李璨， 陸爽*， 吳君

(貴州醫(yī)科大學(xué) 感染病學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指無大量飲酒、排除病毒性肝炎等其他已明確的因素外，以肝細(xì)胞脂肪變性和蓄積為特征的綜合性病變[1]。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，NAFLD的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高趨勢(shì)，在我國，NAFLD的發(fā)病率將有可能超越病毒性肝炎，成為導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的主要原因[2]。非酒精性脂肪性肝纖維化是肝炎最終發(fā)展為肝癌的重要階段，但至今該疾病發(fā)生的機(jī)制尚不清楚，亦無確切有效的藥物對(duì)其進(jìn)行干預(yù)[3]，因此，積極探索NAFLD肝纖維化的發(fā)病機(jī)制及其可能的治療靶點(diǎn)的研究十分必要和迫切[4]。本課題組前期根據(jù)中藥各方劑組成藥材的功效，將丹參、黃芪、漢防己等9味中藥熬制為湯藥，應(yīng)用于臨床肝纖維化患者療效頗佳，后期經(jīng)加工制成復(fù)方制劑丹防膠囊。本研究對(duì)C57BL/6J小鼠采用高脂飲食喂養(yǎng)建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型[5]，造模同時(shí)給予丹防膠囊灌胃干預(yù)，于干預(yù)8周時(shí)觀察小鼠血糖、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平變化，同時(shí)取小鼠肝組織，檢測(cè)TGF-β1、Smad2、α-平滑肌(α-smooth muscle atin，α-SMA)蛋白和mRNA及col-Ⅳ mRNA表達(dá)，探索丹防膠囊干預(yù)小鼠酒精性脂肪性肝纖維化效果及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物 30只SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，8周齡，體質(zhì)量(18±1.4) g，購于貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；丹防膠囊購于貴陽天陽公司(尚未申報(bào)新藥)。本研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑 TGF-β1、Smad2、α-SMA抗體(Abcam ab53100、ab33875、ab32575)、GAPDH抗體(Cell Signaling 14C10)、二抗(中杉金橋ZB-2301)、TB Green premix Ex TaqII(Tli RNaseH plus)、引物(上海生工)、總RNA提取試劑盒(TianGen Dp 419)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 30只SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠按隨機(jī)數(shù)字法均分為正常組、模型組及丹防組。模型組及丹防組小鼠給予高脂飲食(60%脂肪及2%膽固醇)喂養(yǎng)8周[6]、建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，正常組小鼠給予普通飲食；造模同時(shí)給予丹防組1.22 g/20 g丹防膠囊灌胃[7]、正常組與模型組給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，共8周。第8周時(shí)，記錄小鼠體質(zhì)量，檢測(cè)血糖、TG、TC、ALT及AST；然后麻醉處死小鼠后記錄肝臟重量，并迅速取肝右葉相同部位固定行肝組織病理學(xué)檢查；取剩余肝組織，采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測(cè)TGF-β1、Smad2、α-SMA及col-Ⅳ mRNA表達(dá)水平，采用Western blot法檢測(cè)TGF-β1、Smad2及α-SMA蛋白水平。

1.2.2HE染色 取厚約4 μm的石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，蘇木素染色5 min，分化10 s后置于1×PBS 處理5 min；伊紅染色1 min，蒸餾水沖洗；經(jīng)脫水及透明后中性樹膠封片。200×鏡下觀察，采集圖片。

1.2.3油紅O染色 取厚約6 μm的冰凍切片經(jīng)蒸餾水漂洗，轉(zhuǎn)入60%異丙醇中漂洗20 s，進(jìn)行油紅O染色5～10 min；60%異丙醇洗掉染液，再經(jīng)蘇木素復(fù)染1 min、鹽酸酒精分化10 s及PBS漂洗10 min后，封片劑封片。200×鏡下觀察，采集圖片。

1.2.4天狼星紅染色 各組厚約6 μm的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后天狼星紅色液滴染1 h；流水沖洗去除殘夜，蘇木素復(fù)染8～10 min，1×PBS漂洗3次，5 min/次；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。200×鏡下觀察，采集圖片，通過Image Pro plus6.0測(cè)量出現(xiàn)纖維化部分的面積。

