姚舒生，劉 晨，汪安勇，王中新

細菌耐藥已經(jīng)成為一個全球性的問題，新型抗菌藥物的研發(fā)需求已變得十分迫切[1-2]。傳統(tǒng)抗菌藥物獲取的主要方式是對現(xiàn)有抗菌藥物的結(jié)構(gòu)改造，但這一策略的開展現(xiàn)在變得越來越困難，故尋找新的抗菌藥物作用靶點、開發(fā)作用于新型靶點的抗菌藥物已成為一條越來越重要的途徑[3]。細絲溫度敏感蛋白Z(filamentous temperature-sensitive protein Z, FtsZ)屬于細菌分裂蛋白家族，廣泛分布在原核細胞中，高度保守，具有GTP酶活性，作為細菌分裂的起始調(diào)控蛋白，參與細菌細胞分裂的整個過程[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制FtsZ的功能能夠阻止細菌細胞分裂體的形成，進而導致細菌細胞死亡[6-8]。

計算機輔助藥物設(shè)計(computer-aided drug design, CADD)是近年來流行的一種重要的合理藥物設(shè)計方法，其基本原理通過模擬小分子藥物和大分子相互作用而設(shè)計新型藥物先導化合物[9]。CADD技術(shù)的發(fā)展極大減少了新藥研發(fā)的盲目性和偶然性，大大縮短了新藥研發(fā)的周期，節(jié)約了大量的人力、財力，成為新藥研發(fā)重要的一環(huán)[10]。該研究利用CADD技術(shù)，選擇了來自于金黃色葡萄球菌(S.aureus)的FtsZ晶體結(jié)構(gòu)(PDB號：4DXD)[11]為靶點，開展了虛擬篩選，對篩選的化合物進行體外抗S.aureus活性評價，并利用分子動力學模擬對部分篩選結(jié)果進行了分析，希望能夠獲取FtsZ抑制劑，為研發(fā)新的抗菌藥物提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備與試劑計算工作使用美國Accelrys公司的Discovery Studio 2017軟件完成；小分子庫來源于美國Chemidiv公司，篩選出的小分子化合物均購自于該公司；化合物PC190723購自北京百諾威生物科技有限公司；對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA，ATCC29213)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA，ATCC43300)由安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科提供；營養(yǎng)肉湯購自于杭州百思生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1靶標的準備 FtsZ 蛋白晶體解析結(jié)構(gòu)在Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫下載，PDB編號為4DXD。在篩選前首先進行預(yù)處理，包括刪除水分子、原配體分子PC190723、非相關(guān)的蛋白質(zhì)構(gòu)象；其次定義活性中心，選擇原配體位置為中心，把直徑18 ?的范圍內(nèi)的氨基酸殘基定義為活性氨基酸殘基，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2軟件適用性評價 評價Discovery Studio 2017軟件中將用于對接的模塊，包括Libdock、Ligandfit、CDOCKER和Flexible Docking。選擇定義的活性中心為對接位置，分別利用4種對接模塊(對接參數(shù)設(shè)置見1.2.3項虛擬篩選)將4DXD晶體復(fù)合物中的原配體PC190723對接回原來位置，用對接結(jié)果中結(jié)合能力最好構(gòu)象與原配體構(gòu)象之間的均方根偏差值(root-mean-square difference，RMSD)評價各模塊的適用性，RMSD≤1 ?，表示對接軟件及參數(shù)設(shè)置具有高度適用性。

1.2.3虛擬篩選

1.2.3.1Libdock模塊篩選 從Discovery Studio 2017操作界面調(diào)出Libdock 模塊，設(shè)置參數(shù)如下：Ligands欄設(shè)置為Chemidiv 公司小分子數(shù)據(jù)庫，Receptor欄設(shè)置為活性中心定義后的蛋白4DXD，Docking Preferences選擇為High Quality，每個小分子定義為20個構(gòu)象，其余參數(shù)為默認值。篩選結(jié)束后根據(jù)Libdock Score打分保留每個小分子分值最高的構(gòu)象，以原配體PC190723的最高分值構(gòu)象為閥值，保留高于閥值的小分子，命名為Group 1。

1.2.3.2Ligandfit模塊篩選 從工作界面調(diào)出Ligandfit模塊，設(shè)置參數(shù)如下：Ligands欄設(shè)置為Group 1，Receptor欄設(shè)置為活性中心定義后的蛋白4DXD，Scoring Functions中選擇Dock-Score、每個小分子定義為20個構(gòu)象，其余參數(shù)為默認值。篩選結(jié)束后保留每一個小分子Dock-Score打分最高構(gòu)象，選擇原配體PC190723做參照，篩選出Dock-Score打分高于PC190723最高打分的小分子，命名為Group 2。

