董晗，鄭國(guó)峰，張軍，李永剛

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110005；2.錦州醫(yī)科大學(xué) 病原微生物教研室，遼寧 錦州 121000）

納爾遜海灣病毒（nelson bay virus,NBV）是呼腸孤病毒科中的一種雙鏈核糖核酸（dsRNA）病毒，包含10 個(gè)分節(jié)段dsRNA。根據(jù)RNA 的大小，將其分為大（L1～L3）、中（M1～M3）及?。⊿1～S4）3 組。μN(yùn)S 蛋白由M3 基因組區(qū)段編碼，σNS 蛋白由S3 基因組區(qū)段編碼，這2 種蛋白在病毒增殖過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用免疫熒光及共聚焦的方法研究NBV 病毒μN(yùn)S 和σNS 蛋白的表達(dá)及兩者的相互作用，深入研究病毒增殖機(jī)制及感染機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

BSR 細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC 細(xì)胞 庫(kù)，DMEM 培養(yǎng)基、opti-MEM 培養(yǎng)基、山羊抗兔-488、山羊抗鼠-594、 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine 2000、HRP 羊 抗兔抗體、HRP 羊抗鼠抗體、Alexa594 羊抗鼠抗體及Alexa488 羊抗兔抗體均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司，PMSF 購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司，μN(yùn)S 多克隆抗體（兔制備）由錦州醫(yī)科大學(xué)病原微生物教研室自制[1]，pCAG-M3、pCAG-S3 及NBV 病毒[本研究采用的毒株是2007年從印度尼西亞巴厘島返回日本的呼吸道感染患者身上分離出的NBV 病毒株，該病毒株被命名 為Miyazaki-Bali/2007（MB）[2-3]]，σNS 多克隆抗體（鼠制備）由日本大阪大學(xué)微生物病研究所病毒免疫研究室小林剛教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒感染 將BSR 細(xì)胞培養(yǎng)于含8%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，細(xì)胞達(dá)到所需數(shù)量時(shí)，將BSR 細(xì)胞以3×106個(gè)/板的密度接種在6 cm 細(xì)胞培養(yǎng)板上做質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將BSR 細(xì)胞培養(yǎng)于含8%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，細(xì)胞達(dá)到所需數(shù)量時(shí)，接種于帶有細(xì)胞爬片的24 孔板內(nèi)，次日用NBV 病毒感染，24 h 后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將10μg pCAG-M3 及pCAG-S3 分別轉(zhuǎn)染或共同轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。質(zhì)粒與200μl Opti-MEM培養(yǎng)基混合5 min，將25μl 轉(zhuǎn)染試劑與200μl Opti-MEM 培養(yǎng)基混合5 min，再將稀釋好的質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育20 min 后，添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下條件溫育4～6 h，更換血清培養(yǎng)基，繼續(xù)37℃溫育24～48 h 后做免疫熒光檢測(cè)。

1.2.3 免疫熒光 將感染病毒24 h 后的細(xì)胞用PBS-4%多聚甲醛固定20 min，用PBS 洗凈后分別或共同與μN(yùn)S 及σNS 多克隆抗體在37℃條件下孵育1 h。用PBS 沖洗3 次后，將細(xì)胞分別或共同與Alexa 594羊抗鼠抗體及Alexa 488 羊抗兔抗體在37℃條件下孵育1 h，然后PBS 洗3 次。采用熒光顯微鏡觀察并獲取圖像。分別或共同轉(zhuǎn)染pCAG-M3 及pCAG-S3 質(zhì)粒BSR 細(xì)胞的免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法同上，所用抗體同上。通過免疫熒光方法在共聚焦顯微鏡下觀察μN(yùn)S和σNS 蛋白在NBV 感染細(xì)胞和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的定位。為確定μN(yùn)S 和σNS 是否在病毒包涵體樣結(jié)構(gòu)中共定位，將NBV 病毒以0.1 PFU/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)感染BSR 細(xì)胞，孵育24 h，免疫熒光后用共聚焦顯微鏡觀察。先后用μN(yùn)S 多克隆抗體、Alexa488 的羊抗兔抗體對(duì)μN(yùn)S 蛋白進(jìn)行免疫染色。先后用σNS 多克隆抗體、Alexa594 的羊抗鼠抗體對(duì)σNS 蛋白進(jìn)行免疫染色，未感染細(xì)胞作為對(duì)照。為證明當(dāng)在沒有其他NBV 蛋白表達(dá)的情況下，μN(yùn)S 可以形成病毒包涵體樣結(jié)構(gòu)，用pCAG-M3 質(zhì)粒（含有來(lái)自NBV 的M3基因表達(dá)載體）轉(zhuǎn)染BSR 細(xì)胞，通過免疫熒光方法在24 h 共聚焦顯微鏡下觀察μN(yùn)S 在細(xì)胞中的分布。將pCAG-M3 及pCAG-S3 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至BSR 細(xì)胞，細(xì)胞孵育24 h 后用共聚焦顯微鏡觀察。先后用μN(yùn)S 多克隆抗體和Alexa488 羊抗兔抗體對(duì)μN(yùn)S 蛋白進(jìn)行免疫染色。先后用σNS 多克隆抗體和Alexa594 羊抗小鼠抗體對(duì)σNS 蛋白進(jìn)行免疫染色。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞用作對(duì)照。

