP基因在肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等癌組織中均有不同程度的表達下調(diào)或沉默，故推測HHIP基因表達下調(diào)進而負反饋抑制Hh信號通路持續(xù)活化是導(dǎo)致COPD患者肺癌發(fā)生的重要分子學(xué)基礎(chǔ)之一[23]。

3 COPD患者HHIP基因表達下調(diào)的可能原因

多種原因可導(dǎo)致COPD患者HHIP基因表達下調(diào)，如HHIP基因本身轉(zhuǎn)錄減少、HHIP基因中增強轉(zhuǎn)錄活性的蛋白下調(diào)、抑制HHIP基因作用的蛋白增加，若涉及表觀遺傳學(xué)則可能與HHIP基因啟動子附近甲基化增加，或基因附近組蛋白的甲基化乙?；淖?，或外源物質(zhì)在基因或啟動子區(qū)與結(jié)合抑制蛋白結(jié)合等有關(guān)。

3.1HHIP基因的單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism，SNP)變化 SNP是指個體基因組內(nèi)某一特定核苷酸位置序列上單個堿基的轉(zhuǎn)換、顛倒等現(xiàn)象，可導(dǎo)致COPD患者HHIP基因表達下調(diào)，引發(fā)肺癌。研究發(fā)現(xiàn)，約20%的COPD患者罹患肺癌[3]。目前，尚無研究證實COPD患者的HHIP基因存在重大突變。不同遺傳學(xué)背景COPD患者的肺癌發(fā)生風(fēng)險存在差異，而SNP是影響疾病發(fā)生發(fā)展的最常見的個體遺傳學(xué)因素之一。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)，6p21.1、9p21.3和12q13.13的SNP位點rs7741164、rs72658409和rs11610143與亞洲非吸煙女性肺癌易感性相關(guān)。

有研究表明，HHIP基因位點rs1489759與COPD患者發(fā)生肺癌的關(guān)系密切[25]。但不同種族人群的遺傳背景存在較大差異，因此對不同種族人群的相關(guān)重復(fù)研究具有重要意義。一項對1 017例中國漢族COPD患者的研究顯示，HHIP基因多態(tài)性位點rs768942純合子基因型的COPD患者發(fā)生肺癌的風(fēng)險顯著降低，而歐美COPD患者內(nèi)含子位點rs1489759在漢族人群的研究中卻未見與肺癌發(fā)生有關(guān)聯(lián)性[26]。

內(nèi)含子含有核仁小RNA和微RNA等多種非編碼RNA，還有參與基因轉(zhuǎn)錄、mRNA加工和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)等表達的調(diào)控元件[27-30]。多種疾病的發(fā)生、發(fā)展與內(nèi)含子突變密切相關(guān)，如突變發(fā)生在內(nèi)含子與外顯子交界(即GU或AG)，則有可能導(dǎo)致內(nèi)含子剪切異常，進而導(dǎo)致外顯子的缺失或突變，從而引起相關(guān)疾病[31-32]。發(fā)生于內(nèi)含子中間序列的突變可能通過激活隱性剪切位點影響外顯子的剪切，導(dǎo)致疾病。研究表明，細胞色素P450 IA2基因的高誘導(dǎo)性及靶向性與該基因第1個內(nèi)含子中的C/A多態(tài)性密切相關(guān)[33]。真核生物mRNA內(nèi)含子對基因表達的調(diào)控不僅發(fā)生在前體RNA的剪接階段，還可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、RNA編輯、mRNA出核運輸、mRNA翻譯和無義衰變等過程中[34-35]。另有研究表明，對于本身不含內(nèi)含子或不需要內(nèi)含子參與表達的基因，若其mRNA內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)含子，則轉(zhuǎn)基因生物的基因表達效率明顯提高[36-37]。目前，對于HHIP基因SNP與COPD患者肺癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)性尚缺乏細胞學(xué)研究的進一步論證。

