馮春鳳，王云霞，蒲曉允，熊 瑜，劉 飛 綜述，張立群△ 審校

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400037；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400038)

規(guī)則成簇間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(CRISPR/Cas)系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在進(jìn)化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫應(yīng)答系統(tǒng)，其機(jī)理是保護(hù)自身免受入侵病毒和質(zhì)粒的影響[1]。CRISPR由多個(gè)高度保守的重復(fù)序列與噬菌體或質(zhì)粒DNA存在同源性的間隔序列串聯(lián)而成[2]。CRISPR區(qū)域中，位于第一個(gè)重復(fù)序列上游的是前導(dǎo)序列，負(fù)責(zé)CRISPR序列轉(zhuǎn)錄生成CRISPR RNA(crRNA)。CRISPR位點(diǎn)附近為CRISPR相關(guān)蛋白基因Cas，Cas基因編碼的蛋白具有核酸內(nèi)切酶活性，可切割外源性DNA，是CRISPR/Cas系統(tǒng)執(zhí)行防御功能的重要組成部分。當(dāng)病毒首次入侵時(shí)，細(xì)菌將病毒小片段DNA整合到自身CRISPR基因的間隔序列中。病毒再次入侵時(shí)，CRISPR轉(zhuǎn)錄生成crRNA。在crRNA的引導(dǎo)下，具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas蛋白對(duì)含原型間隔序列毗鄰基(PAM)的靶標(biāo)序列進(jìn)行特異性識(shí)別和切割[3]。研究表明，Cas蛋白不僅可用于基因編輯，在核酸檢測(cè)方面也具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值[1]。

現(xiàn)有的核酸檢測(cè)方法大多數(shù)操作步驟復(fù)雜且依賴于昂貴的儀器設(shè)備。理想的核酸檢測(cè)技術(shù)應(yīng)具備便攜、快速、低成本、靈敏度高及特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。近期，科學(xué)家們將被譽(yù)為“基因魔剪”的CRISPR/Cas系統(tǒng)與其他技術(shù)尤其是核酸擴(kuò)增技術(shù)相聯(lián)合，開發(fā)了一系列基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)。這些技術(shù)可直接檢測(cè)經(jīng)過簡(jiǎn)單處理的臨床樣本，樣本用量極少且無(wú)需貴重儀器設(shè)備，顯示出極高的靈敏度和特異度，操作極其簡(jiǎn)便，已具有發(fā)展成為理想的核酸快速精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)的潛力。

1 CRISPR/Cas9在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

1.1CRISPR/Cas9 Cas9是Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的標(biāo)志性蛋白，在反式激活crRNA(tracrRNA)與成熟crRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)形成的雙鏈RNA(tracrRNA/crRNA)的引導(dǎo)下，特異切割靶雙鏈DNA(dsDNA)。由于tracrRNA/crRNA的設(shè)計(jì)較復(fù)雜，KONERMANN等[4]隨后將tracrRNA和crRNA整合到一條RNA鏈中，并稱之為單向?qū)NA(sgRNA)，極大地簡(jiǎn)化了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的操作步驟。Cas9介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性DNA切割依賴于sgRNA對(duì)靶序列dsDNA上的PAM序列的特異識(shí)別，不同來源的Cas9識(shí)別的PAM序列存在差異。其中，應(yīng)用最廣泛的化膿性鏈球菌Cas9核酸內(nèi)切酶切割靶標(biāo)時(shí)依賴于含5′-NGG-3′的PAM序列。當(dāng)存在與靶標(biāo)單鏈DNA(ssDNA)或單鏈RNA(ssRNA)雜交并起到PAM作用的寡核苷酸時(shí)，sgRNA/Cas9也可以裂解ssDNA和ssRNA。

