張敏敏， 王敬華， 葛 平， 王慶忠， 徐 蓉， 劉學(xué)杰， 崔 琳， 錢誠凱， 夏啟航， 陳 蓉

（上海市臨床檢驗中心，上海 200126）

近年來，基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床常見致病微生物的鑒定工作中，與傳統(tǒng)病原微生物鑒定方法相比，MALDI-TOF MS技術(shù)具有操作簡單、檢測快速、特異性高、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確率高、耗能低等優(yōu)點。MALDI-TOF MS可通過對病原微生物蛋白指紋圖譜進(jìn)行同源性分析及時確定致病微生物種屬，對疾病診斷具有重要意義，有望成為臨床微生物實驗室檢測工作的重要組成部分[1-2]。

上海市臨床檢驗中心（Shanghai Center for Clinical Laboratory，SCCL）是上海市臨床檢驗質(zhì)量控制組織評價機(jī)構(gòu)，2015年開始開展質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)量評價（簡稱室間質(zhì)評）活動。本研究旨在通過分析2015—2019年質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評活動反饋結(jié)果，了解上海市及部分其他地區(qū)臨床實驗室（包括獨立實驗室）微生物質(zhì)譜檢測開展情況及檢測質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 室間質(zhì)評樣本制備

將脫脂牛奶110 ℃條件下15 min高壓蒸汽滅菌，冷卻后分裝0.3 mL到無菌凍存管中備用。選取美國標(biāo)準(zhǔn)菌種庫（American type culture collection，ATCC）菌株，將其保存到脫脂牛奶保存管內(nèi)，置-80 ℃冰箱冷凍，制備成凍干品，低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 室間質(zhì)評方案設(shè)計 對參加SCCL質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評活動的臨床實驗室發(fā)放室間質(zhì)評樣本。每年進(jìn)行2次室間質(zhì)評活動，每次發(fā)放5份樣本。要求參評實驗室根據(jù)臨床標(biāo)本來源選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基，有臨床意義的病原菌菌株采用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定，并在規(guī)定日期內(nèi)（樣本接收后10 d內(nèi)）將檢測結(jié)果上報至SCCL數(shù)據(jù)庫，超過規(guī)定時間系統(tǒng)將不再接收數(shù)據(jù)。

1.2.2 結(jié)果評價 依據(jù)回報的檢測結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的符合性統(tǒng)計各實驗室的得分。合格判定原則：菌株正確鑒定到種水平得20分；正確鑒定到屬水平，而種水平錯誤，得10分?？偝煽儭?0分為合格。對成績進(jìn)行匯總，并對錯誤的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用EXCEL 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例或率表示。

2 結(jié)果

2.1 實驗室回報情況

2015—2019年SCCL質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評活動共發(fā)放樣本50份，菌株涉及27個屬43個種。參評實驗室檢測系統(tǒng)見表1。

表1 參評實驗室檢測系統(tǒng) 家

2.2 實驗室檢測能力評價

2015年參加SCCL質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評活動的臨床實驗室有10家，2019年增加到40家，增加了300%。2015—2019年SCCL共開展10次微生物室間質(zhì)評活動，合格率均為100%。其中，2015年第1次室間質(zhì)評有4家實驗室、2017年第1次和第2次室間質(zhì)評各有1家實驗室、2018年第2次和2019年第2次室間質(zhì)評各有3家實驗室未獲得滿分，其余均獲得滿分。發(fā)放的50株菌株中，有45株鑒定結(jié)果符合率為100%，鑒定結(jié)果有誤的菌株有維羅納氣單胞菌、溫和氣單胞菌、中間葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌，符合率分別為60%、94.4%、95.5%、89.7%、92.5%。見表2、表3。

表2 2015—2019年SCCL質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評成績

表3 鑒定結(jié)果有誤的菌株

3 討論

MALDI-TOF MS技術(shù)主要用于臨床各種送檢標(biāo)本分離培養(yǎng)后單菌落的檢測，目前已被廣泛用于分析血清/血漿、唾液和尿液標(biāo)本，以診斷疾病、識別健康狀況的潛在生物標(biāo)志物，為臨床實驗室檢測提供了一個簡單方便的診斷模型[3-5]。MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床實驗室中的應(yīng)用不斷被拓展，在微生物鑒定和特殊耐藥微生物同源性分析方面具有一定的前景，也是研究和分析蛋白質(zhì)的有力工具[6]。

