杜銳玲 楊茂農(nóng)

(四川省人民醫(yī)院中醫(yī)科，四川 成都 610072)

胃癌(GC)，是常見的上消化道惡性腫瘤之一，尤其在幽門螺桿菌感染者中更為高發(fā)〔1〕。GC的病理類型以腺癌為主，臨床上GC癥狀隱匿，已發(fā)生淋巴結(jié)及肝臟轉(zhuǎn)移，故患者術(shù)后長期生存率較低〔2〕。

微小核糖核苷酸(miR)是一種單鏈短RNA〔3〕。miR-1301的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，miR-1301在甲狀腺癌中表達(dá)下調(diào)并且與腫瘤體積和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性臨床特征密切相關(guān)〔4〕。預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)miR-1301的卵巢癌患者預(yù)后不良，且miR-1301的低表達(dá)是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一〔5〕。但是，miR-1301在GC中的表達(dá)、臨床意義及生物學(xué)功能尚不完全清楚。本研究旨在探索miR-1301對(duì)GC侵襲的影響，以期對(duì)miR-1301成為GC分子治療靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1組織標(biāo)本 四川省人民醫(yī)院2013年1月至2015年12月收治的60例GC組織與對(duì)應(yīng)癌旁組織，男40例，女20例。

1.2細(xì)胞來源及主要試劑 GES-1、MGC-803、SGC-790、MKN45、AGS細(xì)胞由四川省人民醫(yī)院中醫(yī)科實(shí)驗(yàn)室保存；miR-1301(miR10005797-1-5)及陰性對(duì)照(miR01201-1-5)mimics購自廣州銳博生物技術(shù)公司；miR-1301(miRQ0005797-1-1)及U6(MQP-0201)引物購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑(15596026)、RT-PCR試劑盒(SuperScript?One-Step RT-PCR System with Platinum?Taq DNA Polymerase,10928042)、qPCR試劑盒(DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit，F(xiàn)415L)及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(11668-027)均購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國康寧公司，兔抗人STAT3多克隆抗體(12640)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體(40994)及鼠抗人β-actin單克隆抗體(3700)均購自美國CST公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；DMEM液體細(xì)胞培養(yǎng)基購自Mediatech公司；基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.3qRT-PCR 標(biāo)本及細(xì)胞RNA由Trizol試劑提取。反轉(zhuǎn)錄PCR條件設(shè)定為：50℃ 30 min，94℃ 2 min，循環(huán)次數(shù)1；94℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 3 min，循環(huán)40次；72℃ 10 min。通過2-△△Ct法檢測組織及體外培養(yǎng)細(xì)胞中miR-1301的相對(duì)含量。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及mimics轉(zhuǎn)染 MGC-803細(xì)胞于適宜條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代。將MGC-803細(xì)胞按適宜密度接種6孔板。實(shí)驗(yàn)分組：miR-1301組(miR-1301)每孔加入100 pmol的miR-1301 mimics、2 ml完全培養(yǎng)基及5 μl Lipofectamine 2000；陰性對(duì)照(miR-control)組每孔加入100 pmol的miR-control mimics、2 ml完全培養(yǎng)基及5 μl Lipofectamine 2000。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5Transwell小室 按1∶8比例采用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠后，按每孔100 μl包被Transwell小室膜的上室面，制作侵襲小室模型；無基質(zhì)膠包被的Transwell小室用于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基按每孔2萬個(gè)接種于上室，下室內(nèi)加入750 μl含10%血清的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后移除培養(yǎng)基，甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色。倒置白光顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲，計(jì)數(shù)遷移或者侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.6Western印跡 RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，凝膠垂直電泳分離蛋白，70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5% 牛血清白蛋白封閉1 h后將條帶孵育于1∶1 000比例稀釋的相應(yīng)一抗中。4℃過夜后，使用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育條帶1 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)法曝光條帶。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)，Kaplan-Meier生存曲線。

2 結(jié) 果

2.1miR-1301在GC組織中低表達(dá) 通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),60例GC組織中miR-1301的表達(dá)水平(0.581±0.043)明顯低于癌旁組織(1.338±0.056，t=2.419，P=0.026)。

2.2miR-1301表達(dá)與GC臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系 以GC組織中miR-1301在GC組織中平均表達(dá)水平為界值，將60例GC組織分為miR-1301高表達(dá)組(n=22)及低表達(dá)組(n=38)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多出現(xiàn)在miR-1301低表達(dá)的GC患者中(P<0.05)，提示miR-1301可能與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。見表1。

表1 miR-1301表達(dá)的臨床病理意義分析(n)

Hp：幽門螺桿菌

通過術(shù)后隨訪，獲得了上述兩組3年的生存資料，使用Kaplan-Meier生存曲線法分析后發(fā)現(xiàn)，miR-1301低表達(dá)組3年總體生存率(HR=2.140，P=0.021)及無病生存率(HR=3.437，P=0.015)較miR-1301高表達(dá)組更低。見圖1。多因素分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-1301低表達(dá)是GC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一(P<0.05)，見表2。

圖1 miR-1301異常表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響

表2 GC患者術(shù)后3年生存率相關(guān)因素的COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析(n=60)

