劉佳，馬進(jìn)安，張錦明，趙顏忠，羅丹靜，張曉軍，付華平，闕凱琳，韓宸，張穎

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 腫瘤科，湖南 長沙 410011；2.中國人民解放軍301 醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100039；3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，湖南 長沙 410013）

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFRTKIs）吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼及奧希替尼（AZD9291）治療EGFR 突變的晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）療效超越了傳統(tǒng)化療[1-4]。約20%肺癌患者難以獲得組織學(xué)病理及突變基因檢測，基于EGFR 特異性分子探針的正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography,PET）可鑒定EGFR 突變。AZD9291 能與突變EGFR 特異性結(jié)合，理論上核素11C 標(biāo)記的AZD9291（11C-AZD9291）可作為檢測EGFR 突變的特異性分子探針[5]。本研究擬從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平驗(yàn)證11C-AZD9291 檢測19del 突變EGFR 蛋白的可行性。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備、試劑和動(dòng)物

11C-AZD9291 通過國產(chǎn)PET 自動(dòng)化11C 多 功能合成模塊來合成，11C-CH3-Triflate 與N-去甲基AZD9291 在堿性條件下反應(yīng)，經(jīng)高效液相色譜法純化和固相萃取得11C-AZD9291。孵箱購自北京傲松欣實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司，12 孔板購自上海拜力科技有限公司，異氟烷購自華中海威（北京）基因科技有限公司，A549、HCC827 肺腺癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；普通昆明小鼠15 只購自中國人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心，BALB/c 裸鼠9 只購自中國科學(xué)院動(dòng)物研究所（北京），厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)品購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，Explore Vista micro-PET/CT 成像及分析系統(tǒng)購自美國GE 公司。

1.2 普通昆明小鼠體內(nèi)11C-AZD9291 的生物學(xué) 分布

普通昆明小鼠尾靜脈注射300μCi 的11C-AZD9291，分別于5、15 及30 min 時(shí)處死5 只。稱取小鼠血、心及肝等重量并計(jì)算出每克組織攝取11C-AZD9291 注射劑量的百分?jǐn)?shù)。

1.3 荷瘤鼠micro-PET/CT 顯像

取正常傳代培養(yǎng)的人肺腺癌細(xì)胞株HCC827（EGFR 19del 突變）和A549（EGFR 野生型），常規(guī)培養(yǎng)后制成單細(xì)胞懸液（5×106個(gè)/ml），取0.2 ml 皮下接種于BALB/c 裸鼠上肢。接種2～4 周后將6 只腫瘤大小合適（直徑5～10 mm）的HCC827 荷瘤鼠分成實(shí)驗(yàn)組和阻斷組，每組3 只。實(shí)驗(yàn)組：尾靜脈注射2 mCi11C-AZD9291（0.21 Ci/kg）后，異氟烷氣體麻醉固定，20 min 后進(jìn)行micro-PET 動(dòng)物活體顯像與分析。阻斷組：尾靜脈同時(shí)注射阻斷劑厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)品（50 mg/kg）和2 mCi11C-AZD9291，20 min 后進(jìn)行動(dòng)物活體顯像與分析。3 只A549 荷瘤鼠尾靜脈注射2 mCi11C-AZD9291 作為對照組，同上述方法進(jìn)行動(dòng)物活體顯像與分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 普通昆明小鼠血液及各組織器官不同時(shí)間的放射性攝取率比較

普通昆明小鼠經(jīng)尾靜脈注射11C-AZD9291 后，血液放射性攝取量隨著時(shí)間延長迅速清除，在30 min 時(shí)下降至最低。除血液外，11C-AZD9291 在普通昆明小鼠體內(nèi)的分布主要在肝、腎及肺，而骨、肌肉及腦則攝取相對較低。5、15 和30 min 時(shí)血、肝、腎、肺、心及肌肉放射性攝取率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），5 min 較15 min 高（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 普通昆明小鼠血液及各組織器官不同時(shí)間的放射性攝取率比較 （n =5，%，±s）

表1 普通昆明小鼠血液及各組織器官不同時(shí)間的放射性攝取率比較 （n =5，%，±s）

標(biāo)本 5 min 15 min 30 min F 值 P 值血2.344±0.382 1.285±0.386 0.984±0.152 19.245 0.000心1.750±0.248 0.715±0.099 0.682±0.097 23.591 0.000 肺3.727±0.792 2.220±0.242 2.267±0.250 14.698 0.001脾1.957±0.294 1.963±0.633 2.482±0.302 2.354 0.137肝16.443±3.816 9.964±2.403 8.650±0.339 93.657 0.000腎4.845±0.775 2.207±0.168 2.075±0.208 54.513 0.000 肌肉 0.790±0.043 0.410±0.050 0.421±0.046 32.804 0.000骨0.693±0.177 0.494±0.081 0.550±0.115 3.077 0.083腦0.580±0.061 0.511±0.095 0.592±0.026 1.955 0.184