1.2基于Cas9核酸內(nèi)切酶活性的核酸檢測(cè)技術(shù) 針對(duì)不同的檢測(cè)靶標(biāo)可設(shè)計(jì)與之互補(bǔ)配對(duì)的sgRNA，從而使Cas9/sgRNA復(fù)合物可特異性切割各種不同靶序列。2016年，PARDEE等[5]最先將CRISPR/Cas技術(shù)用于核酸檢測(cè)。他們將CRISPR/Cas技術(shù)與合成技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種快速、低成本檢測(cè)寨卡病毒及區(qū)分其亞型的紙質(zhì)傳感器。寨卡病毒RNA經(jīng)核酸依賴性擴(kuò)增及逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的dsDNA作為sgRNA/Cas9復(fù)合物的底物，另外設(shè)計(jì)一個(gè)分子開關(guān)作為檢測(cè)RNA的傳感器，并將這種傳感器轉(zhuǎn)移到試紙條上冷凍干燥。隨后將核酸依賴性擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的反應(yīng)產(chǎn)物滴加到試紙條上，通過觀察試紙條的顏色是否發(fā)生改變，判斷檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)用該技術(shù)可檢測(cè)不同的寨卡病毒亞種，并區(qū)分出感染后臨床癥狀相似的登革熱病毒。由于病原體存在進(jìn)化漂移，因此分子診斷技術(shù)必須具備檢測(cè)基因突變的能力。該研究證實(shí)，具有高達(dá)4-nt(11%)錯(cuò)配的變異菌株也能夠完全激活分子傳感器，表明該技術(shù)具有耐受自然界中預(yù)期遺傳變異的能力。HUANG等[6]將CRISPR/Cas9技術(shù)引入等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，開發(fā)了基于CRISPR/Cas9技術(shù)的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)。他們將CRISPR/Cas9切割ssDNA產(chǎn)生的短片段作為等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的引物，使該技術(shù)適用于長(zhǎng)鏈DNA或RNA的檢測(cè)，擴(kuò)展了等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的檢測(cè)范圍，避免了外來引物的非特異性擴(kuò)增。該方法具有較強(qiáng)特異性和檢測(cè)速度，檢測(cè)限可達(dá)0.82阿摩爾，適用于DNA、RNA和甲基化DNA等多種核酸的檢測(cè)，在生物分析和疾病診斷中具有巨大的應(yīng)用潛力。

1.3基于dCas9特異結(jié)合靶序列的核酸檢測(cè)技術(shù) dCas9是經(jīng)化學(xué)修飾的Cas9，雖然其失去核酸內(nèi)切酶活性，但仍然具有特異結(jié)合靶DNA的能力。ZHANG等[7]利用成對(duì)CRISPR/dCas9開發(fā)了一種PC核酸報(bào)告系統(tǒng)，并與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)聯(lián)合，用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌。他們將熒光素酶的N端和C端(NFluc和CFluc)分別標(biāo)記一對(duì)dCas9，當(dāng)sgRNA/NFluc-dCas9、sgRNA/CFluc-dCas9與同一靶標(biāo)結(jié)合且兩結(jié)合位點(diǎn)間距在(21±2)bp之間時(shí)，熒光素被氧化，發(fā)出熒光信號(hào)，從而檢測(cè)出病原體。隨后，QIU等[8]也開發(fā)了另一與之類似的核酸檢測(cè)技術(shù)，即RCA-CRISPR-split-HRP(RCH)系統(tǒng)。microRNA以啞鈴型探針為模板，經(jīng)滾環(huán)擴(kuò)增以后，形成大量莖環(huán)狀靶標(biāo)。兩個(gè)dCas9分別被辣根過氧化物酶(HRP)片段(sHRP-C和sHRP-N)標(biāo)記(sHR-C-dCas9和sHRP-N-dCas9)，然后與莖環(huán)狀靶標(biāo)特異性結(jié)合，導(dǎo)致裂解HRP重建，底物四甲基聯(lián)苯胺從淺黃色變?yōu)樗{(lán)色，從而實(shí)現(xiàn)microRNA的檢測(cè)。YANG等[9]，利用dCas9與靶標(biāo)dsDNA特異性結(jié)合而不切割的特點(diǎn)，將其引入固態(tài)納米孔傳感技術(shù)。當(dāng)sgRNA/dCas9復(fù)合物與靶標(biāo)結(jié)合并穿過固態(tài)納米孔時(shí)，大大減少了離子的通過，從而產(chǎn)生明顯的電流阻斷信號(hào)。HAJIAN等[10]將sgRNA/dCas9與場(chǎng)效應(yīng)晶體管相結(jié)合，開發(fā)了一種無(wú)需標(biāo)記的CRISPR芯片技術(shù)。他們將dCas9固定在場(chǎng)效應(yīng)晶體管表面，并與sgRNA形成復(fù)合物，從而特異地結(jié)合靶標(biāo)并產(chǎn)生相應(yīng)的電化學(xué)信號(hào)，該芯片在不擴(kuò)增靶標(biāo)的情況下即可達(dá)1.7 fM的靈敏度，并且在15 min內(nèi)就可讀取檢測(cè)結(jié)果。

