廖延武，吳德玲，2，許鳳清，2，張 偉，2，黃 琪，2，王桐生

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學藥理學教研室，安徽 合肥 230012)

荊芥為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuifoliaBriq.的干燥地上部分，具有解表、透疹的功效，是臨床上常用的解表藥[1]。中藥成分復雜，以單一成分指標作為其質(zhì)量評價的依據(jù)有很大的局限性[2]。在現(xiàn)行的2015年版《中華人民共和國藥典》中，荊芥主要以揮發(fā)油含量、胡薄荷酮含量來控制產(chǎn)品的質(zhì)量，無法全面反映產(chǎn)品的質(zhì)量[3]。

中藥指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的色譜鑒定手段，在中藥質(zhì)量控制和鑒別中都起到重要作用[4-7]。利用中藥色譜指紋圖譜可對中藥材質(zhì)量進行全面、合理、精確的評價[8]。聚類分析是用相似度來衡量樣品之間的親疏程度，并以此來實現(xiàn)分類的一種方法[9]。主成分分析法是將多個相關性指標轉換成少數(shù)幾個相互獨立的綜合指標，從而使繁多的求解目標簡化的一種方法[10]?；诖?，本研究通過建立高效液相指紋圖譜檢測不同產(chǎn)地的23批荊芥藥材，結合聚類分析和主成分分析方法，能夠簡單快速區(qū)分出不同產(chǎn)地的荊芥樣品，并對其質(zhì)量進行綜合評價，為不同產(chǎn)地荊芥藥材的鑒別與質(zhì)量評價提供新的途徑。

1 材料

1.1 儀器 HITACHI Primaide高效液相色譜儀(四元泵，自動進樣器，柱溫箱，二極管矩陣檢測器)：日立高新技術有限公司；ME204 電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司。

1.2 試藥 胡薄荷酮對照品(批號 YBF18052406)、橙皮苷對照品(批號 YBF18052412)、迷迭香酸對照品(批號 M-024-181210)：南京元寶峰醫(yī)藥科技有限公司；MREDA色譜乙腈、MREDA色譜甲醇：美國Meridian公司；其余試劑均為分析純。荊芥樣品經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學藥學院劉守金教授鑒定為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuifoliaBriq.干燥地上部分。23批藥材產(chǎn)地來源見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件 將各批次樣品色譜圖數(shù)據(jù)導入2012年版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件中，對各批次荊芥藥材進行整體相似性評價。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 標準品溶液制備 精密稱取迷迭香酸、橙皮苷、胡薄荷酮對照品1.63、1.58、1.13 mg，加甲醇溶解，分別制成65.2、63.2、45.2 μg/mL的迷迭香酸、橙皮苷、胡薄荷酮對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 稱取0.5 g荊芥粉末，粉末均過二號篩，置具塞三角瓶內(nèi)，加甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件 色譜柱：以依利特SinoChrom ODS-BP(5 μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱為分析柱；乙腈-0.05%磷酸水作為流動相系統(tǒng)，流動相A為乙腈，流動相B為0.05%磷酸水。梯度洗脫：0～20 min，10%～25% A；20～40 min，25%～27% A；40～45 min，27%～33% A；45～50 min，33%～43% A；50～55 min，43%～60% A；55～63 min，60%～85% A；63～65 min，85%～10% A；65～70 min，10% A。柱溫設置為30 ℃，進樣量為20 μL，檢測波長為283 nm，流速1.0 mL/min，運行時間70 min。

表1 樣品產(chǎn)地來源

2.3 指紋圖譜方法學考察

2.3.1 精密度試驗 按“2.1.2”項下方法制備同一批供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄荊芥結果顯示28個共有峰的相對保留時間和相對峰面積 (參比峰為12號峰) 的RSD分別為0.047%～0.958%和0.563～0.984%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批次樣品，按“2.1.2”項下方法分別制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件平行測定。記錄荊芥結果顯示28個共有峰的相對保留時間和相對峰面積 (參比峰為12號峰) 的RSD分別為0.117%～1.476%和0.745%～2.103%，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 按“2.1.2”項下方法制備同一批供試品溶液，按“2.2”項色譜條件，分別在0、2、4、 6、8、10、12 h進樣分析。記錄荊芥結果顯示28個共有峰的相對保留時間和相對峰面積 (參比峰為12號峰) 的RSD分別為0.146%～1.344%和0.513%～2.259%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜分析與評價

2.4.1 共有峰的確定 將23批荊芥藥材依照“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，并按“2.2”項方法進行測定。將所得的23批荊芥高效液相色譜指紋圖譜依次導入到2012年版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件進行多點校正，自動匹配，通過對比色譜圖確定共有峰為28個[11]。見圖1。另將橙皮苷、迷迭香酸、胡薄荷酮對照品色譜圖與樣品色譜圖中相應位置的色譜峰進行比較，確認樣品指紋圖譜中12號峰為橙皮苷，13號峰為迷迭香酸，25號峰為胡薄荷酮。見圖2。