SCCL通過開展質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評活動，對上海和部分其他地區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)微生物質(zhì)譜鑒定能力進(jìn)行了評價。（1）參評實驗室由2015年的10家增加到2019年的40家，增加了300%，提示該檢測方法正逐步被醫(yī)療機(jī)構(gòu)接受，并運用到臨床致病菌的鑒定中?？赡苁强紤]到儀器價格比較昂貴，目前主要是三級綜合性醫(yī)院在使用；從鑒定系統(tǒng)的分布看，雖然絕大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用的是進(jìn)口質(zhì)譜儀，但是國產(chǎn)質(zhì)譜儀也開始逐步被醫(yī)療機(jī)構(gòu)選用。（2）5年室間質(zhì)評的合格率均達(dá)到100%，表明該項目整體檢測質(zhì)量較好。2015年第1次室間質(zhì)評有4家實驗室、2017年第1次和第2次室間質(zhì)評各有1家實驗室、2018年第2次和2019年第2次室間質(zhì)評各有3家實驗室未獲得滿分，其余均獲得滿分。發(fā)放的50株菌株中，有45株鑒定結(jié)果符合率為100%，但氣單胞菌屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的鑒定結(jié)果各參評實驗室略有偏差，提示個別實驗室的檢測能力有待進(jìn)一步提高。

實驗室回報結(jié)果發(fā)生錯誤的原因可能有培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基、前處理方法、人員操作、儀器設(shè)備的選擇和校正等多方面的因素。細(xì)菌的培養(yǎng)時間是一個非常重要的變量，不同生理條件下的細(xì)菌，如處于休眠、細(xì)胞分裂、老化等狀態(tài)的細(xì)菌，其質(zhì)譜圖會發(fā)生變化。因此，在對細(xì)菌進(jìn)行檢測時，使細(xì)菌處于一個穩(wěn)定的狀態(tài)是十分必要的。在對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)時，使用不同培養(yǎng)基對細(xì)菌進(jìn)行鑒別具有重要意義，選擇性培養(yǎng)基可以很容易地識別出致病菌，有效分離純化致病菌。不同的實驗室采用不同的標(biāo)本處理方法，獲得的結(jié)果也不完全相同，因此檢測細(xì)菌時，可以將未經(jīng)處理的標(biāo)本直接進(jìn)樣，但缺點是將會產(chǎn)生較少的質(zhì)譜峰。對于較干燥、細(xì)胞壁較厚的菌落，破壁效果會不理想，核蛋白不能完全被釋放出來。為了獲得較多的生物標(biāo)志物，提高細(xì)菌檢測的準(zhǔn)確率，建議在檢測前對標(biāo)本進(jìn)行處理，尤其是革蘭染色陽性菌的檢測。要規(guī)范操作流程、建立簡便而重復(fù)性良好的檢測方法，如靶板涂抹要均勻，過薄或過厚都不能形成較好的結(jié)晶。每次進(jìn)行檢測前都應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)儀器。疑難菌株缺乏特異性峰值或峰值數(shù)量不足，無法形成圖譜錄入數(shù)據(jù)庫，因此數(shù)據(jù)庫還需要不斷完善。

質(zhì)譜細(xì)菌鑒定室間質(zhì)評是保證各臨床實驗室檢測質(zhì)量的重要手段，可以考察參評實驗室對臨床微生物項目的檢測水平，可以反映在檢測中存在的共性問題，及某些實驗室存在的特殊問題，促進(jìn)實驗室檢測水平的提高，從而更好地服務(wù)臨床。相信隨著標(biāo)本處理方法的不斷優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫的不斷擴(kuò)充、室內(nèi)質(zhì)量控制的不斷加強、微生物檢測實踐經(jīng)驗和理論知識的不斷豐富、相關(guān)管理制度的不斷落實，臨床實驗室微生物質(zhì)譜檢測質(zhì)量會越來越高。