2 CRISPR/Cas12a在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

Cas12a(又名Cpf1)屬于V型CRISPR/Cas系統(tǒng)，在crRNA的引導(dǎo)下特異識(shí)別裂解富含T核苷酸PAM序列的dsDNA或ssDNA[11-12]。2018年，CHEN等[13]發(fā)現(xiàn)毛螺旋菌科細(xì)菌(Lb)ND2006 Cas12a(LbCas12a)在crRNA的引導(dǎo)下，特異切割靶ssDNA或dsDNA后，也可非特異性誘導(dǎo)其附近非靶ssDNA的斷裂，具有與Cas13a相同的“附屬切割”活性。隨后他們將重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)(RPA)與LbCas12a偶聯(lián)，開發(fā)了DNA內(nèi)切核酸酶靶向CRISPR反式報(bào)告基因(DETECTR)核酸檢測(cè)技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)成功檢測(cè)出了人乳頭瘤病毒16型和18型。DETECTR可在1 h內(nèi)檢測(cè)出靶標(biāo)并且靈敏度可達(dá)阿摩爾級(jí)，其檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性。LI等[14]將crRNA/Cas12a與PCR相結(jié)合，開發(fā)出靈敏度、高特異性強(qiáng)的HOLMES核酸檢測(cè)系統(tǒng)，但該檢測(cè)系統(tǒng)需經(jīng)過兩步反應(yīng)。為了避免交叉污染，簡(jiǎn)化操作步驟，后來他們開發(fā)出一步式反應(yīng)。LI等[15]選取一種耐熱的Cas12b蛋白與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)一步式反應(yīng)，他們將該技術(shù)命名為第2版HOLMES(HOLMES V2)。WANG等[16]將RPA擴(kuò)增試劑和Cas12a酶放在物理上相互分開的同一試管中，在RPA反應(yīng)15 min后，Cas12a才添加到反應(yīng)系統(tǒng)中，從而實(shí)現(xiàn)一步法檢測(cè)。

上述基于CRISPR/Cas12a的核酸檢測(cè)技術(shù)均結(jié)合了各種核酸擴(kuò)增技術(shù)。最近，研究者不斷嘗試將該技術(shù)與各種傳感器相結(jié)合，試圖開發(fā)靈敏度高、特異性強(qiáng)的生物傳感技術(shù)。 SHAO等[17]將傳統(tǒng)的兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的ssDNA熒光報(bào)道分子用磁珠-ssDNA-鉑納米(PtNP)復(fù)合物取代。當(dāng)crRNA/Cas12a結(jié)合并切割靶標(biāo)時(shí)，ssDNA也被非特異性地裂解，從而釋放出PtNP。隨后將該反應(yīng)產(chǎn)物滴加到芯片上，通過PtNP催化過氧化氫產(chǎn)生的氧氣量來計(jì)算靶標(biāo)的水平。DAI等[18]將crRNA/Cas12a引入電化學(xué)傳感器，該技術(shù)對(duì)HPV-16及細(xì)小病毒B19的檢測(cè)靈敏度達(dá)皮摩爾級(jí)。此外，他們通過設(shè)計(jì)針對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的適配體，從而實(shí)現(xiàn)了基于電化學(xué)和CRISPR/Cas技術(shù)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的檢測(cè)。該技術(shù)的成功開發(fā)表明CRISPR/Cas技術(shù)不僅在檢測(cè)核酸方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，而且在蛋白檢測(cè)方面也具有應(yīng)用潛力。

