張營， 吳晟， 鮑海龍， 劉興德

(1．貴州醫(yī)科大學附院 心內科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州中醫(yī)藥大學， 貴州 貴陽 550025)

研究表明，血漿低密度脂蛋白(LDL-C)的高水平表達不僅僅影響冠心病，還可以增加缺血性腦卒中的風險[1-3]。全球人群中肥胖、高LDL-C以及相關疾病發(fā)病率、致死率越來越高[4-5]，降LDL-C治療成為一個值得重視的問題。2003年關于家族性高膽固醇血癥的大型全基因組關聯(lián)分析(GWAS)的研究表明，前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是影響血脂代謝的關鍵基因[6]，其抑制劑可作為降低LDL-C藥物被應用于臨床。臨床試驗表明，不管單獨應用、還是聯(lián)合應用PCSK9抑制劑可降低45%～60%的LDL-C水平[7-8]。目前關于PCSK9基因非編碼區(qū)的基因多態(tài)性與血漿LDL-C水平、以及冠心病風險的研究并不多，本研究對PCSK9基因5′UTR區(qū)基因多態(tài)性進行分析，探討基因多態(tài)性與血漿LDL-C水平及冠心病風險的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象 96名于2014年5月-2015年10月來自武漢同濟醫(yī)院心內科住院冠心病患者為疾病組。冠心病診斷標準:(1)冠狀動脈造影評估至少一段冠狀動脈(右冠狀動脈、旋支或前降支)>50%狹窄，(2)有典型的心肌酶學升高(肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、肌酸激酶)、典型心電圖改變和臨床癥狀，(3)有冠狀動脈搭橋術或經皮冠狀動脈介入治療的病史；排除有先天性心臟病、心肌病、瓣膜病和腎臟或肝臟疾病，嚴重腫瘤病史的患者。選取同期96例空腹血脂(總膽固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白)正常的體檢者為對照組, 入選人群未使用降脂藥物、重大疾病或病態(tài)肥胖(體質量指數(shù)>30 kg/m2)；疾病組患者和對照組均為漢族血統(tǒng)，并提供書面知情同意書，本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑 HEK293T細胞系、L02細胞由華中科技大學附屬同濟醫(yī)院高血壓研究所饋贈，PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、dNTP、5×PrimeSTAR GXL緩沖液購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司(takara中國)，引物由武漢天一輝遠公司合成，DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，pGL3-basic熒光報告基因載體購自武漢啟動子生物有限公司，轉染試劑Lipofectamine2000購自invitrogen公司，雙熒光素酶報告檢測試劑購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1標本采集及DNA提取 抽取疾病組及健康對照組人群外周靜脈血2 mL，采用天根DNA提取試劑盒提取外周血白細胞DNA，放入-20°冰箱保存。

1.2.2信息學分析 使用千人基因組數(shù)據(jù)庫(http://grch37.ensembl.org)分析中國漢族人群(han chinese in beijing, southern han chinese,共計208人)PCSK9 基因5′UTR區(qū)基因多態(tài)性。

1.2.3熒光報告基因實驗 采用聚合酶鏈反應(PCR)從人DNA中擴增包含野生型等位基因(rs45448095-C)的362 bpPCSK9序列，其中Mlu1或HindIII限制性內切酶切位點分別位于5′和3′端，PCR產物經酶切后插入pGL3熒光素酶報告載體。利用攜帶突變等位基因的引物進行PCR重疊，得到包含rs45448095-T序列的突變載體(引物F為 GTCCGATGGGGCTCTGGTG, 引物R為GAGGGCCAGGGGAGAGGTT)。HEK293T細胞和L02細胞接種在24孔板中，帶細胞密度至1×106細胞/孔時，將PGL3-T(rs45448095-T)或PGL3-C(rs45448095-C)400 ng與Renilla熒光素酶質粒50 ng共轉染，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗細胞，用被動裂解緩沖液裂解細胞(Promega, WI, USA)，反復凍融3遍保證細胞充分裂解。使用熒光素酶活性發(fā)光計(SIRIUS, Pforzheim, Germany)測量熒光素酶的表達水平。每組選取6個副孔，重復3次獨立實驗。

