馬東飛 侯文清 徐春華 趙春雨 馬建兵 黃星榞 賈棋 馬璐 劉聰 李明 陸穎 ?

1) (中國(guó)科學(xué)院物理研究所, 北京凝聚態(tài)物理國(guó)家研究中心, 軟物質(zhì)物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190)

2) (中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 中國(guó)科學(xué)院生物與化學(xué)交叉研究中心, 上海 200032)

3) (中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

a?突觸核蛋白(a?synuclein, a?syn)在帕金森病的發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵的作用, 因而近年來(lái)受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注.a?syn在膜上的動(dòng)力學(xué)過(guò)程對(duì)理解其功能至關(guān)重要.本文使用基于脂質(zhì)體的單分子熒光衰減方法—LipoFRET, 首次對(duì)較高濃度下a?syn與磷脂膜的相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行了單分子層面上的研究.研究發(fā)現(xiàn), 在溶液中a?syn濃度升高時(shí), 其中央NAC區(qū)域可離開(kāi)磷脂膜表面進(jìn)入水相中; 而N端部分位于膜表面內(nèi)的位置變淺, 并有更高的概率脫離膜表面進(jìn)入溶液中.利用單分子熒光成像對(duì)a?syn解離的觀察則發(fā)現(xiàn),隨著溶液中的a?syn濃度升高, 脂質(zhì)體上的a?syn解離速率加快.因此高濃度下, a?syn在膜上各區(qū)域垂直位置變化促進(jìn)了蛋白從膜上的解離.結(jié)合LipoFRET的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷, a?syn的解離可能是由于不同的a?syn分子膜作用位點(diǎn)互相競(jìng)爭(zhēng)而導(dǎo)致的解離.這樣的特征, 可能是體內(nèi)環(huán)境中影響a?syn控制其聚集的重要性質(zhì).

1 引 言

a?突觸核蛋白 (a?synuclein, a?syn)是存在于神經(jīng)系統(tǒng)突觸前末梢與核周的一種可溶性蛋白.a?syn的研究近年來(lái)備受關(guān)注[1?4], 它與神經(jīng)退行性疾病存在密切的關(guān)聯(lián), 是帕金森病患者腦部病理性特征路易小體的主要組成部分[5,6], 其生理功能到目前為止仍不明確.但有研究者認(rèn)為a?syn與神經(jīng)可塑性及突觸囊泡的釋放有關(guān)[2,7].

a?syn由140個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成, 其N端1?95殘基在磷脂膜的存在下容易形成兩親性的a?螺旋,因而是該蛋白與膜相互作用的主要位置.而C端(96?140)在生理?xiàng)l件下則攜帶大量的負(fù)電荷, 一般認(rèn)為此區(qū)域不與磷脂膜相互作用而游離在水相中[8,9].a?syn的C端被認(rèn)為是其結(jié)合金屬離子與其他配體的重要區(qū)域[10,11].在蛋白的中央(61?95殘基)是蛋白的NAC區(qū)域, 該區(qū)域與a?syn的聚集行為密切相關(guān)[7,12].在水溶液中, a?syn是舒展的無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)[13], 結(jié)合至膜上之后, N端則形成富含a?螺旋的結(jié)構(gòu)[14].關(guān)于a?syn在膜上的構(gòu)象, 有研究者認(rèn)為, a?syn以37?45殘基為分界, 在膜上形成中央斷開(kāi)的兩段螺旋結(jié)構(gòu)[8]; 也有研究者認(rèn)為a?syn的1?95殘基在膜上形成一整段較長(zhǎng)的a?螺旋[9].進(jìn)一步的研究指出, 這兩種構(gòu)象在脂質(zhì)體上均存在, 而其比例可能受到膜曲率的影響[15].a?syn與含有負(fù)電荷的磷脂雙層膜(如含有PA, PS, PG等)具有較強(qiáng)的相互作用[16,17].

關(guān)于a?syn與磷脂膜作用的細(xì)節(jié), 此前已有一些研究, 一般是利用中子反射、色氨酸熒光的重原子淬滅等方法進(jìn)行.一種觀點(diǎn)認(rèn)為a?syn的N端螺旋插入磷脂膜內(nèi)0.9—1.4 nm處[18], 或是距離磷脂雙分子層中心0.9—1.1 nm[19]; 也有研究者得出了a?syn僅位于磷脂膜頭部的結(jié)論[20].然而這些結(jié)果均是采用系綜與時(shí)間平均的方法得出的, 并未反映a?syn在膜當(dāng)中的動(dòng)態(tài)過(guò)程.此前, 本課題組開(kāi)發(fā)了LipoFRET方法, 在單分子層面對(duì)a?syn與膜的相互作用進(jìn)行了研究[21], 結(jié)果表明, a?syn T72位點(diǎn)附近的區(qū)域處于膜表面附近.而K10位點(diǎn)附近的區(qū)域可深入膜中, 并且在幾個(gè)不同深度之間做緩慢的運(yùn)動(dòng).

