薛亞軍，杜雅彥，周奕君，董星星，魏育濤，4

食管癌(esophageal cancer, EC)是全球第八大常見癌癥，也是癌癥相關死亡的第六大常見原因[1]。食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)占高危地區(qū)EC所有組織學類型的90%，在中國中北部，ESCC發(fā)病率和死亡率排名第一[2]。NOTCH的信號轉導基因包括NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4等四種受體[3]，參與細胞增殖、分化、凋亡、轉移和黏附。NOTCH1的失調與癌癥密切相關[4-5]。

miR-25是位于染色體7q22.1上的假定致癌基因，在各種癌癥中高表達，并在許多惡性腫瘤相關過程中發(fā)揮功能，如癌癥形成、增殖、凋亡和遷移[4]。多種分子途徑也是miR-25在各種癌癥中的靶點[6]。然而，miR-25對ESCC中的作用和分子機制仍不清楚。該研究主要關注ESCC中miR-25-3p與NOTCH1的相關性，探討其對ESCC細胞的可能作用機制，為ESCC的診斷和治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器與細胞系人ESCC細胞株ECA109購自于中科院上海細胞庫，引物及內參均由上海生工公司設計合成；miRNA模擬物及抑制物由上海吉瑪制藥公司設計合成；NOTCH1的過表達質粒和小干擾RNA(siRNA)干擾片段由GenePharma公司構建。LipofectAMINETM 2000轉染試劑購自于美國Invitrogen公司；Transwell小室及Matrigel基質膠購自于美國Corning公司；CCK-8試劑盒購自于上海氣海復泰有限公司；miRcute系列細胞miRNA提取及檢測試劑盒購自于北京天根生化科技有限公司。

1.2 資料來源參考數據庫①本研究選取PicTar(http://pictar.org/)、miRGen(http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html)、TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_50//)、miRWalk(http://www.microrna.org/microrna/)和miRDB(http：// mirdb.org / miRDB /)5個預測網站進行。為了減少軟件預測的假陽性，取至少同時滿足2個預測軟件的基因才能作為靶基因。②應用TargetScan預測miR-25-3p與NOTCH1 3′-UTR的互補結合位點。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染將細胞系在Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養(yǎng)基混合物中培養(yǎng)，其中混合有10%胎牛血清(FBS)，放置于含有5% CO2、溫度為37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗組分成兩組：第1組：miR-25-3p上調組(轉染miR-25-3p模擬物，使miR-25-3p表達量提高)、miR-25-3p下調組(轉染miR-25-3p抑制劑，使miR-25-3p表達量降低)和NC組(脂質體包裹NC序列，不影響miR-25-3p的表達)；第2組：NOTCH1上調組(轉染NOTCH1模擬物，使NOTCH1表達量提高)、NOTCH1下調組(轉染NOTCH1抑制劑，使NOTCH1表達量降低)和NC組(脂質體包裹NC序列，不影響NOTCH1的表達)。NOTCH1的過表達質粒是pcDNA3.1(+)NOTCH1。其陰性對照質粒為pcDNA3.1(+)NC，不含NOTCH1基因的啟動子區(qū)。分別用miR-25-3p模擬物、抑制劑，NOTCH1模擬物、抑制劑和相對陰性對照轉染ECA109細胞系。該公司合成的模擬物按照推薦量用無酶水稀釋，脂質體Lipofectmine 2000與模擬物的比例根據細胞狀態(tài)和qRT-PCR結果進行調整。miRNA-25-3p 模擬物、抑制劑和NOTCH1 模擬物、抑制劑的靶序列如表1所示。轉染24 h后更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集后用于后續(xù)試驗。

1.4 實時熒光定量PCR法檢測miR-25-3p的表達水平使用miRNeasy Mini Kit從細胞中分離RNA。以260～280 nm光密度(OD)比評估RNA質量。應用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和PrimeScript RT Reagent Kit將RNA逆轉錄為cDNA。應用SYBR Premix Ex Taq試劑盒用于定量mRNA。在CFX96實時熱循環(huán)儀中進行檢測。該研究中使用的寡核苷酸列于表1中。所有miRNA樣品用U6標準化，而mRNA樣品用GADPH標準化。通過使用2-ΔΔCT方法計算相對表達水平。