1.2.3.3CDOCKER模塊篩選 運行CDOCKER模塊，把預(yù)處理后的4DXD設(shè)置為指定受體，小分子配體選擇Group 2，對接位置設(shè)置為活性位點，每個小分子定義為20個構(gòu)象，其余參數(shù)為默認值。完成對接后，選擇-CDOCKER＿TNTERACTION＿ENERGY參數(shù)打分，保留每個小分子最高打分構(gòu)象，按降序排列，篩選出打分高于PC190723的小分子，命名為Group 3。

1.2.3.4Flexible Docking模塊篩選 首先定義活性位點中關(guān)鍵氨基酸殘基，包括Gly205、Val207、Leu209、Asn263、Ser204，選定之后設(shè)置為Class 1。運行Flexible Docking模塊，對接受體設(shè)置為4DXD，對接配體設(shè)置為Group 3，Selected Residues設(shè)置為Class 1，Conformation Method設(shè)置為Best，對接次數(shù)每個小分子設(shè)置為20個構(gòu)象，其余參數(shù)為默認值。對接完成后，選擇-CDOCKER＿TNTERACTION＿ENERGY參數(shù)打分，保留每個小分子最高打分構(gòu)象，按降序排列，篩選出打分高于PC190723的小分子，命名為Group 4。

1.2.3.5類藥性篩選 打開Small molecules工具欄，選擇Filter Ligands工具面板中的命令工具Filter by Lipinski and Veber Rule，小分子定義為Group 4，根據(jù)Veber Rule規(guī)則和Lipinski’類藥性原則篩選出Group 4適合成藥的小分子，命名為Group 5。

1.2.4最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC)檢測 抗菌實驗方法參照美國臨床實驗室標準委員會的方法進行，采用肉湯稀釋法檢測將Group 5中的化合物終濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/ml時的抗菌作用。具體操作步驟：取無菌96孔板，在每孔中加入100 μl的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，第一列每孔中再補加95 μl的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，隨后分別取濃度為10.24 mg/ml的化合物5 μl加入到第一列各孔中，混勻，倍半稀釋，最后從第10孔中吸取100 μl液體，最后在每孔中加入預(yù)配制的菌液5 μl，設(shè)置空白對照和陰性對照，做好標記，在37 ℃恒溫箱中孵育24 h，觀察結(jié)果，計算MIC值。

1.2.5分子動力學模擬 將對接后的4DXD蛋白-配體復(fù)合物首先進行溶劑化處理，處理后加 CHARMm 力場進行能量優(yōu)化；其次在NVT 系統(tǒng)下進行模擬升溫，溫度參數(shù)設(shè)置為0～300 K，升溫時間設(shè)置為0.25 ns，壓力設(shè)置為1 atm，到達預(yù)定參數(shù)值后進行0.25 ns的平衡模擬，最后對體系進行5 ns的模擬，每0.002 ns保存一次軌跡文件。使用Discovery Studio 2017的Simulation模塊完成。

2 結(jié)果

2.1 對接軟件適用性評價使用4種對接模塊Libdock、Ligandfit、CDOCKER和Flexble Docking對原配體和FtsZ蛋白晶體對接，見圖1。結(jié)果顯示4種對接模塊對接后配體PC190723與對接前FtsZ蛋白晶體復(fù)合物中的同一配體PC190723相比，RMSD值均小于1 ?，說明這4種對接程序及參數(shù)設(shè)置均適用于分子對接的研究，對接結(jié)果是可信的。

2.2 虛擬篩選結(jié)果對ChemDiv公司小分子庫中39 005個小分子化合物經(jīng)多步篩選，使用PC190723作為對照。結(jié)果顯示使用Libdock和LigandFit模塊快速篩選后得到5 632個小分子化合物；使用CDOCKER對篩選得到的5 632個小分子化合物各個構(gòu)象在受體活性位點進行優(yōu)化，精確對接后得到473個小分子化合物；使用Flexible Docking模塊針對關(guān)鍵氨基酸殘基進行全柔性對接后剩余72個小分子化合物；最后通過類藥性評價，獲得15個具有成藥潛力的小分子化合物。見圖2、3和表1。

表1 Discovery Studio 2017軟件4個模塊篩選結(jié)果分值及體外抗S.aureus活性(MIC)評價

圖1 對接軟件一致性評價

A：Libdock模塊對接；B：Ligandfit模塊對接；C：CDOCKER模塊對接；D：Flexble Docking模塊對接；黃色結(jié)構(gòu)為PC190723在4DXD晶體復(fù)合物構(gòu)象，綠色為PC190723對接后的構(gòu)象