到目前為止, 有一些研究指出, a?syn可形成寡聚體并對(duì)膜產(chǎn)生破壞[1,22?24], 或者磷脂膜的存在有可能起到降低聚集的濃度閾值(可低至nM級(jí)別)的作用[25].這有可能是導(dǎo)致帕金森病發(fā)生的重要因素.但尚未有文獻(xiàn)報(bào)道在寡聚濃度條件下的a?syn與膜, 以及寡聚過(guò)程啟動(dòng)初期a?syn分子之間相互作用的單分子水平上的動(dòng)態(tài)細(xì)節(jié).而單分子熒光方法在研究生物大分子的動(dòng)態(tài)過(guò)程中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[26,27].為了探究一定濃度下a?syn在磷脂膜上的行為與單分子濃度水平上的區(qū)別, 本文采用了一種基于脂質(zhì)體的單分子熒光衰減方法—LipoFRET, 以及單分子熒光成像的方法研究了溶液中存在較高濃度的a?syn時(shí), 其與磷脂膜之間相互作用的變化.結(jié)果表明, 在濃度50 nM (1 M =1 mol/L)的 a?syn存在時(shí), a?syn的 NAC區(qū)域可從膜表面位置脫離并進(jìn)入溶液中, 而N端第一螺旋位于膜內(nèi)的概率減小且深度變淺, 并有較大的概率脫離膜表面進(jìn)入溶液中.這種變化促進(jìn)了a?syn從膜上的解離.我們認(rèn)為高濃度的情況下a?syn之間對(duì)磷脂膜結(jié)合區(qū)域的競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)是導(dǎo)致高濃度促進(jìn)a?syn從膜上的解離的原因.

2 實(shí)驗(yàn)材料、原理與方法

2.1 LipoFRET方法的原理

LipoFRET是單個(gè)熒光供體對(duì)包封在脂質(zhì)體中的多個(gè)淬滅劑分子(作為熒光受體)的共振能量轉(zhuǎn)移[21].在同一時(shí)刻, 供體對(duì)任意一個(gè)受體均有發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的概率, 其速率與各自距供體的距離有關(guān).最終的能量轉(zhuǎn)移總速率是所有能量轉(zhuǎn)移速率的總和[21,28,29], 可以寫(xiě)成

其中, kt為總的能量轉(zhuǎn)移速率; τD為熒光供體在無(wú)受體情況下的熒光壽命; r0i為供體對(duì)第i個(gè)受體分子的F?rster特征距離, 對(duì)于單一組分的淬滅劑而言, (1)式中的r0i均為相同的值r0; ri為供體與第i個(gè)受體分子的空間距離.于是, 能量傳遞效率ET可寫(xiě)為

供體的相對(duì)亮度由F/F0= 1 — ET決定, 其中F為供體在有淬滅劑存在時(shí)的亮度, F0為供體在無(wú)淬滅劑時(shí)的亮度.

對(duì)于膜蛋白來(lái)說(shuō), 其熒光標(biāo)記位點(diǎn)距離膜外表面越近, 或在膜中的位置越深, 標(biāo)記在膜蛋白上的熒光基團(tuán)距離淬滅劑越近, 能量轉(zhuǎn)移效率越高, 熒光基團(tuán)的相對(duì)亮度F/F0越低.LipoFRET就是利用對(duì)熒光基團(tuán)亮度的測(cè)量來(lái)監(jiān)測(cè)膜蛋白特定位置的垂直運(yùn)動(dòng)的(圖1(a)).

實(shí)驗(yàn)中, 采用臺(tái)盼藍(lán)作為淬滅劑, 其與a?syn上標(biāo)記的熒光Alexa Fluor 555 (Alexa 555)之間的相對(duì)亮度與Alexa 555到脂質(zhì)體磷脂膜內(nèi)表面上的距離之間的關(guān)系如圖1(b)所示.

2.2 LipoFRET的實(shí)驗(yàn)步驟

LipoFRET實(shí)驗(yàn)包括制備包封臺(tái)盼藍(lán)的脂質(zhì)體以及熒光觀測(cè)兩部分.