表1 實驗相關引物序列列表

1.5 Transwell侵襲試驗檢測細胞侵襲能力將細胞在未添加胎牛血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基中饑餓處理6 h。將細胞懸浮于1 ml無血清培養(yǎng)基中，并將100 μl(1×105)細胞接種到24孔板的上室中，在下室中加入600 μl含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，用棉簽旋轉擦去上室面上未穿膜的細胞，多聚甲醛固定20 min后用0.5%結晶紫染色。在100×放大倍率下獲得橫跨下膜的5個視野的圖像。使用ImageJ計數細胞。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖能力將ECA109細胞以每孔4 000個細胞的密度接種到96孔微量培養(yǎng)板上，并在含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。將在OPTI-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞設定為對照組。37 ℃培養(yǎng)48 h后，將每個孔與10 μl CCK-8混合，并在37 ℃下進一步培養(yǎng)3 h。使用分光光度計在450 nm處檢測OD值。以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測在NCBI數據庫中搜索NOTCH1啟動子區(qū)基因序列。將熒光素酶質粒(2 001 bp)及其剪接變體熒光素酶報告基因質粒(1 501、1 001和501 bp)，hsa-miR-25-3p過表達質粒和PRL-TK Renilla熒光素酶質粒轉染到293T細胞。用于檢測的設備包括全波長掃描酶標儀和Dual-Glo?熒光素酶測定系統(tǒng)。樣品加載試驗采用以下步驟：①將Dual-Glo?熒光素酶試劑加入板中；②在20～25 ℃溫育10 min；③測量螢火蟲發(fā)光；④加入100 μl Stop & Glo?Reagent試劑到板上；⑤在20～25 ℃溫育10 min；⑥測量海腎發(fā)光；⑦計算每個孔的螢火蟲/海腎發(fā)光的比例；⑧將樣品孔中的比例標準化為對照孔(或一系列對照孔)中的比率。

1.8 統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0軟件進行分析。每組的數據均進行3次重復。當數據處于正態(tài)分布時，使用兩個獨立樣品的Student-T檢驗，三個或更多個獨立樣品的單向ANOVA評估組間差異。當數據不符合正態(tài)分布時，使用Kruskal-Wallis H檢驗評估組間差異，對具有三個或更多獨立樣本的數據進行統(tǒng)計分析，并使用Wilcoxon秩和檢驗對兩個獨立樣本的數據進行統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-25-3p及NOTCH1的轉染效率質體包裹經化學修飾的合成miR-25-3p和NOCH1轉染ESCC細胞系ECA109，使miR-25-3p和NOTCH1在ECA109細胞中差異表達，以研究其調控機制。實驗分組見1.3項，轉染完成后，使用qRT-PCR檢測三組細胞miR-25-3p和NOTCH1表達量，結果顯示上調組較NC組，表達量明顯升高；下調組較NC組表達量明顯降低(圖1)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明miR-25-3p和NOTCH1的模擬物和抑制劑成功轉入細胞。

圖1 miR-25-3p及NOTCH1的轉染效率

A：miR-25-3p的轉染效率(1. NC組；2.miR-25-3p上調組； miR-25-3p下調組)；B：NOTCH1的轉染效率(1. NC組；2.NOTCH1上調組； NOTCH1下調組)；與NC組相比，*P<0.05

2.2 熒光素酶驗證NOTCH1與miR-25-3p的靶向關系通過搜索TargetScan數據庫，在NOTCH1的3′UTR中發(fā)現了一個保守位點。本課題組進行了熒光素酶報告分析，以評估m(xù)iR-25-3p是否靶向調控293T細胞中的Notch1 mRNA。ECA109細胞用于確定miR-25-3p的抑制和過表達是否會影響NOTCH1 mRNA的表達水平。首先，檢查NOTCH1的3′UTR以確定整個區(qū)域是否是miR-25-3p的功能靶標。熒光素酶報告基因測定證實NOTCH1的3′UTR是miR-25-3p的實際靶標(圖2A)。NOTCH1的3′UTR中的一個保守位點被確認為實際功能位點。在miR-25-3p轉染48 h后熒光素酶活性被顯著抑制(NOTCH1的3′UTR中miR-25-3p靶位點的位置為第1 602～1 608個位點。該結果表明該特異性位點為miR-25-3p靶向位點(圖2B)。在用miR-25-3p模擬物轉染的ECA109細胞系中，NOTCH1 mRNA表達水平顯著降低(圖2C)。進行蛋白質印跡分析以證實miR-25-3p表達與ECA109細胞系中的NOTCH1表達呈負相關。miR-25-3p下調組ECA109細胞系中NOTCH1表達水平顯著升高，miR-25-3p上調組ECA109細胞系中NOTCH1表達水平顯著降低(圖2D)。

2.3 miR-25-3p促進細胞遷移和侵襲將miR-25-3p模擬物和抑制劑轉染到ECA109細胞中時，進行基質膠侵襲測定以檢查miR-25-3p對ECA109細胞侵襲的影響。如圖3A所示，上調組的下室中的細胞多于NC組的細胞，表明miR-25-3p可促進ECA109細胞的侵襲(P<0.05，圖3B)。CCK-8增殖試驗顯示在ECA109細胞中上調miR-25-3p可促進細胞增殖(P<0.05，圖3C)。這些數據表明miR-25-3p可促進ESCC細胞侵襲和增殖。

2.4 NOTCH1抑制ESCC細胞遷移和侵襲將NOTCH1模擬物和抑制劑質粒轉染到ECA109細胞中，使用qRT-PCR檢測NOTCH1的水平。NOTCH1 下調組下室中的細胞數多于NC組(圖3A)，NOTCH1的缺乏也增強了ECA109細胞的侵襲能力(P<0.005，圖3B)，CCK-8增殖試驗顯示在ECA109細胞中下調NOTCH1可促進細胞增殖(P<0.05，圖3C)。NOTCH1上調組的下室中細胞數比NC組中少(P<0.005，圖4A)，NOTCH1的上調抑制ECA109細胞的侵襲能力(P<0.005，圖4B)。CCK-8增殖測定顯示NOTCH1上調抑制細胞生長(P<0.05，圖4C)。這些數據表明NOTCH1負調控ESCC細胞侵襲和增殖。此外，miR-25-3p上調和NOTCH1下調對侵襲和增殖發(fā)揮相同的作用。

