雷雨廣 徐繼鵬 陳超 張偉麗

(1信陽市第二人民醫(yī)院病理科，河南 信陽 464000；信陽職業(yè)技術學院 2護理學院；3附屬醫(yī)院皮膚科)

星形膠質細胞屬于腦組織中的一種膠質細胞，通過分泌激素、營養(yǎng)因子參與神經元生長及凋亡等生物學過程，可調控中樞神經系統(tǒng)等疾病的發(fā)生及發(fā)展過程〔1〕。研究顯示，腦組織中氧化應激反應?？蓪е履X組織損傷〔2〕。因而探究星形膠質細胞氧化應激損傷機制對減少細胞凋亡具有重要意義。兔脊髓缺血再灌注損傷模型蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)A3呈高表達，與脊髓缺血再灌注損傷密切相關〔3〕。PDIA3可作為一種保護蛋白調控神經退行性病變過程，還可通過減少氧化和內質網應激降低缺血誘導的損傷〔4,5〕。然而，相關研究顯示，甲型流感病毒可引發(fā)內質網氧化應激反應并上調PDIA3表達，下調PDIA3表達可通過抑制凋亡蛋白表達進而抑制上皮細胞凋亡〔6〕。目前關于PDIA3表達變化對星形膠質細胞損傷的影響尚未見報道，本研究通過雙向調控PDIA3表達探討PDIA3表達變化對過氧化氫(H2O2)誘導的星形膠質細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司；二甲基亞砜(DMSO)購自上海生物工程有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自上海艾研生物科技有限公司；RNA提取及實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)實驗所需試劑均購自日本TaKaRa公司；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自上海齊一生物科技有限公司；PDIA3 siRNA(si-PDIA3)、陰性對照(si-NC)及pcDNA過表達載體均購自美國Invitrogen公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；白細胞介素(IL)-6檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠PDIA3與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗均購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗人磷酸化(p)-p38與p38抗體均購自美國CST公司。

1.2星形膠質細胞培養(yǎng) 參照李清等〔7〕研究報道培養(yǎng)星形膠質細胞，麻醉出生2～3 d無特定病原體(SPF)級雄性小鼠，取出T11～L6處脊髓背角組織，加入胰蛋白酶消化，放入溫度37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，30 min后取出細胞懸液接種于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內，8 d后置于搖床震蕩15 h，以5×106個/ml細胞接種于24孔細胞板(包被多聚賴氨酸)中進行傳代培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)3～7 d后待星形膠質細胞純度達98%左右時收集細胞進行后續(xù)研究。

1.3構建PDIA3干擾及過表達載體穩(wěn)定株系 收集星形膠質細胞，胰蛋白酶消化后接種于6孔板(5×103個細胞/ml)，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞生長融合至80%更換為不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書分別將si-con、si-PDIA3、pcDNA 及pcDNA-PDIA3轉染入星形膠質細胞，轉染6 h后更換含有10%胎牛血清新鮮的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用qRT-PCR與Western印跡檢測驗證轉染效率，構建轉染穩(wěn)定株系。

1.4H2O2誘導星形膠質細胞損傷模型及分組 選取對數(shù)生長期星形膠質細胞，分為對照組(NC組)與H2O2組，其中NC組不進行任何處理；H2O2組中在星形膠質細胞中加入100 μmol/L H2O2制備氧化損傷模型〔8〕。收集轉染后12 h星形膠質細胞，加入濃度為100 μmol/L的H2O2作用24 h，實驗將星形膠質細胞分為NC組、H2O2組、H2O2+si-con組、H2O2+si-PDIA3組、H2O2+pcDNA組、H2O2+pcDNA-PDIA3組，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進行檢測。

1.5qRT-PCR檢測PDIA3 mRNA表達 利用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒合成cDNA，嚴格按照qRT-PCR檢測試劑盒配置反應體系，反應條件為95℃ 10 min循環(huán)1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。PDIA3 以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算PDIA3 mRNA相對表達量。