3 CRISPR/Cas13a在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

Cas13a(以前稱為C2c2)屬于Ⅵ型CRISPR系統(tǒng)，對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別依賴于由A、U或C堿基組成的PFS序列(相當(dāng)于PAM序列)[19]。在crRNA的引導(dǎo)下，Cas13a特異性切割靶標(biāo)ssRNA后，表現(xiàn)出核糖核酸酶活性，可將靶標(biāo)附近的非特異性ssRNA進(jìn)行切割[20]。GOOTENBERG等[21-22]將高度特異性的crRNA/Cas13a與RPA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的酶報(bào)告解鎖(SHERLOCK)核酸檢測(cè)系統(tǒng)。該技術(shù)具有阿摩爾級(jí)的靈敏度和識(shí)別單個(gè)核苷酸錯(cuò)配的特異性，當(dāng)與T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)時(shí)，擴(kuò)增的DNA可轉(zhuǎn)錄為RNA。因此，SHERLOCK在DNA和RNA的快速檢測(cè)方面均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。為了簡(jiǎn)化操作、降低成本，隨后他們又開發(fā)了基于試紙條的SHERLOCK核酸檢測(cè)技術(shù)。通過16個(gè)患者樣品的SHERLOCK和寨卡病毒逆轉(zhuǎn)錄PCR的檢測(cè)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，兩種檢測(cè)方法的靈敏度、特異度、一致性均達(dá)100%[23]。此外，該技術(shù)已成功用于鑒定細(xì)菌病原體、耐藥基因篩查以及無(wú)細(xì)胞腫瘤DNA突變等的檢測(cè)。

SHERLOCK系統(tǒng)雖可快速、靈敏地檢測(cè)核酸分子，但仍然存在一些局限，例如缺乏定量，依賴熒光設(shè)備讀取檢測(cè)結(jié)果，一次只能檢測(cè)一種核酸等。為了突破這些局限性，他們隨后將SHERLOCK系統(tǒng)進(jìn)行了改裝，開發(fā)了更具有實(shí)用性的第2版SHERLOCK(SHERLOCK V2)核酸檢測(cè)技術(shù)。GOOTENBERG等[22]發(fā)現(xiàn)，來自不同細(xì)菌的Cas13在附屬切割時(shí)，對(duì)報(bào)告ssRNA中堿基的切割位點(diǎn)不同。他們?cè)谠鍿HERLOCK中同時(shí)引入LwaCas13a，PsmCas13b，CcaCas13b和AsCas12a 4種核酸內(nèi)切酶，設(shè)計(jì)針對(duì)4種不同靶標(biāo)的crRNA并與相應(yīng)的Cas蛋白組裝，用發(fā)出不同顏色的熒光分子分別標(biāo)記4種特異合成的報(bào)告ssDNA或ssRNA。當(dāng)檢測(cè)到靶標(biāo)時(shí)，相應(yīng)報(bào)告分子裂解，釋放對(duì)應(yīng)顏色的熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)中檢測(cè)出4種不同的靶標(biāo)。隨后他們又發(fā)現(xiàn)，在較低的引物水平下，反應(yīng)不會(huì)達(dá)到飽和。因此，可通過控制引物的水平而實(shí)現(xiàn)核酸定量檢測(cè)，且檢測(cè)物水平可低至阿摩爾級(jí)。為了擴(kuò)大SHERLOCK系統(tǒng)的輸出信號(hào)，他們又引入CRISPR Ⅲ型效應(yīng)核酸酶Csm6，該核酸酶能被環(huán)狀腺苷酸分子或末端含2′、3′-環(huán)腺苷酸的線性腺嘌呤同聚物激活[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，Cas13蛋白的附屬切割恰好可以產(chǎn)生末端含2′、3′-環(huán)腺苷酸的裂解產(chǎn)物，通過Cas13與Csm6偶聯(lián)，從而使輸出信號(hào)進(jìn)一步放大。另一方面，為了解決結(jié)果讀取依賴于儀器設(shè)備的問題，他們用FAM-生物素標(biāo)記報(bào)告基因開發(fā)了簡(jiǎn)便的檢測(cè)試紙條。試紙條進(jìn)樣端包被捕獲FAM的抗FAM抗體和金納米顆粒綴合物，在試紙條第一反應(yīng)區(qū)固定與生物素具有高親和力的鏈霉素，第二反應(yīng)區(qū)固定能捕獲FAM-抗FAM抗體復(fù)合物的物質(zhì)。如果報(bào)告基因被Cas13裂解，試紙條上可出現(xiàn)兩條肉眼可見的條帶，反之只在第一反應(yīng)區(qū)出現(xiàn)條帶。這種讀取結(jié)果的方法類似于膠體金的檢測(cè)原理，擴(kuò)展了SHERLOCK V2在缺乏醫(yī)療設(shè)備的野外或現(xiàn)場(chǎng)病原檢測(cè)中的應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，他們又開發(fā)了利用加熱和化學(xué)還原法來溶解病毒顆粒及滅活核糖核酸酶的方法—HUDSON[23]，使SHERLOCK系統(tǒng)可直接檢測(cè)臨床樣本，而無(wú)需DNA或RNA的提取和純化。QIN等[26]將crRNA/Cas13a引入微流控技術(shù)，開發(fā)了自動(dòng)化多路復(fù)用CRISPR微流控芯片，該檢測(cè)體系所需樣本量低至10 μL，檢測(cè)時(shí)間短至5 min，不經(jīng)過核酸擴(kuò)增，檢測(cè)靈敏度即可達(dá)20 pfu/mL，并可同步檢測(cè)24個(gè)樣本。