圖2 熒光素酶驗證NOTCH1與miR-25-3p的靶向關系

A：miR-25-3p與NOTCH1的保守結合位點的示意圖；B：NOTCH1的3′端非編碼區(qū)是miR-25-3p的靶標之一；C：上調miR-25-3p后，NOTCH1 mRNA水平下降；下調miR-25-3p后，NOTCH1 mRNA水平升高，與NC組相比：*P<0.05；D：下調miR-25-3p后，NOTCH1蛋白表達增多；上調miR-25-3p后，NOTCH1蛋白表達減少

圖3 Transwell和CCK-8實驗檢測miR-25-3p和NOTCH1上調和下調后對ECA109細胞增殖和遷移能力的影響

A：顯微鏡100倍下觀察穿過Transwell小室的相對細胞量；1：miR-25-3p上調組；2：NOTCH1下調組；3：NC組(miR-25-3p實驗組)；4：NC組(NOTCH1實驗組)；B：穿過Transwell小室的相對細胞數；C：CCK-8法檢測細胞增殖能力；與NC組比較：*P<0.05

圖4 Transwell和CCK-8實驗檢測NOTCH1上調后對ECA109細胞增殖和遷移能力的影響

A：顯微鏡100倍下觀察穿過Transwell小室的相對細胞量； 1：NOTCH1上調組；2：NC組；B：miR-25-3p上調組穿膜細胞相對數；C：NOTCH1上調組CCK-8增殖測定；與NC組比較：*P<0.05

3 討論

至2012年，全球共發(fā)生255 800例 EC和400 200例死亡病例[7]。 ESCC是EC的主要病理分型之一，也是最常見的亞型。最近有研究表明細胞癌變是由異常信號轉導引起的，癌細胞是由異常增殖信號誘導的。

miRNA和蛋白質是特殊的生物學標志物，有助于癌癥的早期診斷。它們也是新的治療目標，有助于癌癥預后評估。最近發(fā)現越來越多的miRNA在各種癌癥中差異表達，因此，它們是潛在的生物標志物，可以作為臨床實踐中補充的癌癥生物標志物。研究[8]表明，miRNA-21抑制劑可能通過下調Bcl-2的表達誘導人 EC細胞ECA109的凋亡。miR-25 、miR-106b、miR-21、miR-203和miR-145是ESCC中關鍵的差異表達miRNA[9]，其具體的作用機制尚未見有文獻報道。其他研究確定了miR-106b-25與腫瘤發(fā)生的關聯及其在腫瘤形成過程中上調[10]。Kan et al[11]的研究表明miR-106b-25具有潛在的抗細胞凋亡作用，并在體外實驗中進行驗證發(fā)現可以促進細胞周期。Kim et al[12]證實了miR-25的高表達與胃癌淋巴結轉移之間的正相關性。同樣，miR-25在EC中高表達，其高表達與淋巴結轉移顯著相關。在本研究中，通過轉染對miR-25進行過表達及抑制，然后進行ECA109細胞系遷移、侵襲和增殖的測定，結果表明miR-25過表達促進ESCC細胞轉移和侵襲。

NOTCH蛋白是一種跨膜受體，從蠕蟲到人類在結構和功能上都具有保守性。NOTCH信號通路在ESCC中失調。該途徑可能調控組織發(fā)育和體內平衡。此外，NOTCH信號通路與癌癥干細胞的自我更新、增殖、分化和凋亡有關。因此，NOTCH信號傳導是ESCC的潛在治療靶標。研究[13]表明，NOTCH1信號通路是許多器官中的關鍵信號通路，可調節(jié)細胞分化和凋亡，影響許多生物過程的發(fā)育和功能。這一發(fā)現表明NOTCH1是一種有前景的EC生物標志物，具有重要的理論意義。

本課題組前期研究發(fā)現，miR-25-3p在ESCC中高表達，提示miR-25-3p與ECSS的發(fā)生發(fā)展相關。本研究通過體外細胞實驗及雙熒光素酶實驗發(fā)現，NOTCH1抑制ECA109細胞增殖和遷移，miR-25-3p促進ECA109細胞增殖和遷移，而miR-25-3p靶向調控NOTCH1的表達，從而得出結論；miR-25-3p可能通過靶向負調控NOTCH1的表達來促進ESCC細胞的侵襲和增殖，從而促進ESCC的發(fā)生和發(fā)展。因此，miR-25-3p可作為預測ESCC預后或治療靶點的潛在生物標志物。但是，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展受到很多因子和信號通路的協(xié)同作用，本研究的發(fā)現在ESCC中是否具有主要作用尚需要進一步深入研究。