姜佳慧， 林源吉， 余道軍

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310000；2.杭州百邁生物股份有限公司，浙江 杭州 310000）

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情早期階段，在疾病的早期診斷、監(jiān)測(cè)及各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)中，以嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）核酸檢測(cè)應(yīng)用最廣，臨床意義最大。本文對(duì)SARS-Cov-2核酸檢測(cè)結(jié)果解讀與臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為臨床診斷提供參考。

1 SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果解讀

到目前為止，我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委已經(jīng)發(fā)布了7版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》[1]，均將SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性作為COVID-19確診的主要指標(biāo)。SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的靶基因?yàn)镺RF1ab基因、N基因和E基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)快速擴(kuò)增靶基因[2]，可在2 h內(nèi)明確是否存在SARS-CoV-2。因此，檢測(cè)SARS-CoV-2核酸作為實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)是合適的。但SARS-CoV-2核酸檢測(cè)不能作為COVID-19實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，真正的“金標(biāo)準(zhǔn)”應(yīng)該是從患者標(biāo)本中分離出SARS-CoV-2。我們對(duì)SARS-CoV-2的認(rèn)識(shí)及其基因序列的獲得都是基于從患者體內(nèi)分離出病毒，并對(duì)其進(jìn)行全基因測(cè)序，通過分析病毒基因組，篩選出病毒保守基因，然后開發(fā)出用于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的診斷試劑。目前在用的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑基本上都是基于這種模式。

雖然COVID-19病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是病毒分離，但由于病毒分離技術(shù)要求高、成功率相對(duì)較低，且速度慢，不能滿足臨床快速診斷及鑒別診斷的需要。而SARS-CoV-2核酸檢測(cè)速度快、特異性高，因此，病原學(xué)診斷還是依賴于核酸檢測(cè)，病毒分離技術(shù)主要用于科學(xué)研究和疫苗開發(fā)等領(lǐng)域。

2 用于SARS-Cov-2核酸檢測(cè)的標(biāo)本類型

可用于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的標(biāo)本種類較多，主要包括呼吸道標(biāo)本、消化道標(biāo)本和血液標(biāo)本等。

2.1 呼吸道標(biāo)本

目前臨床上應(yīng)用最多的標(biāo)本是呼吸道標(biāo)本，尤以鼻咽拭子最為普遍[1-2]。對(duì)于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，下呼吸道標(biāo)本（痰液或氣道抽取物）結(jié)果更加準(zhǔn)確[1]。但相對(duì)于氣道抽取物，痰液標(biāo)本采集較為方便，一般臨床實(shí)驗(yàn)室主要用鼻拭子，輔以痰液標(biāo)本。在檢測(cè)SARS-CoV-2核酸時(shí)，有時(shí)會(huì)遇到鼻拭子檢測(cè)陰性而痰液檢測(cè)陽性的現(xiàn)象。雖然痰液標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性率高于鼻咽拭子，但臨床應(yīng)用最多的還是鼻咽拭子，原因主要有2個(gè)方面：一是鼻咽拭子采集較為方便、快捷，可以多次重復(fù)采樣；二是SARSCoV-2感染患者臨床表現(xiàn)多為干咳[3]，痰液較少，所以痰液標(biāo)本采集困難。因鼻咽拭子中病毒載量相對(duì)有限，且對(duì)采樣要求較高（需要采集到足夠的呼吸道上皮細(xì)胞），故鼻咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性率不高，且可能出現(xiàn)陰性、陽性交替出現(xiàn)的現(xiàn)象。