1) 脂質(zhì)體的制備過(guò)程

圖1 LipoFRET方法 (a) LipoFRET的實(shí)驗(yàn)體系示意圖;(b) LipoFRET的距離?相對(duì)亮度曲線, 其中淬滅劑為臺(tái)盼藍(lán), 所用的熒光分子為Alexa Fluor 555 (Alexa 555), 距離是指熒光基團(tuán)到脂質(zhì)體磷脂雙層膜的內(nèi)表面的距離, 曲線分別對(duì)應(yīng)包封2.5 mM (上方曲線)及5 mM (下方曲線)臺(tái)盼藍(lán)的脂質(zhì)體.Fig.1.The LipoFRET method：(a) The schematic picture of LipoFRET experiment; (b) the relationship between dis?tance from the inner surface of the liposome lipid bilayer and relative intensity F/F0.The quencher used here is tryp?an blue and the fluorophore is Alexa Fluor 555 (Alexa 555).The curves correspond to liposomes encapsulating 2.5 mM(above) and 5 mM (bottom) trypan blue.

首先, 將所用磷脂以2 mg/mL的濃度溶解在玻璃瓶中的氯仿與甲醇的混合液當(dāng)中并振蕩均勻,其中氯仿與甲醇的總體積比為2∶1.本文中所用的脂質(zhì)體磷脂組分為70% DOPC, 30% DOPA, 0.1%的 16∶0 Biotinyl?cap PE (質(zhì)量百分比).接著, 將玻璃瓶敞口放置于真空干燥器中, 抽真空過(guò)夜以抽干溶劑.此時(shí), 磷脂應(yīng)在瓶壁上形成一薄層.然后,以每毫升0.5—1 mg磷脂的比例, 在瓶中加入5 mM(或2.5 mM)臺(tái)盼藍(lán)溶液, 并將玻璃瓶封好在搖床上振蕩1 h.此時(shí)瓶中磷脂形成了大小不均一的脂質(zhì)體懸浮液.隨后, 將液體轉(zhuǎn)移至塑料的小離心管中, 放入液氮中將液體速凍, 接著轉(zhuǎn)移至37 ℃的水浴中解凍, 反復(fù)凍融5個(gè)循環(huán), 再使用擠出器(Extruder, 購(gòu)于Avanti Polar Lipids)將溶液來(lái)回?cái)D壓通過(guò)孔徑為100 nm的聚碳酸脂膜.收集制備好的脂質(zhì)體.接下來(lái), 使用填料為Sephadex G?25的脫鹽柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾, 將脂質(zhì)體從未包封的臺(tái)盼藍(lán)中分離出來(lái); 或?qū)⑷芤合♂?0倍后, 采用規(guī)格為100 kD的超濾離心管反復(fù)進(jìn)行超濾, 控制轉(zhuǎn)速與離心時(shí)間, 每次留下約一半的液體, 并采用緩沖液補(bǔ)充至原體積, 直到將未包封的臺(tái)盼藍(lán)稀釋至較低水平.

在制備包封臺(tái)盼藍(lán)的脂質(zhì)體的同時(shí), 應(yīng)制備包封實(shí)驗(yàn)用緩沖液(10 mM PBS, pH = 7.4, 0.9%NaCl)的脂質(zhì)體, 用于測(cè)定F0的值.

2) LipoFRET熒光觀測(cè)的步驟

制作可供進(jìn)液與排液、適合裝載在全內(nèi)反射熒光顯微鏡上的樣品腔室.其中朝向鏡頭的蓋玻片厚度為0.17 mm.蓋玻片朝向腔室內(nèi)部的一面預(yù)先修飾mPEG以防止實(shí)驗(yàn)中蛋白的非特異性吸附, 同時(shí)亦修飾Biotin?PEG以供脂質(zhì)體向玻片表面的連接.

實(shí)驗(yàn)裝置采用以全內(nèi)反射熒光顯微鏡和EMCCD為基礎(chǔ)的雙通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移觀測(cè)裝置[30?32], 但需要將全內(nèi)反射場(chǎng)的角度調(diào)整為“贗全內(nèi)反射 (Pseudo?TIRF)[33]”的程度, 以避免光強(qiáng)在脂質(zhì)體直徑尺度內(nèi)的衰減而帶來(lái)上下光強(qiáng)不一致的情況.使用ImageJ等軟件記錄及分析光強(qiáng)數(shù)據(jù).

