林晶晶,孫培鳴,張 濤,徐冰心,段育忠,周金蓮,楊鶴鳴,李成林,崔 彥

隨著載人航天事業(yè)的迅猛發(fā)展，失重影響航天員健康的問題受到廣泛關(guān)注。航天實(shí)踐和研究證明，失重環(huán)境會(huì)導(dǎo)致機(jī)體各系統(tǒng)器官產(chǎn)生一系列病理生理變化[1-2]。NASA研究指出，創(chuàng)傷是失重環(huán)境中影響航天員身心健康及任務(wù)執(zhí)行能力的最大威脅，應(yīng)給予最高等級的關(guān)注[3]。研究失重環(huán)境對創(chuàng)傷及其修復(fù)過程的影響具有重要而深遠(yuǎn)的意義[4]。在皮膚創(chuàng)面愈合過程中，角質(zhì)細(xì)胞是創(chuàng)傷修復(fù)的重要細(xì)胞，其分泌的相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)創(chuàng)傷修復(fù)進(jìn)程[5]。本實(shí)驗(yàn)釆用微重力細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(the rotary cell culture system， RCCS)研究模擬失重對人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)創(chuàng)傷修復(fù)蛋白表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)的影響，為航天醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的醫(yī)監(jiān)醫(yī)保工作提供理論參考。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 HaCaT細(xì)胞株(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)，微載體Cytodex-3(GEHealthcare， USA)，RCCS(Synthecon， USA)，10 ml高截面縱橫比容器(high aspect ratio vessel， HARV， Synthecon， USA)，透射電鏡(Tecnai Spirit， USA)，小鼠抗人熱休克蛋白70(HSP70)單克隆抗體，兔抗人基質(zhì)金屬白酶-9(MMP-9)單克隆抗體，小鼠抗人凋亡蛋白Caspase-3單克隆抗體。

1.2HaCaT細(xì)胞株培養(yǎng)擴(kuò)增和實(shí)驗(yàn)分組 HaCaT細(xì)胞株以含10%胎牛血清及雙抗(100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右進(jìn)行傳代。將HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為模擬微重力(simulated microgravity group， SMG)組和正常重力對照(normal gravity group， NG)組，SMG組HaCaT細(xì)胞與微載體共同置入HARV在RCCS中培養(yǎng)。NG組HaCaT細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中正常培養(yǎng)。

1.3建立RCCS微載體培養(yǎng)體系 將準(zhǔn)備好的Cytodex-3微載體置入HARV,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將培養(yǎng)好的HaCaT細(xì)胞以2×106密度接種于HARV，加滿上述培養(yǎng)基，用5 ml注射器排氣泡后放入RCCS。RCCS中初始轉(zhuǎn)速設(shè)置為12 r/min，12 h后設(shè)為14 r/min，之后密切觀察，依培養(yǎng)狀態(tài)調(diào)整轉(zhuǎn)速，使微載體能懸浮在培養(yǎng)液中，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)HaCaT細(xì)胞對數(shù)生長期生長曲線和倍增時(shí)間，設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間分別為32、36、42 h。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測 HSP70、MMP-9和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平檢測主要步驟如下：收集2組培養(yǎng)32、36、42 h細(xì)胞，提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，將cDNA樣品稀釋8倍作為模板上機(jī)檢測，分析2組基因表達(dá)情況，根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)PCR引物。PCR引物由上海生工股份有限公司合成，見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列表

注：PCR為聚合酶鏈反應(yīng)，HSP70為熱休克蛋白70，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9，Caspase-3為凋亡蛋白

1.5蛋白免疫印跡法分析 收集2組培養(yǎng)32、36、42 h細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗3遍，加400 μl裂解液于冰上裂解30 min，收集細(xì)胞碎片和裂解液，12 000 r/min離心30 min，轉(zhuǎn)移上清。測定蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗4℃孵育過夜(≥18 h)，TBST洗滌3遍，加入二抗室溫?fù)u床孵育2 h。TBST洗膜3遍后加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.6透射電鏡 RCCS培育42 h后，吸出HARV中混合液體于15 ml離心管中，靜置5 min棄上清，PBS洗滌2遍，每個(gè)樣本加0.25%胰酶消化液2～3 ml，37℃消化10 min后，再以1000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。加入含血清培養(yǎng)基終止消化作用，輕輕吹打，使細(xì)胞從微載體上脫落，70 μm細(xì)胞篩過濾，獲得單細(xì)胞懸液后再次RCCS培育42 h，吸出HARV中混合液體于15 ml離心管中，靜置5 min，棄上清，PBS洗滌2遍，每個(gè)樣本加0. 25%胰酶消化液2～3 ml，37℃消化10 min，1000 r/min離心5 min。加入含血清培養(yǎng)基終止消化作用，輕輕吹打，使細(xì)胞從微載體上脫落，再通過70 μm細(xì)胞篩過濾，獲得單細(xì)胞懸液后離心沉淀細(xì)胞團(tuán)。NG組細(xì)胞按正常消化步驟，將離心后細(xì)胞團(tuán)分別收集到1.5 ml EP管中。按順序用2.5%戊二醛和1%鋨酸室溫下固定2 h，乙醇梯度脫水，用Epon 812純樹脂包埋并切片，透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并照相。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR檢測結(jié)果 SMG組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)32、36 h HSP70 mRNA表達(dá)水平，培養(yǎng)32、36和42 h MMP-9 mRNA及培養(yǎng)36 h Caspase-3 mRNA表達(dá)水平均高于NG組(P<0.05)。見表2。

