馬歡， 高楠楠， 陳俞如， 肖瑛,2， 潘艷伶,3**

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學附院， 貴州 貴陽 550004)

全世界有超過4.15億人患有糖尿病，據(jù)估計到2040年發(fā)病率將增加到6.42億[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種常見的糖尿病類型，是一類以胰島素分泌缺乏和(或)機體產(chǎn)生胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的常見內(nèi)分泌代謝性疾病[2]，占全球糖尿病病例的90%～95%[3]。T2DM的主要并發(fā)癥包括糖尿病腎病、糖尿病周圍神經(jīng)病變、心血管疾病及肥胖[4-5]，目前臨床應用的主要藥物是胰島素及其分析物(磺酰脲類、格列奈類、雙胍類及葡萄糖苷酶抑制劑等)，盡管這些藥物能有效的起到降血糖作用，但也存在肝毒性、腎毒性及低血糖反應等各種副作用[6]。有研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信號通路異常是T2DM發(fā)生的重要原因[7]，本課題組在臨床及前期實驗中證實經(jīng)驗方“糖通飲”可有效降低T2DM患者或T2DM大鼠的空腹血糖(FBG)[8-10]，本研究通過觀察大鼠胰腺組織中PI3K-AKT信號通路關鍵信號因子AKT和胰島素受體底物1(insulin receptor substrate，IRS-1)的變化，同時檢測大鼠體質(zhì)量和空腹血糖(FBG)，探討糖通飲的降糖機制，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，許可證號SCXK(軍)2012-0011；大鼠飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學臨床醫(yī)學實驗中心動物房，自由攝水攝食，室溫22～26 ℃，濕度40%～60%。

1.1.2藥物與試劑 糖通飲(方藥組成為生地黃12 g、山藥15 g、山茱萸15 g、茯苓15 g、澤瀉9 g、丹皮10 g、黃芪15 g、丹參15 g、地骨皮15 g及草決明15 g)由貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中藥房提供，鏈脲佐菌素(STZ，北京索萊寶科技有限公司，批號615K0321)、兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號K187913H)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，批號AI40772A)。

1.2 方法

1.2.1T2DM模型制備 50只SPF級SD雄性大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，將空腹體質(zhì)量值由高到低排列，采用隨機數(shù)字表法，分取大鼠10只作為對照組給予基礎飼料喂養(yǎng)、其余40只給予高脂飼料(普通飼料58%、精煉豬油20%、糖20%及膽固醇2%，由貴州醫(yī)科大學動物房提供)喂養(yǎng)8周(造模誘發(fā)IR)；2組大鼠禁食不禁水12 h，稱取體質(zhì)量后，造模組大鼠給予1%STZ的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5)按20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg腹腔注射、共3次，對照組則注射相應劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；注射72 h后尾靜脈采靜脈血檢測大鼠餐后隨機血糖≥16.7 mmol/L[11]，且尿量和飲水量明顯增多者為T2DM成模大鼠。

1.2.2分組與干預方法 將40只糖尿病成模大鼠按餐后隨機血糖由高到低排序，采用隨機數(shù)字表法，分為模型組，糖通飲低、中、高劑量組各10只，分別給予糖通飲水煎劑10、20及30 mg/kg灌胃，對照組與模型組給予等體積雙蒸水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃8周。實驗過程中，因灌胃或大鼠高血糖等原因死亡7只，其中模型組、低劑量組及中劑量組各2只，高劑量組1只。

1.2.3標本采集 給藥8周時，所有大鼠禁食不禁水12 h，稱取體質(zhì)量，尾靜脈采血，采用葡萄糖氧化酶法測定FBG；腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉大鼠后處死，快速開腹摘除胰腺組織分別置于-80 ℃冰箱和4%多聚甲醛中，以備檢測胰腺組織中PI3K-AKT通路相關因子AKT、IRS-1 mRNA與蛋白的表達。

1.2.4大鼠胰腺組織中AKT、IRS-1 mRNA的表達 采用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法，提取胰腺組織總RNA(離心柱型動物組織總RNA提取試劑盒)，驗證RNA純度，使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；按照qPCR試劑盒操作說明書配置反應體系，在qPCR儀以3步法進行PCR反應，40個循環(huán)后采集熒光信號，實驗重復3次，PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，見表1。采用熒光定量PCR相對定量分析法2-ΔΔCT法進行統(tǒng)計分析。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequence of PCR primers

1.2.5胰腺組織中AKT和IRS-1蛋白表達 采用免疫組織化學法檢測，取固定好的石蠟切片(5 μm)常規(guī)脫蠟至水，滴加3%的雙氧去離子水、抗原熱修復、滴加正常山羊血清封閉液，勿洗。滴加AKT和IRS-1一抗(1 ∶150)，4 ℃冰箱過夜，滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育1 h。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復染脫水透明中性樹膠封片，鏡檢，觀察AKT和IRS-1蛋白陽性表達，以細胞內(nèi)出現(xiàn)的淡黃色至棕黃色顆粒作為陽性細胞，陽性細胞數(shù)目越多，蛋白表達量越高。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠體質(zhì)量

干預前，與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠體質(zhì)量均無明顯差異(P>0.05)；給藥2周和4周時，與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著升高(P<0.05)，糖通飲低、中劑量組有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；給藥8周時，與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠體質(zhì)量均顯著升高(P<0.01)，各劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：(1)與對照組比較，P<0.01；與模型組比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01。 圖1 糖通飲對各組大鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of Tangtongyin formula on body mass of rats

2.2 FGB

給藥前，與對照組比較，模型組大鼠FGB明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠FGB差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給藥8周時，與對照組比較，模型組大鼠FGB明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠FGB明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，各劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠給藥前后FBG水平的比較Tab.2 Fasting blood glucose before and after drug intervention in rats in each