實(shí)驗(yàn)中, 首先向腔室中注入緩沖液以潤(rùn)洗玻片表面.接著, 注入濃度為0.01 mg/mL的Streptavidin溶液, 待其反應(yīng)5—10 min后, 沖去多余的Strepta?vidin.將包封有臺(tái)盼藍(lán)的脂質(zhì)體稀釋注入腔室, 反應(yīng)約2 min, 再注入一些脂質(zhì)體以補(bǔ)充反應(yīng)消耗.進(jìn)而, 向腔室中注入標(biāo)記Alexa 555的a?syn (a?syn T72C?Alexa 555 或 a?syn K10C?Alexa 555, a?syn的氨基酸序列見(jiàn)表1), 待視野中Alexa 555發(fā)出的熒光點(diǎn)數(shù)量合適, 則以50 ms/幀的曝光時(shí)間對(duì)視野進(jìn)行錄像, 以記錄a?syn在低濃度下的單體行為.記錄足夠的數(shù)據(jù)后, 向腔室中注入50 nM未標(biāo)記熒光的 a?syn (wt?a?syn), 以提高 a?syn 的總濃度, 并繼續(xù)錄像以記錄脂質(zhì)體上的標(biāo)記Alexa 555的a?syn在總濃度較高的情況下的行為.包封臺(tái)盼藍(lán)的脂質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)完成后, 立即進(jìn)行包封緩沖液的脂質(zhì)體的實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)步驟與前述相同, 以記錄和測(cè)定F0的值.由于LipoFRET實(shí)驗(yàn)中關(guān)心的是相對(duì)亮度F/F0的值, 因此在同一樣品的同組實(shí)驗(yàn)當(dāng)中,需要保證包封緩沖液及臺(tái)盼藍(lán)的脂質(zhì)體上測(cè)試的實(shí)驗(yàn)條件完全一致.

表1 a?syn的氨基酸序列Table 1.Sequences of a?syn.

使用圖1(b)中的亮度?距離曲線將分析獲得的熒光亮度轉(zhuǎn)換為距離信息.如果使用不同的熒光分子與淬滅劑的組合來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 可根據(jù)該熒光分子的光譜、量子效率等參數(shù), 參照參考文獻(xiàn)[21]中的計(jì)算方法計(jì)算相應(yīng)的亮度?距離曲線以用于熒光亮度與距離數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換.

2.3 a-syn解離過(guò)程的研究

為了研究a?syn解離速率與溶液中蛋白濃度的關(guān)系, 首先將脂質(zhì)體連接在蓋玻片表面上, 接著加入 0.1 nM a?syn T72C?Alexa 555, 待視野中的熒光點(diǎn)密度足夠多(200—500個(gè)為宜), 則關(guān)閉激光, 并加入一定濃度的wt?a?syn替換原溶液.電荷耦合器件CCD的曝光時(shí)間為50 ms/幀, 總時(shí)長(zhǎng)為5 s.期間打開(kāi)激光, 以低光強(qiáng)(強(qiáng)度可將視野中的單個(gè)分子的熒光點(diǎn)從背景分辨出來(lái)即可)照射約1 s即關(guān)閉, 此操作降低了光漂白導(dǎo)致的熒光點(diǎn)數(shù)量減少的效應(yīng).每隔一定的時(shí)間重復(fù)錄像?開(kāi)關(guān)激光的步驟, 這樣就記錄了同一視野中熒光點(diǎn)隨時(shí)間的變化.最后, 使用ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析, 統(tǒng)計(jì)每個(gè)錄像中熒光點(diǎn)的個(gè)數(shù), 即得出熒光點(diǎn)個(gè)數(shù)隨著時(shí)間的變化趨勢(shì).

3 結(jié)果與討論

3.1 a-syn中央NAC區(qū)域膜相互作用在高濃度下的變化

為研究較高濃度下a?syn與磷脂膜的相互作用特征, 用LipoFRET方法, 對(duì)溶液中存在一定濃度的a?syn時(shí)熒光標(biāo)記的a?syn在磷脂膜上的動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行探究.

首先關(guān)注的是a?syn T72位點(diǎn).該位點(diǎn)位于蛋白第二螺旋中的NAC區(qū)域.NAC區(qū)域連接了a?syn的N端與C端, 且此區(qū)域在體外有聚集的特性, 因而被認(rèn)為是介導(dǎo)聚集的關(guān)鍵區(qū)域[7].亦即是說(shuō), 該區(qū)域是高濃度下參與a?syn多體相互作用的可能區(qū)域.在實(shí)驗(yàn)中, 首先將包封5 mM臺(tái)盼藍(lán)的脂質(zhì)體連接在玻片表面上.接著, 將0.1 nM a?syn T72C?Alexa 555加入樣品腔室.待視野中的熒光點(diǎn)密度足夠后, 進(jìn)行錄像, 以記錄樣品在濃度較低時(shí)與磷脂膜相互作用的特征.在記錄足夠數(shù)據(jù)之后,再在其中加入50 nM的未標(biāo)記熒光的a?synuclein(wt?a?syn), 繼續(xù)進(jìn)行錄像, 以記錄單個(gè) a?syn T72C?Alexa 555在蛋白總濃度較高時(shí)的行為特征.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