表2 2組HaCaT細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間培養(yǎng)后創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)基因相對表達(dá)量

注：SMG組為模擬微重力組，NG組為正常重力對照組；HSP70為熱休克蛋白70，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9，Caspase-3為凋亡蛋白；與NG組比較，aP<0.05

2.2蛋白免疫印跡檢測結(jié)果 以目標(biāo)檢測蛋白與相應(yīng)內(nèi)參β-actin蛋白條帶的吸光度值的比值(HSP70/β-actin、MMP-9/β-actin和Caspase-3/β-actin)代表該蛋白的相對表達(dá)量。SMG組細(xì)胞培養(yǎng)32、36和42 h后HSP70和MMP-9蛋白表達(dá)趨勢與相應(yīng)蛋白mRNA表達(dá)一致，而Caspase-3蛋白表達(dá)趨勢與相應(yīng)mRNA存在一定差異。見圖1。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

1～6分別代表SMG組32 h、NG組32 h、SMG組36 h、NG組36 h、SMG組42 h、NG組42 h對應(yīng)蛋白的電泳條帶；SMG組為模擬微重力組，NG組為正常重力對照組；HSP70為熱休克蛋白70，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9，Caspase-3為凋亡蛋白

2.3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) NG組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，胞膜、核膜結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴清晰可見。SMG組為模擬微重力環(huán)境下培養(yǎng)42 h后的HaCaT細(xì)胞，可見細(xì)胞有皺縮表現(xiàn)，細(xì)胞器較難辨認(rèn)，胞漿內(nèi)存在較多空泡，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)有染色質(zhì)凝結(jié)現(xiàn)象，細(xì)胞線粒體嵴出現(xiàn)斷裂，結(jié)構(gòu)模糊，部分線粒體出現(xiàn)空泡。見圖2。

圖2 模擬微重力條件下HaCaT細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

A.NG組42 h, 2 μm;B.NG組42 h, 1 μm; C.SMG組42 h, 2 μm;D.SMG組42 h, 1 μm；SMG組為模擬微重力組，NG組為正常重力對照組;HaCaT為人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞

3 討論

航天飛行過程中最常見的創(chuàng)傷為皮膚軟組織傷[3]。研究發(fā)現(xiàn)，失重會(huì)引起肢體血流灌注水平改變，進(jìn)而影響傷口的愈合[6]。Radek等[7]通過尾懸吊動(dòng)物模型的皮膚打孔實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)模擬失重條件下大鼠傷口愈合明顯延遲。本課題組前期研究表明，失重會(huì)影響成纖維細(xì)胞的生長增殖、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)[8-10]。從現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道看，航天飛行過程中最容易發(fā)生的皮膚軟組織創(chuàng)傷的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究均比較局限，亟待系統(tǒng)深入研究[4]。本實(shí)驗(yàn)采用RCCS模擬微重力環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，其原理是培養(yǎng)物在HARV中隨RCCS旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)，通過獨(dú)特的流體力學(xué)與低剪應(yīng)力效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用，增加細(xì)胞結(jié)合的自由度，該流體環(huán)境可使其中的懸浮細(xì)胞處于失重狀態(tài)，從而可在地基條件下模擬地球附近空間的失重情況，成為研究地面模擬組織細(xì)胞微重力效應(yīng)的一種理想方法[11]。

皮膚創(chuàng)面修愈過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞包括角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的重要組成細(xì)胞之一，也是皮膚更新、屏障形成和免疫防御的主要細(xì)胞，其增殖、分化和遷移是纖維增生、新血管形成和創(chuàng)面愈合的生理基礎(chǔ)[5]。HaCaT細(xì)胞來源于人的表皮細(xì)胞，與角質(zhì)形成細(xì)胞的基本特性極其相似。本研究前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，模擬微重力環(huán)境對人角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一系列影響，包括抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的分泌，影響角質(zhì)細(xì)胞微絲和骨架結(jié)構(gòu)[12]。