2.2 糞便標(biāo)本

在COVID-19疫情早期，很少有人重視消化道標(biāo)本的核酸檢測(cè)，隨著對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的加深，臨床實(shí)驗(yàn)室越來越多地采集糞便或肛拭子檢測(cè)SARSCoV-2核酸[4]，且陽性率也不低，甚至出現(xiàn)鼻咽拭子核酸陰性而糞便核酸陽性的現(xiàn)象。SARS-CoV-2主要與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）-2受體結(jié)合[5]。有研究結(jié)果表明，ACE-2在肺部組織和小腸組織表達(dá)最豐富，且在幾乎所有器官的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)也很豐富[6]，SARS-CoV-2一旦進(jìn)入肺部組織和腸道組織，會(huì)很快在組織內(nèi)復(fù)制。因此，臨床上檢測(cè)SARS-CoV-2核酸，以呼吸道和消化道樣本陽性為主。由于目前尚未見消化道感染致死的病例報(bào)道，因此SARS-CoV-2對(duì)消化系統(tǒng)的致病力是否與呼吸系統(tǒng)一致尚需進(jìn)一步探討。SARS-CoV-2可能主要通過呼吸-消化系統(tǒng)途徑感染消化道。咽是呼吸和消化系統(tǒng)的共同通道，分別與鼻腔、口腔和喉腔相通，COVID-19患者呼吸不暢、氣道受損，會(huì)通過口-鼻呼吸，或者在干咳、打噴嚏等過程中發(fā)生吞咽運(yùn)動(dòng)，此時(shí)從呼吸道排出的病毒會(huì)通過吞咽運(yùn)動(dòng)進(jìn)入消化道，而腸道上皮細(xì)胞富含ACE-2受體，導(dǎo)致病毒二次感染消化道，因?yàn)槭嵌胃腥?，其毒力相?duì)較弱；另外，SARS-CoV-2對(duì)消化系統(tǒng)的毒力可能相對(duì)較弱，因此臨床表現(xiàn)以呼吸系統(tǒng)癥狀為主，消化系統(tǒng)癥狀相對(duì)較輕。病毒在腸道內(nèi)復(fù)制后，可以通過糞便被排出體外，因此，糞便SARS-CoV-2核酸檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)陽性結(jié)果。當(dāng)然，還有一種可能，病毒在通過呼吸-消化途徑進(jìn)入腸道后，被胃腸道消化酶、鹽酸等殺滅，但病毒核酸依然存在，通過腸道被排出體外。SARS-CoV-2是否在消化道被殺滅，既與進(jìn)入消化系統(tǒng)的病毒載量密切相關(guān)，也與患者消化功能有關(guān)。不同患者糞便標(biāo)本核酸檢測(cè)結(jié)果差異很大，進(jìn)入消化系統(tǒng)病毒載量大、消化功能相對(duì)較弱的患者的糞便核酸檢測(cè)陽性率高，且可能存在時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，反之則陽性率低或存在時(shí)間短。

總之，SARS-CoV-2對(duì)消化系統(tǒng)的毒力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于呼吸系統(tǒng)。在治療上，臨床上主要針對(duì)呼吸系統(tǒng)進(jìn)行救治，對(duì)于病毒所致的消化系統(tǒng)癥狀諸如腹瀉等，不建議進(jìn)行止瀉治療，建議以調(diào)節(jié)酸堿平衡和水液平衡，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定為主，通過腹瀉將病毒排出體外，更利于縮短康復(fù)時(shí)間。

2.3 血液標(biāo)本

采用血液標(biāo)本檢測(cè)SARS-CoV-2核酸存在一定爭(zhēng)議，SARS-CoV-2不易進(jìn)入血流，即使進(jìn)入，病毒載量也很低，或存在時(shí)間很短。只有危重患者血管屏障遭受破壞或者血管通透性增加，SARS-CoV-2才能進(jìn)入血流，導(dǎo)致病毒血癥。但在病毒血癥患者的血流中，病毒存在時(shí)間不長(zhǎng)，因此采血時(shí)機(jī)很難把握。這導(dǎo)致血液標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性率很低，不適用于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)。

2.4 其他標(biāo)本

目前還有眼部分泌物、空氣等標(biāo)本SARSCoV-2核酸檢測(cè)陽性的報(bào)道，但此類報(bào)道僅為個(gè)例，且不排除標(biāo)本被污染的可能。眼分泌物核酸陽性不排除患者手污染病毒后再接觸眼睛導(dǎo)致眼部被感染的可能?？諝庵袡z測(cè)到SARSCoV-2核酸陽性，一般認(rèn)為是感染者飛沫污染所致。因此，眼部分泌物、空氣等標(biāo)本檢測(cè)SARSCoV-2核酸的臨床意義不大。