在實(shí)驗(yàn)中, 發(fā)現(xiàn)在蛋白總濃度較低(0.1 nM)時(shí), 亮度曲線仍呈現(xiàn)較為平穩(wěn)的狀態(tài), 其相對(duì)亮度的值為 0.65 ± 0.07 (中心值 ± 半峰寬, 下同).膜的厚度約4.5 nm[34], 此結(jié)果確認(rèn)了T72位點(diǎn)位于脂質(zhì)體磷脂膜的表面附近.而當(dāng)加入50 nM的wt?a?syn之后, 部分熒光亮度有所增強(qiáng), 并且亮度曲線出現(xiàn)了明顯的上下起伏(圖2(a)和圖2(d)).對(duì)亮度曲線中較明顯狀態(tài)的亮度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì), 以確定亮度狀態(tài)的存在與分布.結(jié)果顯示, 在較高濃度的a?syn 存在時(shí), a?syn T72C?Alexa 555 的亮度呈現(xiàn)兩個(gè)峰的分布(圖2(b)).亮度較低峰的中心值與低濃度下的a?syn亮度基本一致, 為F/F0= 0.63 ±0.06; 而亮度較高峰的為 F/F0= 0.83 ± 0.09, 對(duì)照?qǐng)D1(b)中的曲線, 其中心值對(duì)應(yīng)于膜外2.1 nm的位置.這顯示a?syn濃度較高時(shí), 一部分蛋白的NAC中央?yún)^(qū)域脫離膜表面, 進(jìn)入了溶液中(圖2(c)),且可在膜表面和溶液中的狀態(tài)之間互相轉(zhuǎn)換.

接著, 對(duì)a?syn K10位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行研究.K10位點(diǎn)所在的N端第一螺旋是a?syn與膜相互作用較強(qiáng)的區(qū)域.第一螺旋較第二螺旋多出3個(gè)凈的正電荷, 并含有更高比例的疏水殘基側(cè)鏈.此前的報(bào)道中揭示了單個(gè)a?syn分子K10位點(diǎn)在膜中有較明顯的動(dòng)態(tài)過(guò)程[21], 在這里探索較高濃度a?syn下, K10位點(diǎn)與膜的相互作用.由于該位點(diǎn)在膜中位置較深, 為避免熒光信號(hào)過(guò)弱, 采用2.5 mM臺(tái)盼藍(lán)包封于脂質(zhì)體中對(duì)其進(jìn)行研究.

圖2 溶液中存在低蛋白濃度或高蛋白濃度時(shí), a?syn T72C?Alexa 555在包封5 mM臺(tái)盼藍(lán)的脂質(zhì)體上的動(dòng)態(tài)特征 (a)蛋白總濃度為0.1 nM (上圖)與50 nM (下圖)時(shí)的典型亮度曲線(其中灰色曲線與綠色曲線分別為包封緩沖液脂質(zhì)體與包封臺(tái)盼藍(lán)脂質(zhì)體上的相對(duì)亮度曲線(F/F0)); (b)蛋白總濃度為0.1 nM (上圖)與50 nM (下圖)時(shí)的亮度統(tǒng)計(jì)(誤差線代表統(tǒng)計(jì)偏差); (c)低濃度(上部)與高濃度(下部)時(shí), 在磷脂膜上的位置特征示意圖; (d)蛋白總濃度為50 nM時(shí)更多的典型亮度曲線Fig.2.Dynamic of a?syn T72C?Alexa 555 on liposome encapsulating 5 mM trypan blue in the presence of low and high protein con?centration in solution：(a) Typical intensity traces of a?syn T72C?Alexa 555 under 0.1 nM (upper panel) or 50 nM wt?a?syn (lower panel) in solution (the grey and green line correspond to the intensity traces on liposomes entrapping buffer (F0) and on liposomes entrapping trypan blue (F), respectively); (b) the intensity histograms of the states under 0.1 nM (upper panel) or 50 nM wt?a?syn(lower panel) in solution (the error bars on the histograms represent the statistical error in the bins); (c) the scheme of the position change of a?syn T72 on the membrane with increased protein concentration in the solution; (d) more intensity traces of a?syn T72C?Alexa 555 in the presence of 50 nM wt?a?syn in solution.

