郝樂(lè)樂(lè)，李偉莉，吳 花，金 雅，王媛中，余欣慧

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 合肥 230031)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)指與同一性伴侶發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)，是女性妊娠期主要疾病之一，病因復(fù)雜，且仍有40%患者病因不明，嚴(yán)重影響育齡女性的身心健康，引起RSA的原因較多, 包括先天遺傳、女性解剖異常、內(nèi)分泌紊亂、盆腔感染因素、男性因素、心理因素及免疫因素等, 但其確切機(jī)制尚不明確[1]。因此RSA的機(jī)制研究引起越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注[2-3]。有研究表明，希佩爾-林道抑癌基因(Von Hippel-Lindau, VHL)缺陷會(huì)抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)的降解，從而升高HIF-1α的表達(dá)，引起血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、細(xì)胞代謝等一系列改變，促進(jìn)血管生成[4]。也有研究表明，補(bǔ)腎健脾活血法能改善子宮內(nèi)環(huán)境和胎盤(pán)的微循環(huán)[5]。補(bǔ)腎安胎沖劑是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，在壽胎丸的基礎(chǔ)上改良而成，具有補(bǔ)腎健脾、養(yǎng)血安胎的作用，廣泛應(yīng)用于RSA患者的防治中，其保胎療效確切[6-7]。但補(bǔ)腎安胎沖劑影響血管生成的機(jī)制尚不明確。故本研究以VHL/HIF-1α信號(hào)通路作為切入點(diǎn)，旨在從母胎界面血管生成角度，探討補(bǔ)腎安胎沖劑的作用機(jī)制，為臨床保胎應(yīng)用補(bǔ)腎安胎沖劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雌性CBA/J小鼠76只，雄性DBA/2小鼠30只，BALB/C小鼠8只，小鼠體質(zhì)量均為20 g左右，屬于SPF級(jí)，8周齡，均購(gòu)于北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004]。所有小鼠均飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[環(huán)境溫度：(24±2)℃；相對(duì)濕度：45%±5%；每日光照時(shí)間和黑夜時(shí)間均等，各12 h]，自由獲得水及食物，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物 補(bǔ)腎安胎沖劑(每袋10 g，皖藥制字BZ20080017)由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供；黃體酮膠囊(每粒50 mg，國(guó)藥制字H20041902)由浙江仙琚制藥股份有限公司提供。

1.3 試劑與儀器 ①酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒。VHL(貨號(hào) EK-E20775R)、HIF-1α(貨號(hào) EK-E20353R)：北京安迪華泰生物科技有限公司。②熒光定量PCR試劑。Trizol(批號(hào) 90803)：Life technogies公司；QuantiNova SyBr Green PCR試劑盒(批號(hào) 208054)：Qiagen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào) 00519963)：Thermo Scientific。③免疫組織化學(xué)法試劑。VHL(批號(hào) AC11253656)、HIF-1α(批號(hào) GR196812-1)：Bioss公司；通用型二抗試劑盒(批號(hào) K136830B)、DAB顯色劑(批號(hào) K136821F)、PBS(批號(hào) WK163307-1)：北京中杉公司。④Western blot法試劑。山羊抗小鼠IgG(批號(hào) 127655)、山羊抗兔IgG(批號(hào) 129256)、β-actin(批號(hào) 17AV0303)：北京中杉公司；VHL(批號(hào) AC11253656)、HIF-1α(批號(hào) AE120101P)：Bioss公司；SDS(批號(hào) 1029H032)：Solarbio；PVDF膜(批號(hào) R8CA8257E)：Millipore；ECL超敏發(fā)光試劑盒(批號(hào) QF220648)：Thermo。

RM2135切片機(jī)(Leica)：德國(guó)；普通PCR儀(型號(hào) K960)；顯微鏡(Nikon 80i)：日本；EPS300型電泳儀：Tanon；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(JW-3021HR)：安徽嘉文儀器裝備有限公司；TS-1000水平搖床、LX 300型微量離心機(jī)：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制、分組及給藥 按照文獻(xiàn)[8]方法復(fù)制RSA小鼠模型和正常妊娠小鼠模型。每日凌晨5:00—6:00檢查雌鼠陰道，若見(jiàn)陰道栓，計(jì)為妊娠第1天；若未見(jiàn)陰道栓，則繼續(xù)合籠。共復(fù)制RSA模型小鼠50只，正常妊娠小鼠10只。將模型復(fù)制成功的RSA小鼠隨機(jī)分為5組：模型組，黃體酮組，補(bǔ)腎安胎沖劑高、中、低劑量組，每組10只。從妊娠第1天開(kāi)始給藥，正常組、模型組小鼠給予等容積蒸餾水灌胃，黃體酮組小鼠以26 mg/(kg·d)黃體酮灌胃，補(bǔ)腎安胎沖劑高、中、低劑量組小鼠于妊娠第1天分別按35.1、11.7、3.9 g/(kg·d)灌胃。每日1次，連續(xù)15 d，末次給藥24 h后處死小鼠。