3 病毒核酸檢測(cè)假陰性、假陽性問題

在SARS-CoV-2核酸檢測(cè)過程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)臨床表現(xiàn)高度疑似COVID-19，但核酸檢測(cè)陰性的情況，因此有學(xué)者建議以影像學(xué)檢查代替核酸檢測(cè)。造成SARS-CoV-2核酸檢測(cè)假陰性的因素很多，涉及分析前、中、后的每個(gè)環(huán)節(jié)，包括病程病情、標(biāo)本采集、檢測(cè)試劑盒、實(shí)驗(yàn)操作和儀器性能、結(jié)果解讀等，其中尤以分析前（標(biāo)本采集）因素最為顯著。

3.1 分析前因素

分析前因素對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響較大，標(biāo)本采集、保存和運(yùn)輸?shù)确治銮耙蛩仉y以把控。COVID-19患者臨床表現(xiàn)以干咳為主，呼吸道分泌物相對(duì)較少，因此病毒黏附于鼻咽部位較少，且存在時(shí)間也較短，所以采樣過程中如未嚴(yán)格按照規(guī)范采樣，采樣時(shí)間短、鼻咽拭子插入鼻腔深度不夠、在鼻咽部擦拭力度不足、范圍小、患者鼻咽部位暴露不充分（沒有讓患者頭部后仰）等均可導(dǎo)致不同采樣人員、不同采集時(shí)間送檢的鼻咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果差異很大。

3.2 分析中因素

對(duì)于成熟的檢驗(yàn)方法，分析中的影響因素已經(jīng)很小，但SARS-CoV-2核酸檢測(cè)分析中影響因素也不能忽視。

3.2.1 試劑盒因素 COVID-19是新發(fā)傳染病，以往沒有針對(duì)SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)試劑，2020年初獲得病毒全基因序列后，分子診斷研發(fā)人員根據(jù)生物信息學(xué)理論篩選出SARSCoV-2保守序列，并基于理論上的保守序列短期內(nèi)開發(fā)出SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒。因?yàn)镃OVID-19傳染性極強(qiáng)，迫切需要快速診斷以行隔離或治療處理。因此，我國(guó)相關(guān)部門通過綠色通道緊急審批了病毒核酸檢測(cè)試劑，并立即投入臨床檢驗(yàn)。SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑是基于逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR技術(shù)的3類分子診斷試劑，從立項(xiàng)研發(fā)到臨床應(yīng)用一般需要2～3年時(shí)間[7]，但由于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑的臨床驗(yàn)證病例數(shù)及應(yīng)用時(shí)間不足，其準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、檢測(cè)限、精密度等性能指標(biāo)無法保證，因此，初期SARS-CoV-2核酸檢測(cè)出現(xiàn)假陰性、假陽性也與試劑檢測(cè)性能有關(guān)。目前，SARSCoV-2核酸檢測(cè)試劑有ORF1ab基因、N基因、E基因3個(gè)檢測(cè)靶基因，不同品牌試劑檢測(cè)靶基因數(shù)目不同，大部分采用雙靶點(diǎn)，但也有少數(shù)品牌采用單靶點(diǎn)或三靶點(diǎn)。對(duì)于2個(gè)或3個(gè)靶基因試劑出現(xiàn)單靶基因 “陽性”的情況，一般實(shí)驗(yàn)室會(huì)重新采集標(biāo)本復(fù)檢，只有2次結(jié)果一致且2個(gè)或3基因同時(shí)陽性，實(shí)驗(yàn)室才會(huì)出具陽性報(bào)告。所以，因試劑原因?qū)е碌募訇栃员壤龢O小。在疫情初期，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)SARS-CoV-2核酸時(shí)，為避免因試劑原因造成的假陰性，一般采用2～3個(gè)不同品牌試劑進(jìn)行平行檢測(cè)，盡量保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。隨著SARSCoV-2核酸檢測(cè)試劑的不斷研發(fā)，檢測(cè)結(jié)果假陰性問題已基本不會(huì)對(duì)COVID-19的診治造成困擾。