圖3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在蛋白總濃度較高時(shí),a?syn N端在膜中的動(dòng)態(tài)過(guò)程也會(huì)有所變化.在腔室中的蛋白濃度為0.1 nM時(shí), 觀察到3個(gè)主要的狀態(tài), 其亮度為 F/F0= 0.47 ± 0.08, 0.68 ± 0.06,以及0.83 ± 0.05, 分別對(duì)應(yīng)膜以內(nèi)3.6 nm, 1.4 nm,以及膜表面附近的位置(圖3(a)和圖3(b)).而當(dāng)在溶液中增加了50 nM的wt?a?syn之后, N端的動(dòng)態(tài)過(guò)程發(fā)生了變化.從典型的亮度曲線(圖3(d))來(lái)看, K10位點(diǎn)有更大概率跳變到更高亮度的位置.而從亮度統(tǒng)計(jì)來(lái)看, 較高濃度的a?syn存在時(shí), 仍然有3個(gè)峰的位置, 前兩個(gè)峰與低濃度的情況相比, 中心位置向更亮處移動(dòng), 分別為F/F0= 0.54 ± 0.07,0.71 ± 0.06.這兩個(gè)峰對(duì)應(yīng)膜以內(nèi)2.9, 1.1 nm的位置.亮度最高的峰為F/F0= 0.86 ± 0.06, 其中心對(duì)應(yīng)膜以外0.9 nm的位置.相比于低濃度下的情況, 除了位置更高之外, 最高亮度的峰所占比例明顯升高, 而亮度較低的峰所占比例明顯降低.這提示增加了a?syn的溶液中濃度之后, K10位點(diǎn)所在的第一螺旋更傾向于處在溶液中略高于膜表面的位置(圖3(c)).從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看, 溶液中更高濃度的a?syn的加入, 一方面促使T72位點(diǎn)脫離膜表面進(jìn)入溶液中, 另一方面使K10位點(diǎn)傾向于從膜內(nèi)切換至更淺甚至較膜表面更高的位置, 結(jié)果表明, a?syn溶液中濃度的升高很有可能帶來(lái)單個(gè)蛋白與膜相互作用的減弱.

為了探究高濃度下a?syn的存在所導(dǎo)致的微觀層面蛋白與膜相互作用的變化是否會(huì)對(duì)a?syn在膜上的解離性質(zhì)有所影響, 用不含臺(tái)盼藍(lán)的脂質(zhì)體做了a?syn在DOPC/DOPA膜上的解離測(cè)試, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.從圖4可以看出, 加入wt?a?syn后, 隨著時(shí)間的推移, 原本結(jié)合于脂質(zhì)體上的 a?syn T72C?Alexa 555 逐漸減少.并且, 溶液中a?syn的濃度越高, 熒光點(diǎn)減少的速度越快.此過(guò)程表明熒光標(biāo)記的a?syn從脂質(zhì)體上逐漸解離.這種現(xiàn)象與一般的結(jié)合?解離過(guò)程不同.一般而言, 生物大分子從作用位點(diǎn)上解離由一個(gè)解離常數(shù)決定, 這個(gè)解離常數(shù)通常是一個(gè)恒定的值, 不隨溶液中生物大分子濃度的變化而變化.而a?syn的解離則明顯地受濃度調(diào)控, 該現(xiàn)象在以往關(guān)于a?syn的文獻(xiàn)中并未報(bào)道過(guò).溶液中的a?syn使得已經(jīng)結(jié)合在膜上的蛋白更容易從膜上脫落, 因此,LipoFRET得到的高濃度狀態(tài)下a?syn在膜上垂直位置的變化, 確實(shí)導(dǎo)致a?syn與磷脂膜相互作用的減弱, 促進(jìn)了a?syn的解離.

