張琳梅， 高嶺， 李少明， 陳誠

(1.西安醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 口腔頜面外科， 山東 青島 266555； 3.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院口腔綜合科， 陜西 西安 710004)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是常見的頭頸部惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤的5%[1]。近年來OSCC的檢測和治療取得了令人鼓舞的進(jìn)展，但是患者的5年生存率仍然很低[2]。炎癥被列為癌癥的八大特征之一，非可控性炎癥是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要過程[3]。研究證實慢性炎癥在腫瘤的生長、侵襲、血管再生、形成缺氧微環(huán)境等方面具有重要作用[4]，因此，闡明炎癥與癌癥間的轉(zhuǎn)化機制，對于有效遏制慢性口腔炎性病變向口腔癌的惡變有著極其重要的作用。Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)是一種跨膜蛋白，在宿主防御病原體、激活先天免疫和調(diào)節(jié)慢性炎癥風(fēng)險方面發(fā)揮著重要作用[5]。初步證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞中TLR4基因的過表達(dá)可誘發(fā)局部的慢性炎癥，從而促進(jìn)腫瘤生長[6]。冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold inducible RNA binding protein，CIRP)可通過TLR4誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在多種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)[7-8]。CIRP是一種位于細(xì)胞核內(nèi)18 kDa的蛋白，氨基端具有共有RNA識別序列[9]；羧基末端為甘氨酸富集的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含一些精氨酸-甘氨酸-甘氨酸序列，屬于富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白家族亞群之一，又稱為異源核糖核蛋白A18[9]。當(dāng)受到外界誘導(dǎo)時，CIRP可從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，靶向特定的mRNA并促進(jìn)其翻譯，在G1期延長時介導(dǎo)對細(xì)胞生長的抑制[10]，但其在OSCC中的具體機制仍未明確。因此，本研究通過檢測OSCC患者癌組織標(biāo)本中CIRP和TLR4蛋白的表達(dá)，分析其與患者臨床組織病理和預(yù)后的關(guān)系，為慢性炎癥向OSCC的惡變過程提供新的早期預(yù)測指標(biāo)及合適的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1一般資料 選取40例2009-2014年確診為OSCC患者的癌組織標(biāo)本作為研究組，患者的瘤周正常組織作為對照組；要求患者未經(jīng)過其他治療、臨床資料完整且獲患者或其家屬知情同意。納入40例患者，男27例、女13例，年齡35～81歲，首次診斷為原發(fā)性O(shè)SCC的平均年齡為(58.25±12.04)歲；組織學(xué)高、中、低分化各有16、13及11例；腫瘤分期(tumor,lymph node and metastasis stage，TNM)為T1、T2、T3及T4期分別有9、14、10及7例；臨床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期分別有11、13、7及9例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性16例、陰性24例；患者術(shù)前均無化療，術(shù)后均無復(fù)發(fā)。對所有患者或其家屬做電話回訪，術(shù)后隨訪1次/年，截止到2019年時死亡21例(52.5%)，死亡者的生存時間范圍6.00～56.00 月、平均生存時間(32.08±12.39)月。

1.1.2主要試劑和儀器 CIRP抗體、TLR4抗體和鼠單克隆抗體購自英國ABcam公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、4%多聚甲醛、無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、二甲苯、石蠟、3%雙氧水、Triton×100、山羊抗小鼠免疫組化試劑盒(histostain&re plus SP)和3,3,二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine DAB)顯色劑均購自中國北京中杉公司，蘇木素、中性樹膠、孵育盒購自西安沃爾森生物技術(shù)公司，DHG-9000恒溫烤箱購自深華生物科技有限公司，HS-S7220切片機購自恒松科技公司，DMIRBHC倒置顯微鏡購自美國Leica公司。