1.2.4 免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞μN(yùn)S 的表達(dá) 用PBS 將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上吹下，以1 000 r/min 離心3 min，棄上清，加入500μl NP-40 細(xì)胞裂解液、5μl PMSF 于4℃搖動(dòng)1 h 裂解細(xì)胞，5 000 r/min 離心5 min，取上清液。取20μl 上清液加入10μl 2×樣本液106℃加熱10 min，靜置為室溫后取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各20μl蛋白樣品于聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE，結(jié)束后20V 電轉(zhuǎn)印至PVDF。使用5%脫脂牛奶封閉液中室溫封閉1 h，稀釋?duì)蘊(yùn)S 或σNS 多克隆抗體，4℃孵育過夜。PBS 洗膜4 次，加入稀釋HRP 羊抗兔抗體或HRP 羊抗鼠抗體，37℃孵育1 h，洗膜。加入電化學(xué)發(fā)光液曝光顯色。為進(jìn)一步證明NBV 病毒感染細(xì)胞中μN(yùn)S 及σNS 蛋白的表達(dá)，將NBV 病毒感染細(xì)胞的裂解物進(jìn)行免疫印跡分析，一抗使用μN(yùn)S 和σNS 多克隆抗體，二抗使用HRP 羊抗兔抗體和HRP 羊抗鼠抗體。轉(zhuǎn)染pCAG-S3 質(zhì)粒細(xì)胞的免疫印跡分析使用兔制備的μN(yùn)S 多克隆抗體作為一抗，二抗使用HRP羊抗兔抗體。轉(zhuǎn)染pCAG-M3 質(zhì)粒細(xì)胞的免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)使用兔制備的μN(yùn)S 多克隆抗體作為一抗，二抗是HRP 羊抗兔抗體。

2 結(jié)果

2.1 感染細(xì)胞中確認(rèn)μN(yùn)S and σNS 的蛋白表達(dá)

μN(yùn)S 和σNS 蛋白都以類似的點(diǎn)狀致密結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)，這種小的點(diǎn)狀致密結(jié)構(gòu)即為包涵體樣結(jié)構(gòu)，且這2 種蛋白在細(xì)胞質(zhì)中，尤其是在病毒包涵體樣結(jié)構(gòu)中共定位（見圖1）。在未感染的細(xì)胞中未觀察到μN(yùn)S和σNS 蛋白。免疫印跡結(jié)果可見感染細(xì)胞裂解物75 kD 大小處有蛋白表達(dá)即為μN(yùn)S 蛋白，感染細(xì)胞裂解物34 kD 處有蛋白表達(dá)即為σNS 蛋白，未感染的細(xì)胞作陰性對(duì)照（見圖2）。

圖1 μN(yùn)S 和σNS 蛋白在NBV 感染BSR 細(xì)胞中的定位 （×400）

圖2 μN(yùn)S 和σNS 蛋白在NBV 感染BSR 細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCAG-M3 或pCAG-S3 質(zhì)粒細(xì)胞中μN(yùn)S 和σNS 蛋白的表達(dá)

