胡 燕， 申 鴿， 李 瓊， 曾紫嫣， 朱 攀， 楊 鋼， 李 萍， 陳煜楓， 張 貞， 謝小兵

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與病理中心，湖南 長沙 410007；2.婁底市疾病預(yù)防控制中心，湖南 婁底 417000）

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起，該病毒是之前從未在人體中發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒新毒株[1-2]?！缎滦凸跔畈《靖腥痉窝自\療方案（試行第七版）》[3]將COVID-19確診標(biāo)準(zhǔn)在原有核酸檢測和測序的基礎(chǔ)上增加了血清學(xué)檢測，即“SARSCoV-2特異性IgM抗體和 IgG抗體陽性”或“SARS-CoV-2特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期升高4倍及以上”可確診。目前，SARS-CoV-2抗體的檢測方法主要有化學(xué)發(fā)光法、膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等。本研究擬對化學(xué)發(fā)光法和ELISA檢測血清SARS-CoV-2抗體的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討其在COVID-19診斷和大規(guī)模篩查中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年1—3月湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院和婁底市疾病預(yù)防控制中心COVID-19確診患者116例，其中男60例、女56例，年齡19～81歲。所有患者均符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康體檢者90名和非COVID-19住院患者（包括呼吸內(nèi)科、腫瘤科、結(jié)石科、血液病科、血透室、針灸推拿科等）256例作為非COVID-19組，其中男205例、女141例，年齡3～83歲。2個(gè)組之間年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬均知情同意。

1.2 入選及排除標(biāo)準(zhǔn)

COVID-19患者均有明確的流行病學(xué)接觸史及COVID-19臨床癥狀和/或肺部影像學(xué)特征，且呼吸道樣本或糞便樣本SARS-CoV-2核酸陽性。非COVID-19 組所有患者呼吸道樣本SARSCoV-2核酸陰性，沒有流行病學(xué)接觸史，且均沒有COVID-19臨床癥狀和肺部影像學(xué)特征。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 由護(hù)士在三級(jí)防護(hù)下采集COVID-19患者確診后1～7 d內(nèi)的空腹靜脈血5 mL，嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)操作流程密封轉(zhuǎn)運(yùn)至湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科。由護(hù)士采用真空采血管采集所有非COVID-19患者空腹靜脈血5 mL，密封轉(zhuǎn)運(yùn)至湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科。所有樣本均經(jīng)1 200×g離心5 min，分離血清。

1.2.2 化學(xué)發(fā)光法檢測血清SARS-CoV-2抗體 采用iFlash3000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司）及配套試劑（化學(xué)發(fā)光法）檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體?；驹恚翰捎没谥苯踊瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)的兩步間接免疫法。樣本中的SARS-CoV-2 IgM或IgG抗體與樣本處理液中包被SARS-CoV-2抗原的磁珠結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，然后用清洗液洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再加入吖啶酯標(biāo)記的鼠抗人IgM抗體，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物，清洗后加入預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液，測定相對發(fā)光強(qiáng)度（relative light unit，RLU）。樣本中的SARS-CoV-2 IgM或IgG抗體水平與RLU呈正相關(guān)。儀器根據(jù)RLU及內(nèi)置校準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算出IgM或IgG抗體水平，以≥10.0 AU/mL為陽性。

1.2.3 ELISA檢測血清SARS-CoV-2抗體 SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體ELISA試劑盒購自珠海麗珠試劑股份有限公司。檢測儀器為ECAN200-8全自動(dòng)酶免分析儀（瑞士帝肯公司）。基本原理：SARS-CoV-2 IgM 抗體采用捕獲法檢測。以抗人IgM μ鏈（包被二抗）包被微孔板，加入樣本，如樣本中存在IgM抗體，則會(huì)形成抗體-包被二抗復(fù)合物，洗滌后加入酶標(biāo)記的重組SARS-CoV-2抗原（酶標(biāo)抗原），形成酶標(biāo)抗原-待測抗體-包被二抗復(fù)合物，洗滌后加入底物緩沖液和底物液，顯色并終止反應(yīng)。SARSCoV-2 IgG抗體采用間接法檢測。以重組SARSCoV-2抗原（包被抗原）包被微孔板，加入樣本，如樣本中存在IgG抗體（待測抗體），則會(huì)形成待測抗體-包被抗原復(fù)合物。洗滌加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體（酶標(biāo)二抗），形成酶標(biāo)二抗-待測抗體-包被抗原復(fù)合物。洗滌后加入底物緩沖液和底物液，顯色并終止反應(yīng)。SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體均以樣本吸光度（A）值≥Cut-off值為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)發(fā)光法和ELISA檢測血清SARS-CoV-2 IgG抗體性能比較