1.2 檢測方法

1.2.1組織固定、包埋、切片 術(shù)中取得的組織標(biāo)本浸泡于4%多聚甲醛，4 ℃過夜；80%乙醇浸泡24 h、95%乙醇浸泡14 h，無水乙醇浸泡2次、3 h/次，二甲苯浸泡2次、30 min/次，標(biāo)記、石蠟浸泡和包埋；將制作好的組織蠟塊進(jìn)行切片(厚4 μm)、貼片，放入60 ℃恒溫烤箱烤干2 h，備用。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判斷 樣本切片覆蓋3%過氧化氫，山羊血清室溫封閉，加入一抗(稀釋比例1 ∶150)于4 ℃孵育24 h；室溫平衡30 min，PBS蕩洗3次、5 min/次；加入鼠單克隆二抗于室溫孵育30 min，PBS蕩洗3次、5 min/次；辣根過氧化物酶標(biāo)記液孵育15 min，PBS蕩洗3次、5 min/次；DAB染色，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯固定，中性樹膠封片。染色切片置于顯微鏡下，選取5個不同的觀察區(qū)域檢測CIRP和TLR4蛋白染色陽性細(xì)胞的數(shù)量(陽性染色的細(xì)胞在鏡下可見細(xì)胞質(zhì)呈彌漫性棕黃色信號)，根據(jù)免疫反應(yīng)評分評估染色強度和陽性細(xì)胞的比例，規(guī)定陽性細(xì)胞數(shù)≤20%、>20%分別計0、1分，染色強度無著色、淡黃色和棕黃色及以上分別計0、1及2分，合計2項得分后將0～1分定義為低表達(dá)，2～3分定義為高表達(dá)[11]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理。計數(shù)資料采用頻數(shù)(n)、率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行生存時間的比較，繪制生存曲線；采用時序檢驗(Log-ranktest)驗證組間生存曲線的統(tǒng)計學(xué)差異，采用雙變量相關(guān)分析進(jìn)行CIRP與TLR4的相關(guān)關(guān)系分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIRP及TLR4蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對照組樣本中沒有CIRP及TLR4蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞，CIRP和TLR4蛋白在高分化的OSCC組織切片中陽性染色數(shù)量較少，中分化組織切片次之，低分化組織切片中陽性染色數(shù)量最多，CIRP、TLR4陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量隨OSCC分化程度降低而增多，見圖1；研究組CIRP和TLR4蛋白陽性檢出率均明顯高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

對照組 研究組高分化 研究組中分化 研究組低分化注：紅色箭頭處表示CIRP及TLR4蛋白染色陽性的細(xì)胞。圖1 對照組和研究組口腔組織標(biāo)本中CIRP及TLR4表達(dá)(免疫組織化學(xué),×40)Fig.1 Immunohistochemical detection of CIRP and TLR4 in control group and experiment group(immunohistochemistry,×40)

表1 對照組和研究組樣本中CIRP與TLR4的表達(dá)Tab.1 Expression of CIRP and TLR4 in control group and experiment group

注：(1)與對照組比較，P<0.01。

2.2 CIRP、TLR4蛋白表達(dá)與臨床病理特征

OSCC組織樣本中CIRP蛋白表達(dá)水平與患者的TNM分期、臨床分期、組織病理學(xué)分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但患者的性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；TLR4表達(dá)水平與患者性別、TMN分期、臨床分期、組織病理學(xué)分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但年齡構(gòu)成上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 CIRP、TLR4表達(dá)與患者的預(yù)后

隨訪結(jié)果顯示，癌組織CIRP高、低表達(dá)患者分別死亡13例和8例，癌組織TLR4高、低表達(dá)患者死亡16例和5例，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，經(jīng)Log-rankχ2檢驗結(jié)果顯示，CIRP高表達(dá)患者術(shù)后的生存率明顯低于癌組織CIRP低表達(dá)患者，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.651，P=0.009)，見圖2A；癌組織TLR4高表達(dá)患者術(shù)后的生存率明顯低于癌組織TLR4低表達(dá)患者，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.473，P=0.004)，見圖2B。

表2 CIRP和TLR4蛋白不同表達(dá)者的臨床病理特征差異Tab.2 Differences in clinicopathological features of CIRP and TLR4 expression

注：A為CIRP，B為TLR4。圖2 CIRP和TLR4表達(dá)與患者預(yù)后的生存分析Fig.2 Survival analysis of patients prognosis