1.2.5Western blot 稱取20 mg小鼠肝組織，液氮研磨并加入裂解液提取肝組織蛋白，按4 ∶1加入5×蛋白上樣緩沖液，置于100 ℃金屬浴中加熱10 min；配制12% SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入一抗TGF-β1(1 ∶1 000)、Smad2(1 ∶1 500)、α-SMA(1 ∶3 000)、GAPDH(1 ∶6 000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(1 ∶5 000)常溫孵育50 min后曝光；以GAPDH為內(nèi)參照，經(jīng)Image J軟件分析各組蛋白條帶灰度值。

1.2.6RT-qPCR 嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取小鼠肝組織總mRNA，測(cè)定mRNA濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄后按PCR操作說明書進(jìn)行qPCR操作，反應(yīng)體系為上下游引物混合物2 μL、cDNA 1.6 μL、SYBR 10 μL、ROX Ⅱ 0.4 μL及 ddH2O 6 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，每組樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2-△△CT值計(jì)算基因表達(dá)量。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 RT-qPCR引物序列及產(chǎn)物大小Tab.1 RT-qpcr primer sequence and sequence fragment size

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)過程中，正常組小鼠正常飲食進(jìn)水，毛發(fā)整齊有光澤，精神佳；模型組毛發(fā)雜亂黯淡，體質(zhì)量增加，精神差；丹防組小鼠經(jīng)干預(yù)后，一般情況較模型組小鼠稍有改善。

2.2 體質(zhì)量、肝臟重量及血糖、TG、TC、ALT、AST水平

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、肝臟重量顯著增加，血糖、TG、TC、ALT及AST水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，丹防組小鼠體質(zhì)量、血糖、TG及TC水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)、肝臟重量及ALT、AST水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量、肝臟重量及血糖、TG、TC、ALT、AST水平變化Tab.2 Changes of body weight, liver weight, TG, TC, ALT and AST in each

注：(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

2.3 肝臟組織學(xué)

如圖1所示，HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰，無空泡結(jié)構(gòu)形成，未見炎性細(xì)胞浸潤。與正常組比較，模型組肝組織空泡形成明顯，伴有炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，丹防組中空泡結(jié)構(gòu)大小及數(shù)量減少。油紅染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織中未見脂滴積聚，模型組小鼠肝組織則出現(xiàn)大量脂滴積聚，脂肪變性明顯；與模型組比較，丹防組小鼠肝組織中脂滴蓄積減少。天狼星染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織中未見明顯組織纖維增生，模型組小鼠中肝組織中有大量紅色膠原纖維增生；與模型組比較，丹防組小鼠肝組織中紅色膠原纖維減少，肝纖維化程度減輕。

2.4 α-SMA、TGF-β1、Smad2蛋白和mRNA及col-Ⅳ mRNA表達(dá)水平

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織勻漿中α-SMA 、TGF-β1、Smad2蛋白和mRNA，col-Ⅳ mRNA表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，丹防組小鼠肝組織勻漿中α-SMA 、TGF-β1、Smad2蛋白和mRNA，col-Ⅳ mRNA表達(dá)水平均均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 各組小鼠肝臟組織學(xué)變化(HE、油紅及天狼星紅染色，×200)Fig.1 Liver histopathological changes in each group(HE, ORO and Sirius Red, ×200)

注：A為α-SMA、TGF-β1及Smad2蛋白表達(dá)(Western Blot)，B為α-SMA、TGF-β1及Smad2蛋白表達(dá)的直條圖，C為col-Ⅳ、α-SMA、TGF-β1及Smad2 mRNA表達(dá)直條圖；(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。圖2 各組小鼠肝組織勻漿α-SMA、TGF-β1、Smad2蛋白和mRNA及col-Ⅳ mRNA表達(dá)Fig.2 Expression of α-SMA, TGF-β1, Smad2 protein and mRNA and col-Ⅳ mRNA in liver tissues of mice

3 討論

目前，NAFLD發(fā)病機(jī)制尚不清楚，研究認(rèn)為NAFLD和其相關(guān)肝纖維化的發(fā)生可能與遺傳代謝、環(huán)境飲食、胰島素抵抗等密切相關(guān)，以肝細(xì)胞存在廣泛脂肪浸潤和發(fā)生炎癥為主要特征[8-11]。近年來，隨著人們生活質(zhì)量的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD的發(fā)病人群傾向于年輕人，且患病率呈逐年上升趨勢(shì)[12-13]，很有可能成為肝臟疾病中發(fā)展為肝硬化甚至肝癌的主要原因。此外，NAFLD還被認(rèn)為是心血管疾病、2型糖尿病和終末期腎病的一大危險(xiǎn)因素[14]。針對(duì)NAFLD的治療，目前以適當(dāng)運(yùn)動(dòng)、清淡飲食、禁酒等為主，輔以保肝降酶、降糖降脂的治療方案為主，但至今尚無確切有效的藥物用于臨床治療NAFLD及相關(guān)肝纖維化[15-17]。

