胡慶花，朱德全，劉衛(wèi)東，劉向峰

[1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 研究生處，山東 泰安 271000；2.臨沂市 人民醫(yī)院 微生物檢驗(yàn)科，山東 臨沂 276000；3.臨沂市人民醫(yī)院 藥學(xué)部，山東 臨沂 276000]

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）是一類常見(jiàn)的多重耐藥菌，由于葡萄球菌染色體mec 基因盒（staphyloccoccal cassette chromosome mec,SCCmec）攜帶的mecA耐藥基因及其同系物編碼產(chǎn)生的青霉素結(jié)合蛋白（penicillin-binding protein,PBP）導(dǎo)致其呈多重耐藥性。目前，國(guó)際上已經(jīng)明確了8 個(gè)與MRSA 流行病學(xué)相關(guān)的SCCmec基因分型及26 個(gè)亞型，醫(yī)院獲得性MRSA 常攜帶Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型SCCmec基因，社區(qū)獲得性MRSA 多攜帶SCCmecⅣ、Ⅴ型SCCmec基因[1]。由于不同地區(qū)MRSA 的SCCmec 分型差異較大，因此該實(shí)驗(yàn)對(duì)MRSA 進(jìn)行耐藥性及SCCmec基因分型研究，以了解該地區(qū)MRSA 的流行病學(xué)特點(diǎn)，對(duì)指導(dǎo)臨床合理治療MRSA 感染具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 菌株

選 取2018年2月—2018年10月臨沂市人民醫(yī)院門診及住院患者的各類送檢標(biāo)本，從中分離得到MRSA 菌株47 株，剔除同一患者相同部位重復(fù)分離的菌株。MRSA 標(biāo)準(zhǔn)菌株采用ATCC29213 和ATCC433000。

1.2 儀器及材料

VITEK-2 Compact 全自動(dòng)微生物分析儀及配套鑒定卡和藥敏卡（法國(guó)生物梅里埃公司），藥敏紙片（英國(guó)Oxoid 公司），聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀、全自動(dòng)凝膠成像儀（美國(guó)Bio Rad 公司），DYY-6C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），金黃色葡萄球菌基因組DNA 提取試劑盒、2×Power Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker 及核酸凝膠染色劑-GelRed（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），Multiplex PCR Kit（德國(guó)QIAGEN 公司），溶葡萄球菌酶等其他生物試劑（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 MRSA 細(xì)菌表型鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用VITEK-2 Compact 全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)分離菌株進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)。根據(jù)2017年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)推薦的頭孢西丁紙片擴(kuò)散法，抑菌圈直徑≤21 mm 判斷為MRSA[2]。

1.3.2 DNA 提取 將收集的待測(cè)菌株接種于哥倫比亞血平板上，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。用取菌環(huán)挑取適量單個(gè)菌落接種于5 ml LB 培養(yǎng)液中，置于37℃恒溫?fù)u床過(guò)夜進(jìn)行增菌培養(yǎng)。取1.5 ml細(xì)菌培養(yǎng)液于2 ml 離心管中，10 000 r/min 離心30 s，棄上清，收集菌體，盡可能吸凈上清。嚴(yán)格按照細(xì)菌DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取后的DNA 使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)濃度和純度，后將提取的DNA 置于-20℃冰箱中保存。

1.3.3 引物設(shè)計(jì) 各型別基因引物根據(jù)GenBanlk中己發(fā)布的各型基因序列及參考文獻(xiàn)[3]自行設(shè)計(jì)mecA、SCCmec基因，均委托上海鉑尚生物技術(shù)公司合成[3]。見(jiàn)表1。

1.3.4 MRSAmecA基因檢測(cè) 采用PCR 進(jìn)行mecA基因檢測(cè)，反應(yīng)體系為25μl，其中DNA 模板2μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5μl，mecA 正反向引物各1μl，其余用ddH2O 補(bǔ)足25μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。將PCR產(chǎn)物放置于4℃保存。取5μl PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，后將凝膠置于紫外凝膠成像儀下拍照并記錄結(jié)果。

表1 mecA 基因及SCCmec 基因各分型PCR 擴(kuò)增引物序列

1.3.5 MRSASCCmec基因檢測(cè) 采用多重PCR 進(jìn)行SCCmec基因分型檢測(cè)，反應(yīng)體系為25μl，其中DNA 模板2μl，2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 12.5μl，引物混合物5μl，其余用ddH2O 補(bǔ)足25μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，94℃變性30 s，63℃退火90 s，72℃延伸90 s，共10 個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，55℃退火90 s，72℃延伸90 s，共25 個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。循環(huán)結(jié)束后將PCR 產(chǎn)物于4℃環(huán)境下保存。取5μl PCR 產(chǎn)物在1.3%瓊脂糖凝膠電泳30 min，后將凝膠置于紫外凝膠成像儀下拍照并記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Whonet 5.6 軟件和SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用校正χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mecA 基因檢測(cè)結(jié)果

凝膠電泳成像顯示，MRSA 分離菌株可見(jiàn)310 bp條帶，均為mecA基因陽(yáng)性菌株，MRSA 分離菌株mecA基因攜帶率為100%。見(jiàn)圖1。