3.2.2 實(shí)驗(yàn)操作 因SARS-CoV-2具有強(qiáng)傳染性，檢驗(yàn)人員在進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)時(shí)，應(yīng)在具有負(fù)壓的二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室（P2+實(shí)驗(yàn)室）內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。但疫情初期，大多醫(yī)院沒有配備負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室，病毒核酸檢測(cè)一般只能在普通二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室人員做好三級(jí)生物安全防護(hù)[8]，這種情況對(duì)實(shí)驗(yàn)操作或多或少都有影響，不同的檢驗(yàn)人員操作規(guī)范性不同，對(duì)檢測(cè)結(jié)果會(huì)有一定影響。

3.2.3 儀器性能 隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展和管理的規(guī)范化，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室一般都會(huì)對(duì)儀器進(jìn)行性能驗(yàn)證，儀器性能對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響相對(duì)很小。

3.3 分析后因素

臨床實(shí)驗(yàn)室在報(bào)告SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性結(jié)果時(shí)，一般都會(huì)與臨床充分溝通，保證陽性結(jié)果的可靠性。但是，對(duì)于病毒核酸檢測(cè)陰性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室與臨床的溝通不夠充分，一般直接出陰性報(bào)告，可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生一定的影響。

4 COVID-19出院標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)指標(biāo)的應(yīng)用

隨著對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的加深，最新版診療方案規(guī)定患者呼吸道和糞便標(biāo)本2次核酸檢測(cè)陰性才可出院[1]。如能組建有檢驗(yàn)專家參與的COVID-19患者出院專家組，不完全根據(jù)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的陰、陽性結(jié)果決定是否可以出院，對(duì)COVID-19患者出院標(biāo)準(zhǔn)的把握會(huì)更為可靠。COVID-19出院患者復(fù)檢核酸陽性，并不一定是復(fù)發(fā)，有可能是出院前2次核酸檢測(cè)為假陰性結(jié)果。這類患者臨床上可能已經(jīng)真正痊愈，但是體內(nèi)可能仍然存在少量病毒，此時(shí)行呼吸道標(biāo)本核酸檢測(cè)可能出現(xiàn)陰性結(jié)果，若采樣不規(guī)范，或沒有采集到足夠量的標(biāo)本，出現(xiàn)假陰性的概率相對(duì)較大?；颊叱鲈汉?，體內(nèi)的病毒可能還會(huì)在體內(nèi)復(fù)制，所以復(fù)檢可能再次出現(xiàn)陽性結(jié)果。對(duì)于此類出院患者，只要未出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)，僅僅病毒核酸陽性，在臨床處置上應(yīng)與初發(fā)COVID-19患者區(qū)別對(duì)待，建議臨床上采取隔離觀察，防止傳染他人，如出現(xiàn)臨床癥狀，再入定點(diǎn)醫(yī)院進(jìn)行治療。糞便標(biāo)本核酸檢測(cè)的臨床意義沒有呼吸道標(biāo)本大，且糞便核酸陽性不代表體內(nèi)存在活病毒，建議糞便標(biāo)本SARSCoV-2核酸檢測(cè)作為輔助出院指標(biāo)比較好，不宜作為硬性出院指標(biāo)。

5 總結(jié)

SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的病原學(xué)確診意義毋庸置疑，臨床標(biāo)本采集的規(guī)范性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響最為顯著。SARS-CoV-2在體內(nèi)存活的時(shí)間因患者免疫力的不同而有差異。COVID-19患者出院后SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果“復(fù)陽”不一定是疾病復(fù)發(fā)，有可能與與核酸檢測(cè)假陰性（標(biāo)本采集原因）有關(guān)，對(duì)于此類患者應(yīng)與初發(fā)患者區(qū)別對(duì)待。 非呼吸道標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)臨床意義相對(duì)較小，作為參考即可。臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)發(fā)揮自身專業(yè)優(yōu)勢(shì)，正確解讀相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，為臨床提供科學(xué)、客觀的實(shí)驗(yàn)室意見。