圖1 23批荊芥藥材高效液相色譜指紋圖譜

圖2 荊芥藥材的共有模式圖

2.4.2 相似度分析 分別將23批荊芥樣品的色譜圖導入2004年A版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件里，以生成的特征指紋圖譜共有模式為對照，計算各批次樣品的相似度，同時考查色譜峰的一致性。結果見表2。

2.5 系統(tǒng)聚類分析 以23批荊芥指紋圖譜中的28個共有峰峰面積為變量，用SPSS 23.0數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析軟件對其進行系統(tǒng)聚類分析，選用質(zhì)心聯(lián)接聚類方法，采用歐式距離度量標準，計算樣品的相似性程度，聚類結果見圖3。結果表明，23批荊芥藥材大致可以分為兩大類：亳州產(chǎn)荊芥一類(即S1-S17)，河北安國、河北定州、河南周口、四川自貢產(chǎn)荊芥分為另一類(即S18-S20)。同時后一類還可進一步劃分為三類，具體可分為河南周口(S22)第一類，四川自貢(S23)第二類，河北安國(S19-S20)、河北定州(S21)、河北玉田(S18)為第三類。

2.6 主成分分析

2.6.1 主成分因子特征值、方差貢獻率分析 采用SPSS 23.0軟件對28個共有峰的數(shù)據(jù)進行Z-score標準化處理后，進行主成分因子分析，其中主成分特征值和方差貢獻率是選擇主成分的重要依據(jù)，其特征值和方差貢獻率見表3。同時結合碎石圖(見圖4)可以更直觀地看到圖中主成分因子6處有明顯的拐點，且特征值是大于1的，這說明前6個主成分因子的分析結果基本顯示了不同產(chǎn)地荊芥藥材的相似度與差異性。

表2 23批荊芥指紋圖譜相似度

圖3 23批荊芥聚類分析圖

表3 6個主成分因子的特征值和方差貢獻率

圖4 主因子碎石圖

由載荷矩陣(表4)可見，成分8、11、13、14、15、16、19、20、21、22在主成分1上有較高的載荷量，即主成分1主要反映了這10個成分指標的信息；成分1、2、3、4、6、7、10在主成分2上有較高的載荷量，即主成分2主要反映了這7個成分指標的信息；同理，主成分3主要反映了成分23、25這2個指標的信息，主成分4主要反映了成分24、27這2個指標的信息，主成分5反映了成分18、28這2個指標的信息，主成分6主要反映了成分17的信息。同時結合載荷圖(圖5)，矩陣中主成分1、2、3上具有高載荷值的成分指標，在載荷圖中，皆分布在距離原點較遠的位置，即載荷值越大與原點距離越遠。這也說明了載荷圖成分分布規(guī)律與載荷矩陣中數(shù)值大小具有一致性。

2.6.2 不同產(chǎn)地荊芥藥材主成分得分、綜合得分及排序分析 利用上述6個主成分對23批不同產(chǎn)地的荊芥藥材樣品進行綜合質(zhì)量評價，各主成分因子得分、綜合得分(利用公式)及排序見表5，同時以主成分為變量繪制23批不同產(chǎn)地荊芥藥材樣品的得分圖，見圖6。

注：F1—F28為峰1—峰28

表4 初始因子載荷矩陣成分

表5中各批次荊芥藥材樣品的排序結果表明綜合得分排名最高的為S7藥材樣品，來自于安徽亳州；綜合得分排名最低的為S22藥材樣品，來自于河南周口；從整體排序來看，綜合得分排名靠前的荊芥樣品為安徽亳州、河北唐山等地，而排名最后的荊芥樣品來自于四川自貢及河南周口。另外結合得分圖(見圖6)可以看到，在主成分1中，S15、S11荊芥樣品得分較高，在主成分2中S7、S18荊芥樣品得分較高。

表5 23批荊芥藥材主成分因子得分及排序

注：F1—F28為峰1—峰28

3 討論

通過查閱文獻分別對檢測波長、提取溶劑、流動相系統(tǒng)進行篩選，最終確定在283 nm檢測波長下，提取溶劑為甲醇，在以乙腈-0.05%磷酸水作為流動相時，色譜峰的峰型更尖銳，同時基線平穩(wěn)，分離度較好。

本實驗通過高效液相色譜得出5個產(chǎn)地23批荊芥藥材的色譜圖，建立了測定的色譜條件，并且對23批荊芥進行指紋圖譜研究，用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)、SPSS 23.0軟件進行評價，通過聚類分析、主成分分析等方法，對不同品種荊芥藥材進行鑒別與質(zhì)量評價。結果發(fā)現(xiàn)所收集樣品中安徽、河北產(chǎn)的荊芥質(zhì)量相對較好。另外，實驗中樣品主要以安徽產(chǎn)荊芥為主，河北及其他產(chǎn)地的批次相對較少，后期可考慮進一步豐富樣品批次加以驗證實驗結論。

綜上所述，本實驗研究的高效液相色譜指紋圖譜檢測方法簡便快捷，重現(xiàn)性好，可用于荊芥的質(zhì)量控制，聚類分析結果與主成分分析結果為不同產(chǎn)地荊芥質(zhì)量評價研究提供借鑒與參考。