2.2 SCCmec 基因檢測(cè)結(jié)果

凝膠電泳成像顯示：SCCmecⅡ型9 株，檢出率為19.15%；SCCmecⅣa 型35 株，檢出率為74.47%；未分型菌株3 株，占6.38%。見(jiàn)圖2。

2.3 不同SCCmec 分型MRSA 對(duì)抗菌藥的耐藥率比較

圖1 mecA 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 SCCmec 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

MRSA 分離菌株對(duì)青霉素、苯唑西林及頭孢西丁等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，對(duì)奎奴普汀/達(dá)福普汀、利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、替加環(huán)素、呋喃妥因、利福平及慶大霉素均表現(xiàn)為敏感，敏感率均為100%；不同SCCmec分型MRSA 對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星及莫西沙星的耐藥率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SCCmecⅡ型高于SCCmecⅣa 型。不同SCCmec分型MRSA 對(duì)紅霉素、克林霉素耐藥率比較，經(jīng)校正χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SCCmecⅣa 型高于SCCmecⅡ型，紅霉素、克林霉素耐藥嚴(yán)重。見(jiàn)表2。

表2 不同SCCmec 分型MRSA 對(duì)抗菌藥的耐藥率比較 株（%）

3 討論

MRSA 指攜帶mecA或mecC基因或?qū)Ρ竭蛭髁郑ㄗ畹鸵志鷿舛取?μg/ml）、頭孢西丁耐藥的金黃色葡萄球菌，可引起人類多種組織和臟器的感染，病死率高[4]。自1961年JEVONS 發(fā)現(xiàn)第一株MRSA 后，MRSA 已成為醫(yī)院和社區(qū)感染的常見(jiàn)致病菌[5]。

有研究表明，SCCmec 是區(qū)分醫(yī)院獲得性MRSA和社區(qū)獲得性MRSA 的重要指標(biāo)之一[6]。醫(yī)院獲得性MRSA 常攜帶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型SCCmec基因，I 型SCCmec攜帶耐藥基因較少，僅對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥；Ⅱ、Ⅲ型攜帶多種耐藥基因，表現(xiàn)多重耐藥。SCCmecⅣ、Ⅴ型多見(jiàn)于社區(qū)獲得性MRSA 中，由于其基因盒較短，除mecA基因外幾乎不攜帶其他耐藥基因，因此僅對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥[7]。該研究還發(fā)現(xiàn)，MRSA 分離菌株以SCCmecⅣa 型為主，未發(fā)現(xiàn)SCCmecⅠ、Ⅲ及Ⅴ型菌株，這與楊琴等[8]2018年報(bào)道的深圳住院患兒MRSA 的感染以SCCmec Ⅳ型社區(qū)獲得性MRSA 感染為主一致。但區(qū)別于CHENG[9]和吳宇等[10]對(duì)9 所醫(yī)院309 株MRSA 分離菌株進(jìn)行基因分型的檢測(cè)結(jié)果：中國(guó)院內(nèi)流行的MRSA 菌株以SCCmecⅢ型為主，其次為Ⅱ型，SCCmecⅠ～Ⅴ型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，MRSA 分離菌株對(duì)青霉素、苯唑西林和頭孢西丁等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物全部耐藥，對(duì)奎奴普汀/達(dá)福普汀、利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、替加環(huán)素、呋喃妥因、利福平和慶大霉素等均表現(xiàn)為敏感，SCCmecⅡ型MRSA 分離株對(duì)左氧氟沙星、環(huán)丙沙星及莫西沙星的耐藥率高于SCCmecⅣa型，而SCCmecⅣa 型對(duì)紅霉素、克林霉素耐藥率高于SCCmecⅡ型。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)Ⅳ和Ⅴ型MRSA 菌株正在取代傳統(tǒng)的醫(yī)院獲得性MRSA 菌株，成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要來(lái)源[11-12]。對(duì)于SCCmecⅣ和Ⅴ型MRSA 菌株院內(nèi)傳播的原因尚不清楚，部分研究猜測(cè)，其傳播可能與社區(qū)獲得性MRSA菌株的高感染率和遺傳適應(yīng)性有關(guān)[13-15]。但還需要進(jìn)一步研究，以便更好地了解該類型菌株在院內(nèi)傳播的機(jī)制。

綜上所述，本研究?jī)H對(duì)臨沂市人民醫(yī)院某一時(shí)間段內(nèi)47 株MRSA 分離菌株進(jìn)行研究，具有一定的局限性，可能只反映當(dāng)前醫(yī)院MRSA 的流行趨勢(shì)，無(wú)法推廣到不同地區(qū)、不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)，后續(xù)研究可擴(kuò)大樣本量，更進(jìn)一步對(duì)本地區(qū)MRSA 的流行進(jìn)行分析。本研究結(jié)果可初步表明，本地區(qū)可能存在SCCmecⅣ和Ⅴ型MRSA 菌株醫(yī)院傳播的高風(fēng)險(xiǎn)，因此醫(yī)院應(yīng)提高病原學(xué)的相關(guān)診斷水平，及時(shí)監(jiān)測(cè)到院內(nèi)感染的新型MRSASCCmec基因分型，對(duì)臨床預(yù)防和治療MRSA感染提供參考依據(jù)，同時(shí)對(duì)有效控制MRSA 菌株的流行具有重要的意義。