4 CRISPR/Cas14a在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

Cas14a是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的RNA引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶，由400～700個(gè)氨基酸組成，比Cas9小兩倍。與Cas12a和Cas13a相同，Cas14切割靶標(biāo)ssDNA后，也具有非特異性附屬切割活性，可用于單核苷酸突變分型(Cas14-DETECTR)[27]。與其他2類CRISPR效應(yīng)子不同的是，Cas14a-tracrRNA-crRNA可識(shí)別切割任何與之具有20 nt核苷酸互補(bǔ)的靶ssDNA而不受PAM序列的限制。由于該蛋白對(duì)種子區(qū)中間部位的堿基突變非常敏感且不需要PAM序列的激活，因此該蛋白在基因組單堿基突變檢測(cè)方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

5 CRISPR/Cas系統(tǒng)在核酸檢測(cè)中面臨的挑戰(zhàn)

CRISPR/Cas技術(shù)在核酸檢測(cè)方面已經(jīng)取得了巨大成就，在核酸快速精準(zhǔn)檢測(cè)方面具有諸多優(yōu)勢(shì)：(1)通過加熱等簡(jiǎn)單地處理包括血液、尿液、分泌物等臨床樣本，而不需要復(fù)雜的核酸提??；(2)反應(yīng)所需的試劑耐受冷凍干燥，便于存儲(chǔ)使用；(3)檢測(cè)時(shí)間短，一般2 h內(nèi)即可報(bào)告檢測(cè)結(jié)果；(4)簡(jiǎn)單便攜，不依賴于電力和昂貴的儀器；(5)結(jié)果讀取方便，通過熒光檢測(cè)或肉眼觀察即可讀取檢測(cè)結(jié)果；(6)檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，可用于單堿基突變檢測(cè)；(7)檢測(cè)范圍廣，可用于DNA、RNA、甲基化以及蛋白質(zhì)等檢測(cè)。但是，CRISPR/Cas技術(shù)在核酸檢測(cè)方面仍存在許多障礙和局限，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)sgRNA對(duì)靶位點(diǎn)的正確識(shí)別依賴于PAM序列且不同物種的CRISPR/Cas系統(tǒng)識(shí)別不同的PAM序列，雖然這種特性在某種程度上增加了該系統(tǒng)的特異性，但同時(shí)降低了靶標(biāo)的選擇范圍，增加了相應(yīng)sgRNA的設(shè)計(jì)難度。LI等[15]通過在HOLMES和HOLMES V2中使用含有PAM的引物將PAM序列引入PCR或LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物中，使HOLMES和HOLMES V2能夠以不依賴于PAM序列的方式檢測(cè)核酸。(2)由于CRISPR/Cas技術(shù)的“脫靶”效應(yīng)，可能導(dǎo)致假陰性。筆者推測(cè)，在基因庫(kù)中篩選最優(yōu)的靶標(biāo)、尋找其他來源的Cas蛋白或CRISPR系統(tǒng)的突變體可能有助于解決“脫靶”問題。隨著未來“脫靶”效應(yīng)的解決，CRISPR/Cas技術(shù)在核酸檢測(cè)中的準(zhǔn)確性必將得到更大程度地提高。