張敏敏， 王敬華， 葛 平， 王慶忠， 徐 蓉， 劉學杰， 崔 琳， 錢誠凱， 夏啟航， 陳 蓉

（上海市臨床檢驗中心，上海 200126）

近年來，基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術被廣泛應用于臨床常見致病微生物的鑒定工作中，與傳統(tǒng)病原微生物鑒定方法相比，MALDI-TOF MS技術具有操作簡單、檢測快速、特異性高、穩(wěn)定性好、準確率高、耗能低等優(yōu)點。MALDI-TOF MS可通過對病原微生物蛋白指紋圖譜進行同源性分析及時確定致病微生物種屬，對疾病診斷具有重要意義，有望成為臨床微生物實驗室檢測工作的重要組成部分[1-2]。

上海市臨床檢驗中心（Shanghai Center for Clinical Laboratory，SCCL）是上海市臨床檢驗質(zhì)量控制組織評價機構，2015年開始開展質(zhì)譜細菌鑒定室間質(zhì)量評價（簡稱室間質(zhì)評）活動。本研究旨在通過分析2015—2019年質(zhì)譜細菌鑒定室間質(zhì)評活動反饋結果，了解上海市及部分其他地區(qū)臨床實驗室（包括獨立實驗室）微生物質(zhì)譜檢測開展情況及檢測質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 室間質(zhì)評樣本制備

將脫脂牛奶110 ℃條件下15 min高壓蒸汽滅菌，冷卻后分裝0.3 mL到無菌凍存管中備用。選取美國標準菌種庫（American type culture collection，ATCC）菌株，將其保存到脫脂牛奶保存管內(nèi)，置-80 ℃冰箱冷凍，制備成凍干品，低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 室間質(zhì)評方案設計 對參加SCCL質(zhì)譜細菌鑒定室間質(zhì)評活動的臨床實驗室發(fā)放室間質(zhì)評樣本。每年進行2次室間質(zhì)評活動，每次發(fā)放5份樣本。要求參評實驗室根據(jù)臨床標本來源選擇相應的培養(yǎng)基，有臨床意義的病原菌菌株采用質(zhì)譜技術進行鑒定，并在規(guī)定日期內(nèi)（樣本接收后10 d內(nèi)）將檢測結果上報至SCCL數(shù)據(jù)庫，超過規(guī)定時間系統(tǒng)將不再接收數(shù)據(jù)。

1.2.2 結果評價 依據(jù)回報的檢測結果與預期結果的符合性統(tǒng)計各實驗室的得分。合格判定原則：菌株正確鑒定到種水平得20分；正確鑒定到屬水平，而種水平錯誤，得10分?？偝煽儭?0分為合格。對成績進行匯總，并對錯誤的檢測結果進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用EXCEL 2007軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例或率表示。

2 結果

2.1 實驗室回報情況

2015—2019年SCCL質(zhì)譜細菌鑒定室間質(zhì)評活動共發(fā)放樣本50份，菌株涉及27個屬43個種。參評實驗室檢測系統(tǒng)見表1。

表1 參評實驗室檢測系統(tǒng) 家

2.2 實驗室檢測能力評價

2015年參加SCCL質(zhì)譜細菌鑒定室間質(zhì)評活動的臨床實驗室有10家，2019年增加到40家，增加了300%。2015—2019年SCCL共開展10次微生物室間質(zhì)評活動，合格率均為100%。其中，2015年第1次室間質(zhì)評有4家實驗室、2017年第1次和第2次室間質(zhì)評各有1家實驗室、2018年第2次和2019年第2次室間質(zhì)評各有3家實驗室未獲得滿分，其余均獲得滿分。發(fā)放的50株菌株中，有45株鑒定結果符合率為100%，鑒定結果有誤的菌株有維羅納氣單胞菌、溫和氣單胞菌、中間葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌，符合率分別為60%、94.4%、95.5%、89.7%、92.5%。見表2、表3。