2.3 化合物抗菌活性評價結(jié)果如表1 所示，所篩選出的化合物對MSSA和MRSA均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，MIC值范圍分別為1～64 μg/ml和1～128 μg/ml。其中，化合物5010-0572表現(xiàn)出最強的活性，MIC值均為1 μg/ml，與FtsZ抑制劑PC190723相當；化合物5591-1071和5449-0045也表現(xiàn)出良好的抗MSSA和MRSA的作用，MIC值分別為1～4μg/ml之間。C592-0444抗MSSA和MRSA增殖的作用最差，MIC值分別為64 μg/ml 和128 μg/ml。

圖2 虛擬篩選流程及結(jié)果

2.4 配體-受體復(fù)合物體系穩(wěn)定性評價基于抗菌活性評價結(jié)果，采用分子動力學模擬評估了化合物5010-0572、5591-1071、5449-0045、C592-0444和PC190723在與FtsZ蛋白對接形成的配體-受體復(fù)合物體系穩(wěn)定性。結(jié)果如圖4所示，晶體復(fù)合物中的原配體PC190723在2.5 ns的時候與受體的結(jié)合便得到平衡。篩選出的4個化合物中，化合物5010-0572的RMSD變化幅度和PC190723相比最為接近，化合物5591-1071、5449-0045 RMSD依次變大，化合物C592-0444直到3.5 ns后才達到平衡，且波動幅度很大，意味著其形成的復(fù)合物體系的穩(wěn)定性差。

3 討論

FtsZ作為細菌分裂起始蛋白廣泛存在于多種細菌中，其通過招募多種細菌分裂蛋白參與細菌分裂的過程，同時能夠催化GTP生成GDP，為細菌分裂提供能量，已廣泛被認定是一個具有研發(fā)前景的抗菌作用靶點[4-8]，尤其對于抗耐藥菌藥物的研發(fā)[12]。FtsZ具有高度的保守性和特異性，具備小分子藥物靶向識別的條件。

圖3 虛擬篩選獲得的小分子配體的結(jié)構(gòu)

圖4 配體-受體復(fù)合物體系蛋白主鏈碳原子的RMSD

在本研究中，利用計算機輔助藥物設(shè)計Discovery Studio 2017軟件技術(shù)開展了基于S.aureusFtsZ蛋白為靶標的藥物篩選。在篩選過程中，首先開展了對接程序適用性的評價。對接結(jié)果的準確性關(guān)系到篩選結(jié)果的可信度，這也是評價CADD軟件優(yōu)劣的重要標準。結(jié)果顯示，4種對接模塊Libdock、Ligandfit、CDOCKER和Flexble Docking使用原配體對接后，均能夠很好重現(xiàn)原配體與受體的相互作用模式，RMAD值在1 ?以下，說明軟件的對接結(jié)果是十分可信的。隨后使用4種對接模塊設(shè)計了由粗獷到精細漸進式的篩選方案。其中Libdock根據(jù)熱區(qū)匹配的原理將小分子構(gòu)象剛性對接到活性位點口袋中，Ligandfit則是基于配體和受體的形狀匹配，采用Monte Carlo method來檢索分子的柔性空間構(gòu)象，兩種方法適用于快速的虛擬篩選；CDOCKER基于CHARMm力場，采用模擬退火的方法將各個構(gòu)象在受體活性位點進行優(yōu)化，從而找到全局能量最低構(gòu)象，CDOCKER對接結(jié)果更加準確，但速度較慢，耗時約是Libdock的5倍；Flexible Docking 模擬生理條件受體和配體的狀態(tài)，以柔性的方式進行對接，精準的研究受體-配體相互作用過程，適用于進一步更精確的篩選[14]。對小分子庫中39 005個小分子經(jīng)上述4個模塊依次篩選后得到了72個化合物，進一步通過類藥性評價最終獲得15個化合物。抗菌活性評價顯示，這些化合物對MSSA和MRSA均有一定的抗菌作用，其中化合物5010-0572的活性最強(MIC=1 μg/ml)，與已報道FtsZ抑制劑PC190723相當[11]。

分子動力學模擬能夠模擬受體-配體相互作用隨時間的變化，判斷受體-配體結(jié)合的穩(wěn)定性，準確性高，可以用來解釋復(fù)合物相互作用機理。對經(jīng)虛擬篩選和抗菌活性篩選后的部分化合物研究發(fā)現(xiàn)，抗菌能力強的化合物5010-0572與FtsZ結(jié)合過程與蛋白晶體中的原配體PC190723最為接近，而抗菌活性最差的化合物C592-0444的結(jié)合過程與原配體相比，偏差最大，這一結(jié)果有力的印證了化合物抗菌活性評價的結(jié)果，也是對虛擬篩選結(jié)果的有力補充。

綜上，本研究利用CADD技術(shù)，通過多重篩選策略篩選得到了15個靶向FtsZ蛋白的抗菌小分子化合物，化合物5010-0572表現(xiàn)出最強的抗菌活性，具有成為抗菌藥物先導化合物的條件。