3.2HHIP基因DNA啟動子區(qū)的異常高甲基化 COPD患者HHIP基因DNA啟動子區(qū)的異常高甲基化導(dǎo)致其表達下調(diào)或沉默。有研究表明，與癌旁組織相比，合并COPD史的非小細胞肺癌患者腫瘤組織中HHIP基因啟動子區(qū)呈現(xiàn)顯著高甲基化；此外，患者腫瘤組織中HHIP基因表達顯著低于癌旁組織，Hh信號通路異常活化，提示COPD并發(fā)非小細胞肺癌患者HHIP基因啟動子區(qū)的高甲基化可導(dǎo)致HHIP基因表達下調(diào)或沉默，進而導(dǎo)致Hh信號通路的異?；罨?，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[21]。DNA甲基化是基因表觀遺傳學(xué)修飾的重要方式之一，其指在DNA甲基化酶的作用下，胞嘧啶(C)5位碳原子上加入一甲基基團而成為5-甲基胞嘧啶(5-mC)的過程。在哺乳類生物基因組中，存在5%～10%的CpG島，其中70%～80%是mCpG，CpG二核苷酸的聚集稱為CpG島，主要位于異染色質(zhì)區(qū)，呈高度甲基化，基因組中約50%的基因調(diào)控區(qū)存在CpG島[38-39]。在胃腸道腫瘤中，HHIP基因啟動子區(qū)也呈明顯高甲基化，且Hh信號通路異?；罨?。在各種惡性腫瘤中，多種抑癌基因(Rb、VH-L、p16、p15等)啟動子區(qū)呈明顯高甲基化狀態(tài)，且表達下調(diào)甚至沉默。將以上抑癌基因去甲基化，其表達恢復(fù)，并可導(dǎo)致惡性腫瘤的表型逆轉(zhuǎn)。正常細胞導(dǎo)入外源性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因后可出現(xiàn)惡性腫瘤傾向[40-41]。但目前尚缺乏對肺癌細胞細胞層面HHIP甲基化的相關(guān)研究，仍有待進一步研究。

4 HHIP基因與COPD患者并發(fā)肺癌關(guān)系的相關(guān)研究

目前，缺乏HHIP基因與COPD患者并發(fā)肺癌相關(guān)的確切依據(jù)，在非小細胞肺癌的相關(guān)研究中，關(guān)于 HHIP基因及Hh信號通路與肺癌關(guān)系的研究結(jié)果仍存在矛盾。Watkins等[42]的研究表明，非小細胞肺癌組織中Hh信號通路的激活僅占非小細胞肺癌腫瘤組織及細胞系的10%左右，在多個非小細胞肺癌細胞系中均未檢測到Hh信號通路的異?；罨hi等[43]的研究發(fā)現(xiàn)，僅不到10%的非小細胞肺癌組織存在Hh信號通路的異?；罨?。Savani等[44]對42例非小細胞肺癌患者肺癌組織Hh信號通路因子Shh、Ptch1、Glil、Smo表達情況的研究發(fā)現(xiàn)，Shh、Ptch1、Glil和Smo在非小細胞肺癌組織中呈陰性或弱陽性表達，甚至較正常肺支氣管組織上皮細胞中的表達更少。故認(rèn)為Hh信號通路的致肺癌作用遠遠小于其在正常肺上皮組織生長發(fā)育中的作用。但Hh信號通路在非小細胞肺癌組織中存在異?；罨?，且較普遍。Yuan等[45]研究顯示，Hh信號通路在非小細胞肺癌組織及其細胞系中均高度激活，有些肺癌細胞系對Hh抑制劑的敏感性較低，可能與Hh信號通路過度激活導(dǎo)致Hh抑制劑無法發(fā)揮作用有關(guān)；進一步采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)GL1水平發(fā)現(xiàn)，使用Hh抑制劑即可顯著抑制Hh信號通路的活化及腫瘤細胞的生長。Gialmanidis等[46]的研究亦顯示，大多數(shù)非小細胞肺癌存在Hh信號通路的激活。可見，肺癌患者存在Hh信號通路的異常活化。

5 小 結(jié)

COPD并發(fā)肺癌患者存在HHIP基因表達下調(diào)及異?；罨腍h信號通路，但具體機制尚不清楚，可能與HHIP基因內(nèi)含子的SNP變化及表觀遺傳學(xué)異常有關(guān)。HHIP基因及Hh信號通路在肺癌組織及細胞的研究結(jié)果仍存在矛盾，不同肺癌細胞系的研究結(jié)果仍有爭議。目前國內(nèi)外對HHIP基因的研究主要集中于胃癌及胰腺癌等消化道腫瘤，對其在肺癌發(fā)生發(fā)展中作用機制的研究較少，仍需要進一步研究。