1.6Western印跡檢測PDIA3及p38MAPK信號通路蛋白表達 收集“1.2.3”中各組星形膠質細胞，加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液提取總蛋白，利用二喹啉甲酸(BCA)法檢測樣品濃度，取50 μg蛋白樣品分別與上樣緩沖液混合，經10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應(80 V 30 min，120 V 2 h)，將蛋白凝膠轉移至硝酸纖維素膜，2 h后用脫脂奶粉封閉60 min，加入稀釋比為1∶1 000的PDIA3、p38及p-p38蛋白一抗，再把膜放入IgG二抗(1∶5 000)中反應，室溫放置2 h，TBST清洗3次，10 min/次，采用電化學發(fā)光(ECL)進行顯影反應，置于凝膠成像系統(tǒng)分析，利用Quantity One軟件分析蛋白條帶積分光密度值，蛋白相對表達量為目的蛋白條帶積分光密度值與GAPDH內參條帶積分光密度值的比值。

1.7檢測星形膠質細胞活力 分別取各組星形膠質細胞，以細胞密度為5×104/L接種于96孔細胞培養(yǎng)板(120 μl/孔)，放入37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后分別加入濃度為5 g/L的MTT溶液(20 μl)，4 h后棄培養(yǎng)基，分別加入DMSO 150 μl，置于搖床內10 min，放入酶標儀檢測各孔在波長為490 nm處光密度值，細胞存活率(%)=(實驗組細胞光密度值/正常組細胞光密度值)×100%。培養(yǎng)48 h后收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測LDH含量，LDH釋放率(%)=細胞培養(yǎng)基內酶活力單位/(細胞裂解液測定酶活力單位+細胞培養(yǎng)基內酶活力單位)×100%〔9〕。

1.8檢測上清液中TNF-α、IL-6濃度 采用放射免疫法檢測各組細胞培養(yǎng)基上清液中TNF-α、IL-6水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.9流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組星形膠質細胞接種于6孔細胞板，胰酶消化制備細胞懸液，置于離心機，1 000 r/min離心15 min，分別加入1 ml結合緩沖液懸浮細胞(5×104/L)，按照試劑盒說明書分別加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)與5 μl碘化丙啶(PI)，室溫避光孵育20 min，置于流式細胞儀檢測并計算細胞凋亡率。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 實 驗

2.1H2O2對星形膠質細胞PDIA3表達的影響 H2O2組星形膠質細胞中PDIA3 mRNA和蛋白相對表達量顯著高于NC組(P<0.05)，見圖1、表1。

2.2PDIA3干擾或過表達載體構建 與si-con組相比，si-PDIA組PDIA3 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-PDIA3組PDIA3 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖2，表2。表明PDIA3干擾或過表達載體構建成功，可用于后續(xù)實驗。

圖1 兩組星形膠質細胞PDIA3蛋白表達

表1 兩組星形膠質細胞PDIA3 mRNA和蛋白表達

與NC組比較:1)P<0.05

1～4: si-con組，si-PDIA3組，pcDNA組，pcDNA-PDIA3組圖2 4組星形膠質細胞PDIA3蛋白表達

表2 4組星形膠質細胞PDIA3 mRNA和蛋白表達

與si-con組比較:1)P<0.05；與pcDNA組比較:2)P<0.05

2.3PDIA3干擾或過表達對H2O2誘導的星形膠質細胞損傷的影響 H2O2組星形膠質細胞培養(yǎng)液中LDH釋放量顯著高于NC組(P<0.05)，星形膠質細胞存活率顯著低于NC組(P<0.05)，表明H2O2可加重星形膠質細胞損傷，減少星形膠質細胞存活。與H2O2+si-con組比較，H2O2+si-PDIA3組LDH釋放量明顯增加，星形膠質細胞存活率明顯降低(P<0.05)。與H2O2+pcDNA組比較，H2O2+pcDNA-PDIA3組LDH釋放量明顯減少，星形膠質細胞存活率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。表明PDIA3過表達可有效減少星形膠質細胞LDH釋放量并提高細胞存活率，抑制PDIA3表達作用效果則相反。

2.4PDIA3干擾或過表達對H2O2誘導的星形膠質細胞炎癥因子分泌的影響 與NC組相比，H2O2組星形膠質細胞TNF-α、IL-6水平均明顯上升(P<0.05)，表明H2O2可促進星形膠質細胞發(fā)生炎癥反應。與H2O2+si-con組相比，H2O2+si-PDIA3組星形膠質細胞中TNF-α、IL-6水平均顯著升高(P<0.05)；與H2O2+pcDNA組相比，H2O2+pcDNA-PDIA3組TNF-α、IL-6水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。表明PDIA3可能通過抑制H2O2誘導的星形膠質細胞炎癥反應進而發(fā)揮保護作用。