2.3miR-1301對(duì)GC細(xì)胞遷移及侵襲的影響 為研究miR-1301在GC中的生物學(xué)功能，本研究利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了miR-1301過表達(dá)細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染miR-1301 mimics的細(xì)胞內(nèi)miR-1301表達(dá)水平較miR-control組明顯升高〔miR-control組為1.03±0.28、miR-1301組為9.46±1.38，t=10.285，P=0.009)。通過Transwell遷移小室模型的檢測得知，miR-1301組遷移細(xì)胞數(shù)量為(21.11±3.25)個(gè)，miR-control組遷移細(xì)胞數(shù)量為(42.38±5.01)個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.423，P=0.021)個(gè)。同樣，miR-1301組侵襲細(xì)胞數(shù)量為(10.29±2.04)個(gè)，miR-control組侵襲細(xì)胞數(shù)量為(23.46±3.18)個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.128，P=0.030)。見圖2。

圖2 miR-1301對(duì)MGC-803細(xì)胞遷移、侵襲的影響(×100)

2.4過表達(dá)miR-1301對(duì)下游靶點(diǎn)STAT3的調(diào)控作用 過表達(dá)miR-1301抑制STAT3蛋白和MMP-2 mRNA表達(dá)水平。見圖3。

圖3 過表達(dá)miR-1301對(duì)MGC-803細(xì)胞內(nèi)STAT3及MMP-2表達(dá)的影響

為驗(yàn)證STAT3是否為miR-1301的潛在作用靶點(diǎn)，本研究通過Western印跡檢測了過表達(dá)miR-1301后MGC-803細(xì)胞內(nèi)STAT3表達(dá)的變化。結(jié)果表明，miR-1301組MGC-803細(xì)胞內(nèi)STAT3蛋白表達(dá)水平為(0.13±0.05)，miR-control組STAT3蛋白表達(dá)水平為(0.51±0.10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.781，P=0.028)。通過Western印跡檢測了MMP-2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-1301組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)水平為(0.23±0.04)，miR-control組MMP-2蛋白表達(dá)水平為(0.42±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.168，P=0.036)。

3 討 論

MMP-2是STAT3調(diào)節(jié)腫瘤侵襲能力的效應(yīng)基因之一〔6〕。miR-1301作為一種新發(fā)現(xiàn)的microRNA，其在不同類型的惡性腫瘤中的生物學(xué)功能并不完全相同。在前列腺癌中，miR-1301高表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞干性〔7〕；而在乳腺癌中，miR-1301卻抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖〔8〕。本研究我們通過PCR檢測得知，GC組織中miR-1301的表達(dá)水平呈明顯降低趨勢。臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，低表達(dá)miR-1301的患者多存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且這部分患者預(yù)后較差。這表明miR-1301在GC中的缺失導(dǎo)致了腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，造成患者早期復(fù)發(fā)和死亡。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究結(jié)果證實(shí)，miR-1301具有削弱腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲的效果。另外，最新文獻(xiàn)也指出，miR-1301也能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔9〕。說明miR-1301的抗腫瘤效應(yīng)具有生物多樣性，值得我們在今后的工作中進(jìn)一步深入研究。

MicroRNA能夠通過結(jié)合靶基因(3′-UTR)區(qū)而發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用〔10〕。通過生物信息學(xué)檢索分析我們發(fā)現(xiàn)，STAT3可能是miR-1301的下游靶點(diǎn)之一。既往研究〔11〕也表明STAT3在胃癌內(nèi)高表達(dá)且具有促癌作用。通過蛋白印跡試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-1301在體外的確能下調(diào)STAT3的表達(dá)水平。MMP對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移均具有促進(jìn)作用〔12〕。STAT3是一種重要的癌性轉(zhuǎn)錄因子，研究指出，MMP-2的轉(zhuǎn)錄受到STAT3的調(diào)節(jié)〔13〕。本研究提示miR-1301的抑制腫瘤遷移及侵襲作用可能是通過抑制STAT3/MMP-2信號(hào)通路的活化來實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)于miR在腫瘤中異常表達(dá)的機(jī)制，目前認(rèn)為主要與兩方面因素有關(guān)：一是，長鏈非編碼RNA(lncRNA)作為分子海綿結(jié)合microRNA，導(dǎo)致microRNA的表達(dá)下降，并失去生物活性。第二種潛在的機(jī)制是miR表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控。對(duì)于miR-1301，有研究顯示，LINC01433能夠促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展，其機(jī)制正是通過結(jié)合并下調(diào)miR-1301的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的〔14〕。在甲狀腺癌中的研究結(jié)果還指出，由STAT3上調(diào)的LncRNA ABHD11-AS1能夠通過與miR-1301相結(jié)合而抑制其生物學(xué)功能〔15〕，這一結(jié)果提示STAT3-miR-1301在腫瘤中可能存在一個(gè)負(fù)反饋關(guān)系，但仍需在今后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，miR-1301在GC中低表達(dá)，miR-1301抑制GC侵襲的作用可能是通過調(diào)控STAT3/MMP-2信號(hào)通路的活化來實(shí)現(xiàn)的。