1.2.4rs45448095位點檢測 從人血DNA中擴增362 bp片段,采用Sanger法完成位點測序，方法參考文獻[9]。Applied Biosystems 3130XL毛細管測序儀(applied biosystems,foster city,CA)分析PCR片段中熒光染料終結者循環(huán)產物；通過Chromas程序(technelysium Pty)鑒定了假定的多態(tài)性。結果由2名獨立觀察員證實。所有已鑒定的變異均經重復測序證實。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 PCSK9基因5′UTR信息學分析

千人基因組數(shù)據(jù)庫(http://grch37.ensembl.org)中顯示中國漢族人群(包含中國北京漢族人和中國南方漢族人，共計208人)位于PCSK9基因5′UTR區(qū)上的SNP，只有一個常見SNP(Common SNP)，最小等位基因頻率(MAF)>0.05，即rs45448095(MAF為 0.095)。

2.2 構建PCSK9基因5′UTR熒光素酶報告基因載體

PCSK9基因5′UTR編碼序列全長約為362 bp( NM_174936.3)，經PCR擴增后，在2%瓊脂糖凝膠電泳中顯示362 bp處有明顯的目的條帶，電泳結果與理論結果一致，測序結果比對與原始序列吻合(圖1)。

注：A為瓊脂糖凝膠電泳結果，Marker為標準分子量參照物，1～3為PCR擴增樣本；B為PCSK9 基因5′UTR區(qū)起始段DNA序列；C為PCSK9基因 5′UTR區(qū)終末段DNA序列。圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定及DNA測序驗證PCSK9基因 5′UTR區(qū)Fig.1 The PCSK9 gene was detected by agarose gel electrophoresis

2.3 基因多態(tài)性對 PCSK9 5′UTR活性的影響

在L02細胞中，PGL3-T(rs45448095-T)的熒光素酶活性較PGL3-C(rs45448095-C)顯著降低(-54.1%±2.3%,P<0.000 1)，HEK293T細胞中PGL3-T與PGL3-C亦出現(xiàn)相同的變化(-47.6%±1.4%,P<0.000 1)。圖2。

注：A為L02細胞，B為HEK293T細胞；(1)與PGL3-C比較， P < 0.000 1。圖2 293T細胞和L02細胞中rs45448095C/T的熒光報告基因結果Fig.2 Luciferase assay of expression of PCSK9 5'UTR constructs carrying rs45448095C/T in LO2 cells and 293T cells

2.4 rs45448095測序結果

Sanger法測序可以明顯分辨rs45448095基因多態(tài)性，見圖3。對照組人群rs45448095頻率為0.13，符合HW平衡；疾病組人群的rs45448095頻率為0.115，符合HW平衡；2組人群的基因型分布差異無統(tǒng)計學意義(P=0.072)，見表1。

圖3 rs45448095測序結果Fig.3 DNA sequences results of rs45448095

表1 兩組人群的rs45448095基因多態(tài)性分布及等位基因頻率比較Tab.1 The distribution of rs45448095 gene polymorphisms and their frequencies

2.5 對照組人群rs45448095不同基因型與血漿血脂水平關系

對照組人群的rs45448095不同基因型分布影響LDL水平，每一個基因型的改變，減少血漿LDL水平的風險的β(SE)為-0.353(0.158)，t=-2.237，P<0.05。不同基因型對血漿TG、TC、HDL水平無影響(P>0.05)，見表2。

表2 對照組人群rs45448095不同基因型對血漿血脂水平的影響Tab.2 Association of rs45448095 genotype with plasma lipid levels in control group

2.6 rs45448095不同基因型對冠心病相關危險度分析

對rs45448095基因多態(tài)性與冠心病風險進行分析。采用不同遺傳特性模型分析結果顯示,隱性模型(CC+CT vs TT)、顯性模型(CC vs CT+TT)、加性模型(CC vs CT vs TT)，rs45448095基因多態(tài)性皆對冠心病風險無影響(P>0.05)，見表3。