2.5PDIA3干擾或過表達對H2O2誘導的星形膠質細胞凋亡的影響 H2O2組星形膠質細胞凋亡率顯著高于NC組(P<0.05)。H2O2+si-PDIA3組星形膠質細胞凋亡率顯著高于H2O2+si-con組(P<0.05)；H2O2+pcDNA-PDIA3組星形膠質細胞凋亡率顯著低于H2O2+pcDNA組(P<0.05)，見表3、圖3。表明PDIA3過表達可抑制H2O2誘導的星形膠質細胞凋亡。

2.6PDIA3干擾或過表達對星形膠質細胞p38MAPK信號通路的影響 H2O2組星形膠質細胞中p-p38蛋白表達明顯高于NC組(P<0.05)，表明H2O2可能激活p38MAPK信號通路。H2O2+si-PDIA3組星形膠質細胞中p-p38蛋白表達明顯高于H2O2+si-con組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。H2O2+pcDNA-PDIA3組星形膠質細胞中p-p38蛋白表達顯著低于H2O2+pcDNA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組星形膠質細胞中p38表達水平相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3、圖4。表明PDIA3過表達可能通過抑制p38MAPK信號通路活化進而發(fā)揮作用。

表3 各組LDH釋放量、細胞存活率、IFN-α、IL-6、p-38、p-p38及細胞凋亡率比較

與NC組比較：1)P<0.05；與H2O2+si-con組比較:2)P<0.05；與H2O2+pcDNA組比較：3)P<0.05

圖3 各組星形膠質細胞凋亡率

1～6：NC組，H2O2組，H2O2+si-con組，H2O2+si-PDIA3組，H2O2+pcDNA組，H2O2+pcDNA組-PDIA3組圖4 各組星形膠質細胞中p38和p-p38蛋白表達

3 討 論

星形膠質細胞可通過促進血腦屏障形成并調控代謝過程以保護中樞神經系統(tǒng)，并可通過修復及保護神經細胞調控神經元發(fā)育〔10〕。機體內氧化應激反應導致腦組織氧化狀態(tài)失衡而造成腦組織氧化損傷〔11〕。

PDIA3可促進蛋白質折疊并可參與乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔12〕。β-淀粉肽與PDIA3結合形成復合物從而保護神經系統(tǒng)，若PDIA3與β-淀粉肽的結合能力減弱導致神經退行性病變〔13〕。研究表明PDIA3可通過調控脂肪代謝過程進而參與非酒精性脂肪肝發(fā)生及發(fā)展過程，同時PDIA3還可通過影響體內炎癥反應調控腸易激綜合征發(fā)生過程〔14,15〕。H2O2屬于體內代謝產生的活性氧并可誘導神經細胞損傷而建立細胞氧化損傷模型〔16〕。本研究說明PDIA3可參與星形膠質細胞氧化應激損傷過程。機體內氧化應激發(fā)生時細胞膜脂質過氧化可促使細胞膜結構變化異常從而增加細胞膜通透性，細胞內LDH流出細胞至細胞膜外，檢測細胞培養(yǎng)液中LDH釋放量增加表示細胞氧化損傷〔17〕。本研究提示上調PDIA3表達可能通過抑制H2O2誘導的星形膠質氧化應激損傷而抑制細胞凋亡，增強細胞存活能力。

機體處于氧化應激狀態(tài)時p38MAPK信號通路被激活，p38MAPK可從細胞質進入細胞核并通過促進TNF-α等炎癥因子釋放而促進疾病進展，抑制星形膠質細胞分泌TNF-α、IL-6等促炎性細胞因子可降低其氧化應激反應〔18,19〕。張瑤等〔20〕研究表明，利拉魯肽可通過抑制p38MAPK信號通路激活進而改善高同型半胱氨酸誘導的大鼠海馬組織炎癥及氧化應激損傷〔20〕。汪蓮等〔21〕研究表明抑制p38MAPK信號通路激活可通過降低Caspase-1、IL-1β等表達而降低炎癥反應。本研究說明PDIA3過表達能夠抑制H2O2誘導的星形膠質細胞炎癥反應。同時本研究說明PDIA3過表達可抑制p38MAPK信號通路激活。提示PDIA3可能通過抑制p38MAPK信號通路活化而降低TNF-α、IL-6等促炎性細胞因子水平而抑制星形膠質細胞炎癥反應。

綜上，PDIA3可通過抑制p38MAPK信號通路活化而發(fā)揮抗炎性反應、抗氧化應激作用，為防治星形膠質細胞氧化應激損傷提供理論依據(jù)。