在116例COVID-19患者中，化學(xué)發(fā)光法檢出105例，敏感性為90.52%；ELISA檢出74例，敏感性為63.79%。在346例非COVID-19者中，化學(xué)發(fā)光法檢出342例，特異性為98.84%；ELISA檢出334例，特異性為96.53%?；瘜W(xué)發(fā)光法和ELISA的陽性預(yù)測值分別為96.33%、86.05%，陰性預(yù)測值分別為96.66%、88.83%，準(zhǔn)確性分別為96.75%、88.31%。化學(xué)發(fā)光法檢測SARS-CoV-2 IgG抗體的敏感性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確性優(yōu)于ELISA（P＜0.05），而特異性2種方法之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 化學(xué)發(fā)光法和ELISA檢測血清 SARS-CoV-2 IgM抗體性能比較

在116例COVID-19患者中，化學(xué)發(fā)光法檢出88例，敏感性為75.86%；ELISA檢出68例，敏感性為58.62%。在346例非COVID-19者中，化學(xué)發(fā)光法檢出344例，特異性為99.42%；ELISA檢出337例，特異性為97.40%。化學(xué)發(fā)光法和ELISA的陽性預(yù)測值分別為97.78%、88.31%，陰性預(yù)測值分別為92.47%、87.53%，準(zhǔn)確性分別為96.86%、87.66%?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測SARSCoV-2 IgM抗體的敏感性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確性優(yōu)于ELISA（P＜0.05），而特異性2種方法之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 2種方法SARS-CoV-2 IgG和IgM抗體聯(lián)合檢測陽性率的比較

在116例COVID-19患者中，化學(xué)發(fā)光法和ELISA SARS-CoV-2 IgG抗體和IgM抗體聯(lián)合檢測的陽性率分別為100%（116/116）和68.97%（80/116）。在346例非COVID-19者中，化學(xué)發(fā)光法和ELISA 2種抗體聯(lián)合檢測的陽性率分別為1.16%（4/346）和 4.91%（17/346）。化學(xué)發(fā)光法2種抗體聯(lián)合檢測的敏感性優(yōu)于ELISA（P＜0.05）。

3 討論

自COVID-19疫情發(fā)生以來，SARS-CoV-2核酸陽性或基因測序結(jié)果與已知的SARS-CoV-2高度同源一直是COVID-19疑似病例的確診標(biāo)準(zhǔn)。但SARS-CoV-2核酸檢測易出現(xiàn)假陰性情況，導(dǎo)致核酸檢測結(jié)果與患者臨床癥狀、影像學(xué)檢查結(jié)果不符，這給COVID-19的診斷及防控帶來巨大的不便[4-5]。因此，《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案（試行第七版）》[3]將血清學(xué)抗體檢測納入COVID-19的確診標(biāo)準(zhǔn)中。

目前，我國已有商品化SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測的試劑盒。由于 COVID-19為新發(fā)的傳染病，抗體檢測對于SARS-CoV-2感染的診斷來說是一個(gè)全新的方法，因此有必要對不同抗體檢測方法的敏感性和特異性進(jìn)行驗(yàn)證。有研究結(jié)果顯示，采用化學(xué)發(fā)光法檢測SARSCoV-2 IgM和IgG抗體有較高的敏感性和特異性[6]。然而，ELISA檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體目前臨床報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，化學(xué)發(fā)光法檢測SARS-CoV-2 IgG和IgM抗體的敏感性分別為90.52%和75.86%，與文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]有一定的差異，可能與不同試劑的檢測原理不同有關(guān)。ELISA檢測SARS-CoV-2 IgG和IgM抗體的敏感性分別為63.79%和58.62%。2種抗體聯(lián)合檢測時(shí)，化學(xué)發(fā)光法的敏感性為100%，ELISA為68.97%。這提示2種抗體聯(lián)合檢測可顯著提高檢測效能。