圖3 包封2.5 mM臺(tái)盼藍(lán)的脂質(zhì)體上的a?syn K10C?Alexa 555在溶液中存在低濃度與高濃度wt?50 nM wt?a?syn時(shí)的動(dòng)態(tài)特征(a)蛋白總濃度為0.1 nM (上圖)與50 nM (下圖)時(shí)的典型亮度曲線(其中灰色曲線與深藍(lán)色曲線分別為包封緩沖液脂質(zhì)體與包封臺(tái)盼藍(lán)脂質(zhì)體上的相對(duì)亮度曲線(F/F0)); (b)蛋白總濃度為0.1 nM (上圖)與50 nM (下圖)時(shí)的亮度統(tǒng)計(jì)(誤差線代表統(tǒng)計(jì)偏差); (c)蛋白低濃度(上部)與高濃度(下部)時(shí), 在磷脂膜上的位置特征示意圖; (d)蛋白總濃度為50 nM時(shí)更多的典型亮度曲線Fig.3.Dynamic of a?syn K10C?Alexa 555 on liposome encapsulating 2.5 mM trypan blue in the presence of low and high protein concentration in solution：(a) Typical intensity traces of a?syn K10 C?Alexa 555 under 0.1 nM (upper panel) or 50 nM wt?a?syn(lower panel) in solution (the grey and dark blue line correspond to the intensity traces on liposomes entrapping buffer (F0) and on liposomes entrapping trypan blue (F), respectively); (b) the intensity histograms of the states under 0.1 nM (upper panel) or 50 nM wt?a?syn (lower panel) in solution (the error bars on the histograms represent the statistical error in the bins); (c) the scheme of the position change of a?syn K10 on the membrane with increased protein concentration in the solution; (d) more intensity traces in the presence of 50 nM wt?a?syn in solution.

根據(jù)在實(shí)驗(yàn)中從微觀與宏觀層面得到的結(jié)果,溶液中存在高濃度的a?syn時(shí), 應(yīng)當(dāng)存在一個(gè)包含多個(gè)蛋白與磷脂膜形成復(fù)合物的過(guò)程(圖5).對(duì)于低濃度下的單個(gè)a?syn來(lái)說(shuō), K10位點(diǎn)有較大概率深入磷脂膜的較深處, 而T72位點(diǎn)基本穩(wěn)定在磷脂膜的表面上.當(dāng)溶液中的a?syn濃度較高時(shí), 兩個(gè)a?syn有一定的概率充分靠近, 從而發(fā)生一個(gè)a?syn K10位點(diǎn)所在的第一螺旋占據(jù)另外一個(gè)a?syn的T72位點(diǎn)所在的第二螺旋與膜作用區(qū)域的情況.此時(shí), 作用位點(diǎn)被占據(jù)的a?syn第二螺旋與膜的作用減弱, 有一定概率離開(kāi)磷脂膜的表面.此變化導(dǎo)致同一蛋白的第一螺旋切換至膜的淺表位置.此時(shí), a?syn與磷脂膜的相互作用很不穩(wěn)定, 當(dāng)?shù)谝宦菪c第二螺旋同時(shí)處于膜外時(shí), 最終使得其與膜的作用位點(diǎn)容易從膜上脫落下來(lái), 從而導(dǎo)致了宏觀上溶液中蛋白濃度升高反而促進(jìn)蛋白從膜上解離的現(xiàn)象.需要注意的是, 蛋白之間互相占據(jù)膜作用位點(diǎn)的情況是有可能發(fā)生的, 因?yàn)閍?syn的第一螺旋帶有3個(gè)正的凈電荷, 而C端帶有12個(gè)凈的負(fù)電荷.其靜電作用可能傾向于使a?syn的第一螺旋從另外一個(gè)a?syn的第二螺旋方向靠近并促使替代過(guò)程發(fā)生.該過(guò)程與Kamar等[35]揭示的轉(zhuǎn)錄因子從DNA上解離的動(dòng)力學(xué)過(guò)程具有類似的機(jī)理, 因?yàn)閺奈⒂^上看, a?syn與磷脂膜之間同樣涉及兩個(gè)a?螺旋導(dǎo)致的多位點(diǎn)相互作用.

圖4 溶 液 中 含 有 1 nM, 10 nM, 100 nM 的 wt?a?syn 時(shí),視野中脂質(zhì)體上的a?syn T72C?Alexa 555數(shù)量相對(duì)于原始數(shù)量的比值隨時(shí)間變化趨勢(shì)(誤差線代表統(tǒng)計(jì)偏差)Fig.4.Fraction of the remaining fluorescence spots of a?syn T72C?Alexa 555 on the liposomes versus time.The solution contains 1 nM, 10 nM, or 100 nM wt?a?syn.The error bars on the histograms represent the statistical error in the bins.

圖5 溶液中高濃度的a?syn促進(jìn)標(biāo)記Alexa 555的a?syn從膜上解離的過(guò)程模型Fig.5.Model corresponding to the dissociation of a?syn from the membrane which was promoted by increased pro?tein concentration.