表2 2015—2019年SCCL質(zhì)譜細菌鑒定室間質(zhì)評成績

表3 鑒定結果有誤的菌株

3 討論

MALDI-TOF MS技術主要用于臨床各種送檢標本分離培養(yǎng)后單菌落的檢測，目前已被廣泛用于分析血清/血漿、唾液和尿液標本，以診斷疾病、識別健康狀況的潛在生物標志物，為臨床實驗室檢測提供了一個簡單方便的診斷模型[3-5]。MALDI-TOF MS技術在臨床實驗室中的應用不斷被拓展，在微生物鑒定和特殊耐藥微生物同源性分析方面具有一定的前景，也是研究和分析蛋白質(zhì)的有力工具[6]。

SCCL通過開展質(zhì)譜細菌鑒定室間質(zhì)評活動，對上海和部分其他地區(qū)醫(yī)療機構微生物質(zhì)譜鑒定能力進行了評價。（1）參評實驗室由2015年的10家增加到2019年的40家，增加了300%，提示該檢測方法正逐步被醫(yī)療機構接受，并運用到臨床致病菌的鑒定中?？赡苁强紤]到儀器價格比較昂貴，目前主要是三級綜合性醫(yī)院在使用；從鑒定系統(tǒng)的分布看，雖然絕大多數(shù)醫(yī)療機構使用的是進口質(zhì)譜儀，但是國產(chǎn)質(zhì)譜儀也開始逐步被醫(yī)療機構選用。（2）5年室間質(zhì)評的合格率均達到100%，表明該項目整體檢測質(zhì)量較好。2015年第1次室間質(zhì)評有4家實驗室、2017年第1次和第2次室間質(zhì)評各有1家實驗室、2018年第2次和2019年第2次室間質(zhì)評各有3家實驗室未獲得滿分，其余均獲得滿分。發(fā)放的50株菌株中，有45株鑒定結果符合率為100%，但氣單胞菌屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的鑒定結果各參評實驗室略有偏差，提示個別實驗室的檢測能力有待進一步提高。

實驗室回報結果發(fā)生錯誤的原因可能有培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基、前處理方法、人員操作、儀器設備的選擇和校正等多方面的因素。細菌的培養(yǎng)時間是一個非常重要的變量，不同生理條件下的細菌，如處于休眠、細胞分裂、老化等狀態(tài)的細菌，其質(zhì)譜圖會發(fā)生變化。因此，在對細菌進行檢測時，使細菌處于一個穩(wěn)定的狀態(tài)是十分必要的。在對細菌進行培養(yǎng)時，使用不同培養(yǎng)基對細菌進行鑒別具有重要意義，選擇性培養(yǎng)基可以很容易地識別出致病菌，有效分離純化致病菌。不同的實驗室采用不同的標本處理方法，獲得的結果也不完全相同，因此檢測細菌時，可以將未經(jīng)處理的標本直接進樣，但缺點是將會產(chǎn)生較少的質(zhì)譜峰。對于較干燥、細胞壁較厚的菌落，破壁效果會不理想，核蛋白不能完全被釋放出來。為了獲得較多的生物標志物，提高細菌檢測的準確率，建議在檢測前對標本進行處理，尤其是革蘭染色陽性菌的檢測。要規(guī)范操作流程、建立簡便而重復性良好的檢測方法，如靶板涂抹要均勻，過薄或過厚都不能形成較好的結晶。每次進行檢測前都應使用標準品校準儀器。疑難菌株缺乏特異性峰值或峰值數(shù)量不足，無法形成圖譜錄入數(shù)據(jù)庫，因此數(shù)據(jù)庫還需要不斷完善。

質(zhì)譜細菌鑒定室間質(zhì)評是保證各臨床實驗室檢測質(zhì)量的重要手段，可以考察參評實驗室對臨床微生物項目的檢測水平，可以反映在檢測中存在的共性問題，及某些實驗室存在的特殊問題，促進實驗室檢測水平的提高，從而更好地服務臨床。相信隨著標本處理方法的不斷優(yōu)化，標準質(zhì)譜圖庫的不斷擴充、室內(nèi)質(zhì)量控制的不斷加強、微生物檢測實踐經(jīng)驗和理論知識的不斷豐富、相關管理制度的不斷落實，臨床實驗室微生物質(zhì)譜檢測質(zhì)量會越來越高。