針對同一抗體的不同檢測方法（間接法、捕獲法等）會(huì)因檢測原理的不同而導(dǎo)致敏感性、特異性出現(xiàn)差異，本研究使用的化學(xué)發(fā)光法試劑盒的檢測原理是基于直接化學(xué)發(fā)光技術(shù)的兩步間接免疫法，針對的是SARS-CoV-2的核衣殼蛋白和刺突蛋白，采用免疫磁捕獲技術(shù)對血清中的SARS-CoV-2抗體進(jìn)行特異性捕獲，由于磁性納米顆粒具有大比表面積、較好的分離富集能力、易于操控等特點(diǎn)，能夠快速富集、分離血清中的抗體，因而敏感性較高。本研究使用的ELISA試劑盒敏感性相對較低和出現(xiàn)假陰性的原因可能與重組抗原的制備、包被及酶標(biāo)記重組抗原影響了抗原與抗體的結(jié)合力有關(guān)。目前，商品化的ELISA試劑往往需要借助酶的催化放大作用，通過結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶催化底物水解，使底物顏色發(fā)生改變來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的輸出，如果能夠提高酶的催化水解效果，則可大大提高ELISA的檢測靈敏度[8]。

目前，隨著我國疫情形勢的好轉(zhuǎn)，SARSCoV-2無癥狀感染者受到越來越多的關(guān)注。由于無癥狀感染者無任何明顯的癥狀與體征，在人群中難以被發(fā)現(xiàn)，其導(dǎo)致的疫情傳播也難以預(yù)防。為此，要做好無癥狀感染者的監(jiān)測，必須有針對性地加大篩查力度。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)操作繁瑣，檢測耗時(shí)較長，對人員及實(shí)驗(yàn)場地等的要求較高，因此基層醫(yī)院難以開展。本研究結(jié)果顯示，化學(xué)發(fā)光法檢測SARS-CoV-2 IgG抗體和IgM抗體的準(zhǔn)確性分別為96.75%和96.86%，ELISA分別為88.31%和87.66%。雖然ELISA的準(zhǔn)確性低于化學(xué)發(fā)光法，但2種方法的特異性均較高，化學(xué)發(fā)光法與ELISA檢測IgG抗體的特異性分別為98.84%和96.53%，檢測IgM抗體的特異性分別為99.42%和97.40%。2種方法的特異性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這表明采用化學(xué)發(fā)光法與ELISA檢測血清SARS-CoV-2抗體可實(shí)現(xiàn)SARS-CoV-2感染的快速篩查與鑒別，尤其是在大規(guī)模復(fù)工復(fù)產(chǎn)人群的篩查中，ELISA成本低，可手工操作，不受儀器、場地限制，可作為SARS-CoV-2感染的篩查方法。

本研究結(jié)果還顯示，在非COVID-19組中，化學(xué)發(fā)光法檢出4例IgG抗體陽性、2例IgM抗體陽性。查看患者血清樣本性狀，有2例脂血嚴(yán)重、1例溶血，還有1例原因未明，可能與患者自身或試劑等因素有關(guān)；ELISA檢出2例IgM抗體與IgG抗體聯(lián)合檢測陽性，此2例患者1例78歲、1例73歲，均患有自身免疫性疾病，類風(fēng)濕因子均有不同程度的升高，因而造成檢測結(jié)果的假陽性。另外，ELISA檢測結(jié)果中還有6例弱陽性（A值稍高于Cut-off值），隔天重新采樣復(fù)查后，結(jié)果均為陰性。

綜上所述，化學(xué)發(fā)光法和ELISA檢測血清SARS-CoV-2 IgG抗體和IgM抗體的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性均較高，可作為COVID-19的輔助診斷方法。另外，化學(xué)發(fā)光法適用于疑似患者的輔助診斷，而ELISA更適用于大規(guī)模人群的篩查，臨床實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的方法。