細(xì)胞質(zhì)中觀察到小點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，即病毒包涵體樣結(jié)構(gòu)。用pCAG-S3 質(zhì)粒（含有來(lái)自NBV 的S3 基因表達(dá)載體）轉(zhuǎn)染BSR 細(xì)胞時(shí)，觀察到σNS 蛋白在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)出彌散分布，沒有形成點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陰性對(duì)照。見圖3。

免疫印跡結(jié)果可見質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物75 kD 大小處有蛋白表達(dá)即為μN(yùn)S 蛋白，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞用作對(duì)照。免疫印跡結(jié)果可見質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物34 kD 處有蛋白表達(dá)即為σNS 蛋白，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞用作對(duì)照。見圖4。

圖3 單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NBV μN(yùn)S 和σNS 蛋白的定位 （×400）

圖4 單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞中μN(yùn)S 和σNS 蛋白的表達(dá)

2.3 μN(yùn)S 和σNS 蛋白共定位于pCAG-M3 和pCAG-S3 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的BSR 細(xì)胞

在μN(yùn)S 和σNS 2 個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24 h 后的BSR細(xì)胞中，觀察到與NBV 病毒感染的BSR 細(xì)胞相同現(xiàn)象：μN(yùn)S 和σNS 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中，特別是在病毒包涵體樣結(jié)構(gòu)中共定位，可知σNS 蛋白通過與μN(yùn)S蛋白的相互作用和μN(yùn)S 蛋白在細(xì)胞中共定位。見 圖5。

圖5 μN(yùn)S 和σNS 蛋白在共轉(zhuǎn)染pCAG-M3 及pCAG-S3 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中共定位 （×400）

3 討論

NBV 是融合性正呼腸孤病毒家族中的一員，在呼腸孤病毒的培養(yǎng)過程中，根據(jù)病毒在感染細(xì)胞時(shí)是否具有誘導(dǎo)細(xì)胞融合的能力，將呼腸孤病毒分為細(xì)胞融合病毒與非融合病毒。禽類呼腸孤病毒（avian reovirus,ARV）、狒狒呼腸孤病毒、爬行類呼腸孤病毒、Broome 呼腸孤病毒及NBV 屬于融合病毒。典型的哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒（mammalian reoviruses,MRV）屬于非融合病毒[4-6]。正常情況下，非融合病毒MRV 十分常見，可引起人類無(wú)癥狀感染。融合性病毒感染雖可引起嚴(yán)重的動(dòng)物疾病。在2006年之前，還未有過該病毒引起人類疾病的報(bào)道。然而2006年，NBV 病毒先后在馬來(lái)西亞、香港等地的急性呼吸道感染患者體內(nèi)被分離出來(lái)[7]。由此可知，NBV 已經(jīng)進(jìn)化成一種可以引起人畜共患病的病原體。