在中醫(yī)學(xué)中，NAFLD為本虛標(biāo)實(shí)，其治療方法為行氣疏肝、活血化瘀、化痰利濕、健脾補(bǔ)腎[18]。而丹防膠囊中所包含的丹參、黃芪、漢防己、鱉甲、土鱉、當(dāng)歸、龜板、三七及銀杏葉等成分具有活血祛瘀、補(bǔ)中益氣、利濕退黃、改善微循環(huán)、軟堅(jiān)散結(jié)、退黃降酶等作用[19-23]。本研究擬探索丹防膠囊對(duì)小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化的干預(yù)效果及其可能作用機(jī)制。

TG、TC的異常主要反應(yīng)機(jī)體血脂是否異常，而ALT、AST在肝細(xì)胞受損時(shí)釋放入血，是反應(yīng)肝功能是否異常的敏感指標(biāo)。α-SMA是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC )活化的標(biāo)志，Ⅳ型膠原(collagen-Ⅳ，col-Ⅳ)合成異常將導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積，逐步發(fā)展為肝纖維化。

通過稱量小鼠體質(zhì)量、肝臟重量、血糖和TG、TC、ALT、AST及觀察組織病理學(xué)改變發(fā)現(xiàn)：正常組肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰，無空泡結(jié)構(gòu)形成，未見脂滴蓄積及炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)未見膠原纖維增生。與正常組比較，模型組肝臟組織空泡形成明顯，大量脂滴蓄積伴炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)見大量膠原纖維增生。同時(shí)，小鼠體質(zhì)量、肝臟重量、血糖及TG、TC、ALT、AST含量明顯升高(P<0.05)。此外，肝組織α-SMA、col-Ⅳ表達(dá)升高(P<0.05)，提示非酒精性脂肪性肝纖維化模型建立成功。與模型組比較，經(jīng)丹防膠囊干預(yù)后，肝組織空泡結(jié)構(gòu)及脂滴蓄積減少，肝纖維化程度減輕；小鼠肝臟重量、ALT、AST減輕(P<0.05)，肝組織中α-S MA、col-Ⅳ表達(dá)下降(P<0.05)，但體質(zhì)量、TG、TC含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示丹防膠囊對(duì)非酒精性脂肪性肝纖維化有一定的干預(yù)作用，并在減輕肝臟重量及改善肝功能異常狀態(tài)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，可減輕肝臟損傷，但對(duì)體質(zhì)量、TG、TC的改善并不理想，達(dá)不到血脂平衡的作用。

研究認(rèn)為，TGF-β/smad信號(hào)通路在肝纖維化的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及遷移等作用，已證實(shí)TGF-β/smad可介導(dǎo)NAFLD相關(guān)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[24]。該通路主要包括細(xì)胞外TGF-β1、胞膜上的TGF-β受體(TβR)及胞內(nèi)的Smad蛋白。當(dāng)肝細(xì)胞受外界刺激后，TGF-β1活化與胞膜上的TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ結(jié)合，激活下游因子Smad2、Smad3，啟動(dòng)TGF-β/smad通路，從而活化HSC分化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ，col Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ，col Ⅲ)、colⅣ含量增加，致使大量ECM沉積，最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[25-26]。結(jié)合本研究Western blot及RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與正常組相比，模型組中TGF-β1、Smad2基因及蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)，驗(yàn)證了TGF-β1、Smad2過表達(dá)促進(jìn)了肝纖維化的發(fā)生進(jìn)程。與模型組相比，丹防組小鼠肝組織中TGF-β1、Smad2基因及蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，提示丹防膠囊對(duì)非酒精性脂肪性肝纖維化的干預(yù)作用可能與降低肝組織中TGF-β1、Smad2的表達(dá)，從而抑制TGF-β/smad通路激活參與肝纖維化有關(guān)。

綜上，丹防膠囊對(duì)非酒精性脂肪性肝纖維化的具有一定的治療效果，可作為非酒精性肝纖維化的潛在治療藥物，丹防膠囊可降低非酒精性脂肪性肝纖維化的肝臟重量、ALT、AST水平，其機(jī)制可能與降低肝組織中TGF-β1及Smad2的表達(dá)有關(guān)。