表3 rs45448095不同基因型對冠心病風險的影響Tab.3 Association between rs45448095 variant with CHD

3 討論

本研究結果顯示，結合千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中常見的SNP(rs45448095)，對該SNP位點進一步進行簡單功能驗證，發(fā)現(xiàn)突變型(rs45448095-T)明顯影響PCSK9基因的表達活性；這種影響不管是在肝細胞系(L02)中，還是腎臟細胞系(293T)中都存在；同樣人群驗證中，亦發(fā)現(xiàn)rs45448095-T可以減低血漿LDL-C水平，但并未影響其他血脂水平以及冠心病風險。

2003年發(fā)現(xiàn)PCSK9后，多項研究表明位于PCSK9基因碼區(qū)上的錯義突變、同義突變或多個突變組合的單體型都與血漿LDL-C水平強相關[10-11]。雖然沒有過多的研究表明，這些突變是如何調節(jié)血漿LDL-C水平。但所有研究結果都證實，不管是PCSK9基因上的功能獲得型突變還是功能缺失型突變都會影響LDL-C水平[6,12]。后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn)低血漿PCSK9水平人群同樣存在低血漿LDL-C水平[13]。由此可以認可PCSK9與血漿LDL-C的關系。鑒于此，研究工作者針對LDL-C代謝異常的患者研發(fā)了新的藥物——PCSK9單克隆抗體、PCSK9抑制劑。與設想中一樣，臨床試驗結果表明，抑制PCSK9后取得很好的降低LDL-C效果[14-15]。也有部分研究表明PCSK9上的突變在影響LDL-C后，可以影響冠心病或是缺血性卒中的風險[16-17]。雖然關于PCSK9上的基因突變與LDL-C的關系的研究很多，但大多研究都是位于編碼區(qū)上的基因突變，關于基因領域研究新熱點——非編碼區(qū)上的基因突變未受到太多關注。而且深入探討PCSK9基因突變影響血脂水平機制的研究不多，尤其是關于PCSK9可受什么調控繼而影響LDL-C的研究并不多。越來越多的研究證實，非編碼區(qū)上的突變是可結合調控因子繼而對基因進行調控達到功能確實型或者功能缺失型突變，繼而影響基因的變達和影響血脂水平亦或疾病風險[18-19]。

本研究發(fā)現(xiàn)首次證實，PCSK9基因5′UTR區(qū)的基因突變——rs45448095，是一個功能缺失型突變。細胞熒光報告基因實驗顯示rs45448095-T突變后明顯減低了PCSK9表達活性，且在多個不同細胞系皆出現(xiàn)此結果。假設可能存在一個多組織高表達的調控因子可結合在此處調控PCSK9的表達，基因多態(tài)性破壞了這種結合。就像本實驗研究者之前曾經證實的ChREBP基因3′UTR區(qū)基因多態(tài)性破壞了與miRNA的結合位點繼而影響ChREBP的表達[9]。不過遺憾的是，本研究曾運用多種生物信息學的方法并沒有預測到這個調控因子，無法證實實驗假設。與此同時，人群研究表明rs45448095-T突變影響人群血漿LDL-C水平，未影響TG、TC及HDL-C水平。表明PCSK9上的功能缺失型基因突變主要降低人群血漿LDL-C水平，這與前人研究一致[20]。但不同于前人的是，本研究沒有證實這種突變帶來了LDL-C降低的突變可降低冠心病風險。不過鑒于本研究的樣本量過小、功能實驗不夠嚴謹，該研究無法充分證實rs45448095是否影響冠心病風險，rs45448095-T突變型是否具有類似PCSK9抑制劑的作用。后續(xù)仍需要更大的臨床研究以及更多的功能實驗證實研究者的假想。但本研究為后續(xù)研究提供了一個新方向，亦降脂治療提供了一個新可能。

綜上所述，PCSK9基因5′UTR區(qū)rs45448095基因多態(tài)性可以顯著降低中國漢族人血漿LDL-C水平，本研究進一步證實了PCSK9表達與LDL-C的關系，可為PCSK9抑制劑的功效研究提供依據(jù)。