HSPs是一種高度保守的分子伴侶蛋白，在原核細(xì)胞與真核細(xì)胞中廣泛存在。在人皮膚中，HSPs最主要的來源是角質(zhì)細(xì)胞。機(jī)體細(xì)胞受到理化因素刺激后，HSPs從低表達(dá)狀態(tài)轉(zhuǎn)入高表達(dá)狀態(tài)，故又被稱為應(yīng)激蛋白。HSPs在細(xì)胞正常生長發(fā)育及蛋白代謝中具有重要作用；在應(yīng)激條件下，HSPs則具有細(xì)胞保護(hù)作用[13-14]。本研究結(jié)果顯示，SMG組HaCaT細(xì)胞的HSP70 mRNA及蛋白表達(dá)水平高于NG組。分析原因?yàn)?，作為皮膚中HSPs最主要的來源，HaCaT細(xì)胞對失重環(huán)境這一特殊刺激因素通過提升HSPs表達(dá)等機(jī)制而發(fā)生應(yīng)激效應(yīng)，在造成應(yīng)激損傷的同時(shí)，提升在特殊環(huán)境中的生存和適應(yīng)能力。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在失重環(huán)境下，內(nèi)皮細(xì)胞、骨干細(xì)胞、肝細(xì)胞等的HSP70表達(dá)上調(diào)，顯然，HSPs在機(jī)體多種組織器官的失重應(yīng)激過程中發(fā)揮作用[15-17]。長期以來一直認(rèn)為，HSPs作為分子伴侶維護(hù)蛋白質(zhì)正常構(gòu)象，調(diào)整蛋白質(zhì)折疊、裝配、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解，并參與應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞保護(hù)。如何在創(chuàng)傷愈合中合理誘導(dǎo)或抑制HSPs生成，有效利用其雙刃劍樣作用，做到趨利避害、酌情把控、精準(zhǔn)調(diào)節(jié)，這些技術(shù)性的問題尚有待解決[18]。HSP70在失重環(huán)境下皮膚創(chuàng)傷及愈合過程中的作用和機(jī)制以及潛在的治療價(jià)值，尚有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，SMG組HaCaT細(xì)胞MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)量高于NG組。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在失重環(huán)境下志愿者口腔牙裂液、大鼠頸總動(dòng)脈及獼猴肺組織中MMP亦發(fā)生顯著變化[19-21]。MMPs是一組破壞細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的鋅和鈣依賴性蛋白溶解酶，在正常細(xì)胞中為低表達(dá)狀態(tài)，受到刺激后表達(dá)量增加。在創(chuàng)面愈合過程中，皮膚角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞亦分泌MMPs而發(fā)揮調(diào)控作用[22]。MMP-9能降解幾乎所有的ECM蛋白，其表達(dá)水平增高反映了細(xì)胞損傷的因素和程度；但同時(shí)MMP-9也是重要的創(chuàng)傷修復(fù)蛋白，其在創(chuàng)面重塑過程中發(fā)揮重要作用[23-24]。分析認(rèn)為，在失重環(huán)境中HaCaT細(xì)胞分泌MMP-9增多，早期參與失重應(yīng)激損傷反應(yīng)，后期可能介導(dǎo)耐受適應(yīng)修復(fù)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，SMG組HaCaT細(xì)胞Caspase-3表達(dá)量僅培養(yǎng)36 h時(shí)高于NG組，同時(shí)，透射電鏡觀察結(jié)果顯示，模擬微重力條件下培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生線粒體損傷等病理變化。本課題組前期研究亦表明，微重力環(huán)境對HaCaT細(xì)胞的微絲骨架結(jié)構(gòu)可造成明顯影響，破壞了細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的有序性，與生長增殖及自分泌功能受損等共同構(gòu)成了HaCaT細(xì)胞失重應(yīng)激損傷的生理病理表現(xiàn)[12]。Caspase-3是經(jīng)典的凋亡蛋白，是重要的細(xì)胞凋亡激活蛋白之一，眾多因素可通過該通路引發(fā)細(xì)胞凋亡[25]。顯然，失重作為一種特殊因素可通過Caspase途徑誘發(fā)HaCaT細(xì)胞凋亡。考慮到HSP的抗凋亡及細(xì)胞保護(hù)作用對細(xì)胞凋亡進(jìn)程會(huì)產(chǎn)生一定影響，分析與Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)有一定關(guān)系，具體有待深入探討。

綜上所述，失重影響航天員健康的問題已引起廣泛關(guān)注，創(chuàng)傷是失重環(huán)境中影響航天員身心健康及任務(wù)執(zhí)行能力的最大威脅。微重力環(huán)境下HaCaT細(xì)胞HSP70、MMP-9及Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平變化以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病理性改變均提示失重可導(dǎo)致皮膚角質(zhì)細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡以及一定程度的適應(yīng)特征。