2.2 胚胎丟失率的計(jì)算 肉眼觀察各組孕鼠胚胎丟失情況并記錄，計(jì)算胚胎丟失率。參照趙愛(ài)明等[9]的方法制定胚胎丟失的標(biāo)準(zhǔn)，記錄每組孕鼠的存活胚胎數(shù)、丟失胚胎數(shù)，然后計(jì)算胚胎丟失率。胚胎丟失率=丟失胚胎數(shù)/(存活胚胎數(shù)+丟失胚胎數(shù))×100%。

2.3 ELISA法檢測(cè)外周血VHL、HIF-1α水平 從眶后靜脈叢采血2 mL，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液0.5～1 mL于試管中，-80 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒測(cè)定外周血中VHL、HIF-1α的含量。

2.4 采用熒光定量PCR檢測(cè)VHL、HIF-1α mRNA的表達(dá)水平 運(yùn)用Trizol法對(duì)小鼠蛻膜組織進(jìn)行總RNA提取，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，熒光定量PCR檢測(cè)VHL、HIF-1α mRNA的表達(dá)水平。以cDNA作為熒光定量的模板，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)蛻膜組織VHL、HIF-1α表達(dá)水平 蛻膜組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波修復(fù)抗原。PBS液洗滌3次，滴加一抗(VHL、HIF-1α，稀釋至1∶200)，37 ℃孵育60 min。PBS洗滌后再滴加通用型二抗，37 ℃孵育20 min。DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片。光鏡下以細(xì)胞胞漿、胞核中呈棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性對(duì)照。采用JEDR 80ID形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件(Version 1.0)對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的積分光密度值(integral optical density，IOD)進(jìn)行分析。

2.6 Western blot法檢測(cè)蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白水平 取小鼠蛻膜組織，按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠蛻膜組織總蛋白，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉溶液在搖床上室溫封閉2 h，加入不同一抗VHL(稀釋至1∶300)和HIF-1α(稀釋至1∶300)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌3次，加入二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(稀釋至1∶10 000)，孵育2 h。室溫孵育2 h，PBST洗滌3次。使用ECL超敏發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白條帶，最后用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的灰度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠胚胎丟失率 與正常組比較，模型組小鼠胚胎丟失率顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，所有治療組小鼠胚胎丟失率均顯著下降(P<0.05)；與補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組比較，補(bǔ)腎安胎沖劑高、中劑量組胚胎丟失率顯著升高(P<0.05)；黃體酮組與補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組小鼠胚胎丟失率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠胚胎丟失率比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃體酮組比較，□P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑中劑量組比較，◇P<0.05

3.2 各組小鼠血清中VHL、HIF-1α含量比較 與正常組比較，模型組小鼠血清中VHL含量明顯上升(P<0.05)，HIF-1α含量明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，所有治療組小鼠血清中VHL含量均明顯下降(P<0.05)，HIF-1α含量均明顯升高(P<0.05)；補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組小鼠血清中VHL含量低于低、中劑量組(P<0.05)，HIF-1α含量高于低、中劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清中VHL、HIF-1α含量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃體酮組比較，□P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑中劑量組比較，◇P<0.05

3.3 各組小鼠蛻膜VHL、HIF-1α mRNA表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組VHL mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，HIF-1α mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各藥物治療組VHL mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，HIF-1α mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)VHL、HIF-1α mRNA表達(dá)的影響具有劑量依賴(lài)性，以補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量作用最優(yōu)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

3.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)的各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較 VHL、HIF-1α在各組妊娠小鼠蛻膜組織中皆有表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞的細(xì)胞漿中，除此之外在細(xì)胞核中也可見(jiàn)表達(dá)。見(jiàn)圖1。與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織中VHL蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各治療組小鼠蛻膜組織中VHL蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；補(bǔ)腎安胎沖劑降低模型小鼠蛻膜組織中VHL蛋白和升高HIF-1α蛋白的作用具有明顯的劑量依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表4 各組小鼠蛻膜VHL、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃體酮組比較，□P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑中劑量組比較，◇P<0.05

表5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)的各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與黃體酮組比較，□P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑中劑量組比較，◇P<0.05

3.5 Western blot檢測(cè)的各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織中VHL蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各治療組蛻膜組織中VHL蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；補(bǔ)腎安胎沖劑降低模型小鼠蛻膜組織中VHL蛋白和升高HIF-1α蛋白的作用具有明顯的劑量依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表6。

表6 Western blot檢測(cè)的各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃體酮組比較，□P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑中劑量組比較，◇P<0.05

注：A.正常組；B.模型組；C.黃體酮組；D.補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組；E.補(bǔ)腎安胎沖劑中劑量組；F.補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組；箭頭所示棕黃色或棕褐色顆粒是VHL、HIF-1α蛋白

圖1各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較(免疫組織化學(xué)法，10×20倍)