(3)由于自然界中存在大量核糖核酸酶且十分穩(wěn)定，sgRNA、報(bào)告基因RNA等容易被污染而遭到破壞，導(dǎo)致錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果。(4)CRISPR/Cas技術(shù)使用針對(duì)已知堿基序列靶標(biāo)的特異性探針來檢測(cè)DNA或RNA，因此檢測(cè)新出現(xiàn)的病原體或快速突變的RNA病毒時(shí)可能面臨巨大的挑戰(zhàn)。盡管存在這些問題，但CRISPR/Cas技術(shù)依然為核酸檢測(cè)提供了強(qiáng)大的新工具和新技術(shù)。因此，進(jìn)一步研究以解決CRISPR/Cas技術(shù)的局限性將為重大疾病的病原核酸快速精準(zhǔn)檢測(cè)鋪平道路。

6 總結(jié)及展望

目前，核酸檢測(cè)一般包括病原體的分離、核酸提取與擴(kuò)增、檢測(cè)結(jié)果分析等，耗時(shí)長(zhǎng)且對(duì)醫(yī)療設(shè)備和操作人員的專業(yè)水平要求很高。便攜、快速、低成本、靈敏度高及特異性強(qiáng)的核酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)生物學(xué)研究和臨床診斷具有非常重要的意義。本文概述的幾種基于CRISPR/Cas技術(shù)的核酸檢測(cè)證明了該系統(tǒng)不僅具有強(qiáng)大的基因定點(diǎn)編輯能力，而且在分子精準(zhǔn)診斷領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。SHERLOCK V2、CRISPR微流控芯片等技術(shù)的開發(fā)表明CRISPR/Cas系統(tǒng)具有同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)的潛力。雖然單獨(dú)的CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)核酸檢測(cè)靈敏度的提升有限，大多數(shù)需要跟核酸擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，但研究者發(fā)現(xiàn)將CRISPR/Cas系統(tǒng)與生物傳感器相結(jié)合，同樣具有極高的靈敏度，并可實(shí)現(xiàn)核酸的定量檢測(cè)。該系統(tǒng)與其他核酸檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合，預(yù)示該檢測(cè)技術(shù)有望不依賴于昂貴設(shè)備和專業(yè)技術(shù)，在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。隨著不斷發(fā)現(xiàn)新的Cas蛋白，CRISPR/Cas技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)在分子水平上精確可靠的診斷病原體或鑒別突變癌基因。現(xiàn)階段，實(shí)驗(yàn)室CRISPR/Cas核酸檢測(cè)研究與復(fù)雜臨床檢測(cè)應(yīng)用環(huán)境中的有效性仍有待觀察。為了確保檢測(cè)結(jié)果可靠準(zhǔn)確，基于CRISPR/Cas的核酸檢測(cè)技術(shù)在進(jìn)入臨床應(yīng)用前還需經(jīng)過更深入的科學(xué)研究。隨著眾多科學(xué)家的不斷探索和技術(shù)上的不斷創(chuàng)新，被譽(yù)為“基因魔剪”的CRISPR/Cas技術(shù)必將成為核酸精準(zhǔn)檢測(cè)領(lǐng)域的新寵和利器。