綜上所述, 實(shí)驗(yàn)揭示了a?syn在高濃度下的行為.溶液中高濃度的a?syn使T72位點(diǎn)從膜上解離至溶液中, 而K10位點(diǎn)從膜內(nèi)轉(zhuǎn)移至膜表面甚至溶液中, 從而在宏觀上促進(jìn)了a?syn從磷脂膜上的解離.這與一些研究中的a?syn寡聚體在膜上聚集的結(jié)果并不一致, 因?yàn)槿绻鸻?syn更易于從膜上解離, 其導(dǎo)致的結(jié)果是在膜上的聚集體更難以形成.但是, 按照LipoFRET實(shí)驗(yàn)的時(shí)間尺度(僅關(guān)注了單分子水平上a?syn在與膜相互作用后短時(shí)間內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化), 可以認(rèn)為a?syn在磷脂膜存在下的聚集是一個(gè)包含解離與成核競(jìng)爭(zhēng)的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過(guò)程, 這也解釋了一些研究中a?syn聚集體的生成至少需要數(shù)小時(shí)的時(shí)間尺度的原因[22].高濃度的a?syn促進(jìn)其自身從磷脂膜上解離的性質(zhì), 很可能是a?syn在體內(nèi)調(diào)控其聚集過(guò)程的重要方式, 因?yàn)楦邼舛认耡?syn從膜上解離的速率更快則限制了聚集體大小的增長(zhǎng)速率.帕金森病的致病機(jī)理有可能和a?syn的解離與聚集性質(zhì)的失調(diào)有關(guān).另外,此前文獻(xiàn)[36]報(bào)道了a?syn與膜作用的不同位點(diǎn)分別連接兩個(gè)脂質(zhì)體、介導(dǎo)脂質(zhì)體之間聚集的模型假設(shè).此研究中a?syn的狀態(tài)與本文中LipoFRET得出的高濃度下a?syn在膜上的狀態(tài)較為吻合.該現(xiàn)象的發(fā)生與一定濃度下a?syn發(fā)生部分位點(diǎn)從脂質(zhì)體膜上解離從而與另一個(gè)脂質(zhì)體發(fā)生相互作用有關(guān), 即使該相互作用可能是瞬態(tài)的.從另一方面來(lái)看, 蛋白濃度是調(diào)節(jié)a?syn與膜的相互作用的重要參數(shù).在低濃度時(shí), 存在的是較長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)相互作用; 而高濃度時(shí), 則主要為瞬態(tài)的相互作用.在解讀和比較研究a?syn與膜相互作用的不同研究結(jié)果時(shí), 蛋白濃度應(yīng)作為重要影響因素被納入考慮.

4 結(jié) 論

本文使用LipoFRET方法研究了在溶液中存在較高濃度的a?syn的情況下, 磷脂膜上的單個(gè)a?syn與膜作用的細(xì)節(jié)變化.LipoFRET方法可以在單分子水平上實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)膜蛋白單個(gè)位點(diǎn)處標(biāo)記的熒光基團(tuán)在垂直于膜方向上的距離變化,從而為研究膜蛋白的動(dòng)力學(xué)過(guò)程提供重要的實(shí)時(shí)定量信息.

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 當(dāng)溶液中a?syn的濃度提高時(shí), 磷脂膜上的a?syn T72位點(diǎn)所在的NAC附近區(qū)域可從磷脂膜上解離至溶液中.而K10位點(diǎn)附近區(qū)域處在膜中的概率減小, 深度變淺, 并有很大概率脫離膜表面進(jìn)入溶液中.這提示在此情況下a?syn與磷脂膜的相互作用可能會(huì)減弱.進(jìn)一步地,采用單分子熒光成像的方法對(duì)a?syn與脂質(zhì)體的解離過(guò)程進(jìn)行了研究.結(jié)果表明, a?syn從脂質(zhì)體上的解離速率確實(shí)隨著溶液中蛋白濃度的提高而加快, 這與LipoFRET的單分子實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是自洽的.針對(duì)這樣的現(xiàn)象, 本文提出了a?syn蛋白濃度升高導(dǎo)致膜上的a?syn與膜的作用位點(diǎn)互相競(jìng)爭(zhēng), 進(jìn)而導(dǎo)致a?syn的膜作用位點(diǎn)從膜上解離, 并最終導(dǎo)致a?syn與磷脂膜的相互作用減弱從而從膜上解離的模型.a?syn濃度調(diào)控解離的性質(zhì)是調(diào)節(jié)其在膜上寡聚過(guò)程的重要一環(huán), 該寡聚過(guò)程很可能涉及聚集與解離的競(jìng)爭(zhēng).

此外, 本文的結(jié)果也證明了LipoFRET方法在探測(cè)膜蛋白動(dòng)力學(xué)過(guò)程中的適用性.期待將來(lái)在膜蛋白功能與結(jié)構(gòu)的研究中, LipoFRET能得到更廣泛的應(yīng)用.