注：(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01。

2.3 大鼠胰腺組織AKT及IRS-1 mRNA表達

與對照組比較，模型組大鼠胰腺組織AKT及IRS-1 mRNA表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲高劑量組大鼠胰腺組織AKTmRNA表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，糖通飲低、中劑量組有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，糖通飲中、高劑量組大鼠胰腺組織IRS-1 mRNA均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，糖通飲低劑量組有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：(1)與對照組比較，P<0.01；與模型組比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01。 圖2 糖通飲對大鼠胰腺組織AKT及IRS-1 mRNA表達的影響Fig.2 Effect of Tangtongyin on AKT and IRS-1 signal molecule mRNA in rat pancreas

2.4 大鼠胰腺組織AKT及IRS-1蛋白表達

與對照組比較，模型組大鼠胰腺組織AKT、IRS-1蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲高劑量組大鼠胰腺組織AKT蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，糖通飲低、中劑量組有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠胰腺組織IRS-1 的蛋白表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但各劑量組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：A為免疫組織化學染色結果，B為AKT蛋白直條圖，C為IRS-1蛋白直條圖；(1)與對照組比較，P<0.01；與模型組比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01。 圖3 糖通飲對T2DM大鼠胰腺組織AKT、IRS-1蛋白表達的影響(免疫組織化學，×400)Fig.3 Effect of Tangtongyin on AKT and IRS-1protein expression in pancreatic tissues of rats with T2DM(immunohistochemistry，×400)

3 討論

IR是指胰島素促進葡萄糖攝取和利用的能力下降，IR的發(fā)生可引起糖代謝紊亂[12]。在T2DM患者中，IR的發(fā)生率超過80%，因此，改善T2DM患者的IR狀態(tài)是治療T2DM的有效途徑[13]。全國名老中醫(yī)凌湘力教授創(chuàng)制的經(jīng)驗方“糖通飲”是在六味地黃丸的基礎上換熟地黃為生地黃，并配伍了黃芪、丹參、地骨皮和草決明，該方根據(jù)T2DM氣陰兩虛為本、瘀血阻絡為標的基本病機特點創(chuàng)制而成，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀的功效[10]。據(jù)現(xiàn)代藥理學研究證實，黃芪中的黃芪多糖是天然的血糖調(diào)節(jié)劑，具有降糖的作用[14]；丹參可降脂降壓[15]，地骨皮、草決明可促進胰島β細胞分泌胰島素，有降低血糖的作用[16]。此方在臨床治療T2DM的運用中也取得頗為滿意的成果。本研究結果顯示，糖通飲可明顯降低T2DM大鼠FBG值，提示糖通飲可以改善大鼠的高糖狀態(tài)；糖尿病模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低，可能是由于IR，從而使外周靶組織對葡萄糖的攝取和利用減少，導致蛋白質(zhì)和脂肪作為能量物質(zhì)加速分解，促使體質(zhì)量減輕，糖通飲可增加T2DM大鼠的體質(zhì)量，此作用可能與改善IR有關。

PI3K-AKT信號通路是胰島素信號轉(zhuǎn)導的主要途徑，也是調(diào)控血糖的主要信號通路[10]。正常的胰島素PI3K-AKT信號通路不僅可減輕IR，還可以促進外周靶組織攝取葡萄糖，對胰島β細胞分泌胰島素具有重要作用[17]。當此通路上任何一個因子含量或代謝、分布發(fā)生異常都可能導致體內(nèi)IR的形成，最終誘發(fā)T2DM。PI3K-AKT信號通路通過相關因子IRS-1和AKT來調(diào)節(jié)胰島素在體內(nèi)的代謝，可保持血糖的平穩(wěn)。IRS-1是胰島素受體后水平的關鍵分子，介導胰島素信號傳導，其表達量和磷酸化水平是胰島素正常產(chǎn)生生物學效應的關鍵[18]。IRS-1上絲氨酸磷酸化可以負反饋抑制IRS-1的活性，與IR的發(fā)生有密切關系[19]。AKT是胰島素信號傳導中重要的下游分子，以磷酸化形式被活化，活化的AKT可促進機體糖原合成和葡萄糖轉(zhuǎn)運，增加機體對胰島素的敏感性，降低血糖水平，是使胰島素最終發(fā)揮效應的關鍵分子[20]。T2DM由于胰島素受體表達水平下降，使IRS-1酪氨酸磷酸化水平降低，干擾了PI3K的活化，也因此影響了AKT的活化，從而使胰島β細胞受損，凋亡增加，胰島素分泌水平下降，出現(xiàn)血糖升高以及T2DM的一系列表現(xiàn)[21]。激活PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導通路可減輕IR和胰島β細胞的損傷，對胰島β細胞具有保護作用[19]。糖通飲干預后T2DM大鼠胰腺組織AKT、IRS-1 mRNA和蛋白的表達量顯著升高，表明糖通飲可能通過激活PI3K-AKT信號通路，從而減輕胰島β細胞損傷和改善IR。

綜上，本研究表明，糖通飲可改善高脂飼料聯(lián)合STZ誘導的T2DM大鼠胰腺損傷，增加T2DM大鼠體質(zhì)量、緩解FBG的升高，還可通過上調(diào)胰腺PI3K-AKT信號通路相關因子IRS-1、AKT mRNA和蛋白的表達，激活大鼠胰腺PI3K-AKT信號通路，從而延緩胰島β細胞功能衰退，保護胰島β細胞，改善IR，降低血糖。本研究還發(fā)現(xiàn)，高劑量組的糖通飲治療T2DM的療效最佳，為優(yōu)化臨床用藥劑量的選擇提供了實驗依據(jù)。