注：A.正常組；B.模型組；C.黃體酮組；D.補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組；E.補(bǔ)腎安胎沖劑中劑量組；F.補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組

圖2Westernblot法檢測(cè)各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達(dá)水平

4 討論

RSA屬于中醫(yī)“滑胎”范疇，是妊娠期的一種常見(jiàn)疾病，RSA主要是由“脾腎氣血兩虛”所致。目前對(duì)于RSA的治療，中醫(yī)主要通過(guò)補(bǔ)腎健脾法進(jìn)行治療?！短ギa(chǎn)指南》指出：“凡孕婦脾胃旺而血?dú)獬洌瑒t胎安而正?！逼庵魃瑲饽茌d胎，中氣升提有力，胎兒正常發(fā)育而不致墮胎?！陡登嘀髋啤分赋?“腎水足而胎安，腎水虧而胎動(dòng)?！蹦I主固胎，腎氣盛則孕后胞脈固胎有力，使胎無(wú)下墜之慮，說(shuō)明胎兒生長(zhǎng)發(fā)育全賴(lài)母體之腎所系，脾胃化生之氣血所養(yǎng)，氣以載之，沖任以固之。補(bǔ)腎安胎沖劑是基于此理論的一種經(jīng)驗(yàn)性復(fù)方，主要由菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、黃芪、白術(shù)、黃芩等藥物組成，具有補(bǔ)腎健脾、養(yǎng)血安胎的作用。菟絲子能補(bǔ)腎，腎旺自能蔭胎；桑寄生能養(yǎng)血，強(qiáng)筋骨，使胎氣強(qiáng)壯；續(xù)斷亦為補(bǔ)腎要藥；黃芪、白術(shù)配伍，健脾益氣安胎；白術(shù)、黃芩為安胎圣藥，白術(shù)健脾除濕，黃芩滋陰清熱，合而用之養(yǎng)血健脾，清化濕熱，以安胎氣。

HIF-1是一種異源二聚體,主要由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞單位組成。HIF-1α作為唯一的活性亞基,能調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，如參與紅細(xì)胞生成、血管形成等生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)還對(duì)胚胎及胎盤(pán)發(fā)育起重要作用[10]。有研究[11-12]表明，HIF-1α通過(guò)誘導(dǎo)或調(diào)控血管生成相關(guān)基因促進(jìn)血管新生，如增加VEGF等細(xì)胞因子的分泌從而調(diào)控動(dòng)物對(duì)缺血反應(yīng)的適應(yīng)。VHL是一種蛋白質(zhì)編碼基因，參與HIF的泛素化和降解[13]。有研究[14]表明，VHL的關(guān)鍵組成部分E3連接酶復(fù)合體可泛素化和降解HIF-1α，當(dāng)VHL蛋白失活會(huì)抑制E3連接酶復(fù)合體，從而上調(diào)HIF-1α的表達(dá)水平，過(guò)量的HIF-1α?xí)e聚于細(xì)胞內(nèi)，激活其靶基因轉(zhuǎn)錄，間接啟動(dòng)VEGF、Notch和PI3K/AKT/mTOR等信號(hào)通路，激活缺血傳導(dǎo)途徑，促使腫瘤血管新生及腫瘤細(xì)胞的增殖。另有研究[15-16]表明，VHL/HIF-1α信號(hào)通路對(duì)胚胎的發(fā)育和機(jī)體組織的生長(zhǎng)等均有重要的調(diào)控作用。因此，本研究進(jìn)一步從微觀角度探討經(jīng)補(bǔ)腎安胎沖劑干預(yù)后，VHL、HIF-1α蛋白表達(dá)及這一信號(hào)通路在RSA過(guò)程中的作用。

CBA/J×DBA/2交配組合具有易患反復(fù)自然性流產(chǎn)的特點(diǎn)，可以用作研究反復(fù)自然性流產(chǎn)的動(dòng)物模型[17]。因此，本研究采用CBA/J×DBA/2交配組合經(jīng)典反復(fù)流產(chǎn)小鼠模型，觀察補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)RSA小鼠胚胎丟失率、血清和蛻膜組織中VHL、HIF-1α表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組RSA小鼠胚胎丟失率高，血清中VHL含量升高，HIF-1α含量降低；蛻膜組織中VHL mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，HIF-1α mRNA及其蛋白表達(dá)水平下降。經(jīng)藥物干預(yù)后，RSA小鼠胚胎丟失率降低；血清VHL含量和蛻膜組織中VHL mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯降低，血清HIF-1α含量和蛻膜組織中HIF-1α mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯增加，其中補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組效果最為顯著。因此可以推測(cè)，補(bǔ)腎安胎沖劑可能是通過(guò)VHL/HIF-1α信號(hào)通路誘導(dǎo)RSA小鼠胎盤(pán)血管的形成，降低胚胎丟失率，從而達(dá)到保胎的效果。因此，補(bǔ)腎安胎沖劑可以作為一種潛在的、有益的中藥復(fù)方制劑，用于RSA的預(yù)防和治療中。