2.4 CIRP與TLR4表達(dá)的相關(guān)性

相關(guān)分析結(jié)果顯示，OSCC組織中CIRP與TLR4表達(dá)之間呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.356 8，P=0.023 8)。

3 討論

腫瘤微環(huán)境是由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞等一系列的間質(zhì)細(xì)胞組成[12]。在很多炎癥過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子可通過募集巨噬細(xì)胞(tumor-associated maerophages，TAMs)，從而形成腫瘤發(fā)生的微環(huán)境[13-14]。鑒于微環(huán)境對腫瘤發(fā)生的影響往往涉及2種或多種細(xì)胞間的相互作用，其中又包含多種自分泌及旁分泌細(xì)胞因子及相關(guān)信號通路的調(diào)控，因此機制較為復(fù)雜[15-16]。有研究表明低氧狀態(tài)可以刺激TAMs表達(dá)CIRP，采用免疫印跡和蛋白濃度檢測發(fā)現(xiàn)CIRP從細(xì)胞核-胞漿-細(xì)胞外的轉(zhuǎn)移過程，最終在血液中表達(dá)升高，從而誘發(fā)炎性反應(yīng)[17]。也有研究表明，這些疾病發(fā)生的共同途徑是通過TLR信號途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB促進(jìn)促炎因子的產(chǎn)生[18- 19]，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的TLR4也普遍表達(dá)于腫瘤細(xì)胞[20]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，研究組中2種蛋白的陽性染色細(xì)胞數(shù)量較多，且隨OSCC分化程度由高到低，2種蛋白的細(xì)胞染色數(shù)量逐漸增多。這些蛋白在不同組織中表達(dá)量的差異以及腫瘤組織中不同分化程度的表達(dá)差異支持了CIRP或TLR4基因在OSCC發(fā)生發(fā)展過程中具有一定生物學(xué)作用的假設(shè)。

TLR4在人類肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞過表達(dá)，同時TLR4的表達(dá)水平與頭頸鱗狀細(xì)胞癌的分期相關(guān)[21-24]。本研究結(jié)果顯示，OSCC組織樣本中，CIRP或TLR4高、低表達(dá)組間TNM分期、臨床分期、組織病理學(xué)分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；生存率分析結(jié)果表明CIRP或TLR4高表達(dá)組患者術(shù)后的生存率明顯低于低表達(dá)組患者(P<0.01)。這些結(jié)果支持了CIRP或TLR4確實是促進(jìn)OSCC腫瘤發(fā)生發(fā)展的這一假設(shè)。癌細(xì)胞的表型調(diào)控部分依賴于環(huán)境和基因組的變化，從而決定癌細(xì)胞的存活[2]。機制研究表明，CIRP的過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長速度降低和G1期延長[25]；CIRP基因通過激活細(xì)胞外信號和調(diào)節(jié)激酶來保護(hù)腫瘤壞死因子A誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[26]，CIRP蛋白通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2以避免經(jīng)歷原代細(xì)胞的衰老，其增殖率與致癌細(xì)胞相當(dāng)[26]；在腫瘤細(xì)胞中，TLR4基因與激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt途徑、上調(diào)IRAK-4表達(dá)、增加血管內(nèi)皮生長因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子密切關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致腫瘤形成[5]；相比之下，TLR4基因可下調(diào)X連鎖凋亡抑制蛋白和磷酸化蛋白激酶B的表達(dá)，從而消除紫杉醇對人卵巢腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展的抑制作用[27]。然而，所有的研究對CIRP和TLR4調(diào)控腫瘤發(fā)生的功能之間是否相互關(guān)聯(lián)的結(jié)論都不充分。本研究中患者OSSC組織CIRP與TLR4表達(dá)之間呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.356 8，P=0.023 8)，提示隨鱗癌惡性程度的增高，CIRP與TLR4的表達(dá)均明顯增高。提示CIRP有可能直接調(diào)節(jié)TLR4，通過多種癌癥信號通路激活腫瘤，從而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CIRP與TLR4在OSCC中呈高表達(dá)，且與患者TNM分期、臨床分期、組織病理學(xué)分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及較差的生存率有關(guān)聯(lián)。