NBV 病毒感染細(xì)胞早期，細(xì)胞質(zhì)中可觀察到一種小型相密包涵體結(jié)構(gòu)[8]，隨著感染的進(jìn)展逐漸變得更大且向細(xì)胞核移動(dòng)。有研究稱這種小型的相密包涵體結(jié)構(gòu)為inclusion body，筆者將其譯為包涵體樣結(jié)構(gòu)。有文獻(xiàn)證明，包涵體樣結(jié)構(gòu)是由dsRNA、多種蛋白質(zhì)和完全組裝的顆粒組成[9]。μN(yùn)S 是呼腸孤病毒一種主要的非結(jié)構(gòu)蛋白，由M3 基因組區(qū)段編碼，蛋白質(zhì)大小為75 kD。針對(duì)MRV 和ARV 的研究表明，非結(jié)構(gòu)蛋白μN(yùn)S 在細(xì)胞中獨(dú)自表達(dá)，即可以在胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體樣結(jié)構(gòu)，顯微鏡下觀察該包涵體樣結(jié)構(gòu)與某些呼腸孤病毒株感染細(xì)胞期間形成的結(jié)構(gòu)極為相 似[10-11]。其他MRV 和ARV 的研究結(jié)果還表明，μN(yùn)S在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒感染的細(xì)胞中都可形成包涵體樣結(jié)構(gòu)。當(dāng)通過RNA 干擾敲除μN(yùn)S 表達(dá)時(shí)，包涵體樣結(jié)構(gòu)的形成和病毒增殖被嚴(yán)重抑制；當(dāng)以野生型μN(yùn)S通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方式在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，病毒又得以繼續(xù)增殖[12-13]。這些結(jié)果有力的表明，包涵體樣結(jié)構(gòu)的形成是MRV 成功增殖的重要且必要的條件。第2 種主要的呼腸孤病毒非結(jié)構(gòu)蛋白σNS 也與包涵體樣結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)[14]。σNS 是由S3 基因組區(qū)段編碼的含有366 個(gè)殘基、大小為41 kD 的蛋白質(zhì)。σNS 蛋白對(duì)包括呼腸孤病毒mRNA 在內(nèi)的單鏈RNA 具有很強(qiáng)的親和力。有研究在從感染的細(xì)胞中分離呼腸孤病毒時(shí)，用核糖核酸酶A 處理后發(fā)現(xiàn)有大的（40～60 S）復(fù)合物解離[15]，這暗示σNS 和RNA 在感染期間形成大的核蛋白復(fù)合物。在相關(guān)的MRV 研究中，已從病毒感染細(xì)胞后形成的單鏈RNA 復(fù)合物中分離出σNS、μN(yùn)S 蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白σ3，表明這些蛋白質(zhì)參與制備用于負(fù)鏈合成的病毒轉(zhuǎn)錄物，并將其包裝到子代病毒的核心中。由于σNS 在感染過程中在包涵體樣結(jié)構(gòu)內(nèi)定位，所以被認(rèn)為可招募其他病毒蛋白并且參與dsRNA 的合成[16]。還有研究表明，其他呼腸孤病毒σNS 和μN(yùn)S 蛋白有重塑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，構(gòu)建新細(xì)胞器的功能[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，μN(yùn)S 與σNS 可以相互作用，且這種相互作用是造成病毒感染細(xì)胞中包涵體樣結(jié)構(gòu)中σNS 存在的直接原因。關(guān)于MRV、ARV 的研究都已說明μN(yùn)S、σNS 蛋白在病毒增殖過程中的重要作用，但這2 種蛋白在可引起人類疾病的NBV 中的表達(dá)情況至今還未見報(bào)道。

本研究中筆者觀察到，盡管σNS 在感染期間與包涵體樣結(jié)構(gòu)中的μN(yùn)S 共定位，但當(dāng)在沒有μN(yùn)S 表達(dá)的情況下，其在整個(gè)細(xì)胞中彌散分布。當(dāng)與μN(yùn)S共表達(dá)時(shí)，σNS 被重新分布并與μN(yùn)S 在包涵體樣結(jié)構(gòu)中共定位。因此，σNS 對(duì)于功能性病毒包涵體樣結(jié)構(gòu)的形成是必需的，但是在不存在μN(yùn)S 蛋白的情況下不能建立包涵體樣結(jié)構(gòu)。μN(yùn)S 和σNS 在沒有其他病毒蛋白的情況下相關(guān)聯(lián)，表明這種關(guān)聯(lián)可能介導(dǎo)σNS 定位于病毒感染細(xì)胞的包涵體樣結(jié)構(gòu)。與MRV和ARV的μN(yùn)S和σNS蛋白相同，筆者的結(jié)果還表明，NBV 的μN(yùn)S 蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中可獨(dú)立表達(dá)，且在無(wú)任何其他病毒蛋白表達(dá)時(shí)即具有形成包涵體樣結(jié)構(gòu)的能力。上述結(jié)果說明，μN(yùn)S 是NBV 病毒感染期間包涵體樣結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵因素，且該蛋白質(zhì)是包涵體形成所需的最小病毒成分。因此可知，μN(yùn)S 在NBV 病毒增殖的早期階段，通過形成病毒復(fù)制位點(diǎn)及募集病毒復(fù)制所必需蛋白的方式起重要作用。

綜上所述，μN(yùn)S 蛋白可在μN(yùn)S 轉(zhuǎn)染和NBV 病毒感染細(xì)胞中形成包涵體，σNS 蛋白可與μN(yùn)S 蛋白相互作用。上述結(jié)果揭示σNS 蛋白可通過與μN(yùn)S蛋白關(guān)聯(lián)的方式被招募到包涵體樣結(jié)構(gòu)中，這對(duì)于病毒的復(fù)制和裝配都非常重要，對(duì)呼腸孤病毒感染機(jī)制的研究、抗呼腸孤病毒藥物的研發(fā)具有重要意義。