圖1 普通昆明小鼠血液及各組織器官11C-AZD9291 的生物分布 （n =5）

2.2 荷瘤鼠micro-PET/CT 顯像

實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠尾靜脈注射11C-AZD9291 20 min 后micro-PET/CT 成像顯示，接種腫瘤區(qū)存在明顯放射性濃聚；對照組瘤荷鼠尾靜脈注射11C-AZD9291 20 min后micro-PET/CT 成像顯示接種腫瘤區(qū)僅輕度放射性濃聚。實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠標(biāo)準(zhǔn)攝取值（standard uptake value,SUV）為（5.20±0.137），對照組為（2.60±0.066），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=29.566，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組高于對照組。見圖2。

2.3 荷瘤鼠阻斷后micro-PET/CT 顯像

阻斷組荷瘤鼠尾靜脈同時(shí)注射阻斷劑厄洛替尼和11C-AZD9291 20 min 后micro-PET/CT 成像顯示，接種腫瘤區(qū)僅輕度放射性濃聚。實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠SUV 為（5.20±0.137），阻斷組為（2.10±0.089），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=32.799，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組高于阻斷組。見圖2。

圖2 各組荷瘤鼠micro-PET/CT 顯像

3 討論

核醫(yī)學(xué)PET 成像技術(shù)是一種非侵入性和高度敏感的檢測方法，可以對體內(nèi)靶向分子的表達(dá)進(jìn)行定性及定量分析，研發(fā)出合適的放射性示蹤劑是實(shí)施此檢測技術(shù)的關(guān)鍵。第一、二代EGFR-TKIs 在人體內(nèi)既能與敏感突變的EGFR 結(jié)合，也能與野生的EGFR 結(jié)合，以其為基礎(chǔ)的分子探針，如11C-吉非替尼、18F-吉非替尼、11C-厄洛替尼及18F-阿法替尼等均為非特異性探針，能夠檢測EGFR 蛋白表達(dá)水平，但特異性識(shí)別腫瘤組織EGFR 突變的作用較差[6-13]。11C-厄洛替尼能有效地檢測EGFR 突變，但也存在著本底攝取較高、正常組織顯影的問題。第三代EGFR-TKIs產(chǎn)品AZD9291（奧希替尼）可與存在19del、L858R、T790M 等突變的EGFR 蛋白不可逆特異性結(jié)合，與突變型EGFR 的結(jié)合力是野生型的40 倍，具有較高的靶/本比。使用同位素標(biāo)記AZD9291，并將其作為PET-CT 示蹤劑檢測肺癌組織中EGFR 突變蛋白狀態(tài)是一項(xiàng)非常有意義的探索。

本研究結(jié)果顯示，11C-AZD9291 在實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠移植瘤區(qū)呈放射性濃聚，而周圍組織無或輕度攝取，對照組則顯示輕度放射性濃聚，實(shí)驗(yàn)組SUV 高于對照組。這說明11C-AZD9291 分子探針能與19del 突變的EGFR 蛋白特異性結(jié)合。阻斷組移植瘤區(qū)僅出現(xiàn)輕度放射性濃聚，實(shí)驗(yàn)組SUV 高于阻斷組。這說明在裸鼠模型中11C-AZD9291 能特異性結(jié)合移植瘤中19del 突變的EGFR 蛋白，并且能被厄洛替尼阻斷，證明11C-AZD9291 可用于檢測體內(nèi)EGFR 的19del突變狀態(tài)。結(jié)合本文所做的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明11C-AZD9291 作為載體特異性分子探針檢測EGFR 蛋白19del 突變是可行的。

通過分析普通昆明小鼠血液及各器官的11C-AZD9291 的生物學(xué)分布，筆者發(fā)現(xiàn)11C-AZD9291 在肝臟的放射攝取值最高，并隨時(shí)間推移迅速下降，說明11C-AZD9291 的代謝可能是通過肝臟的快速清除實(shí)現(xiàn)的，這與其他EGFR-TKIs 分子探針的代謝機(jī)制相類 似[14-16]。肝臟對11C-AZD9291 攝取率最高，其次為腎、肺，這可能是由于野生型EGFR 在正常組織中也有一定表達(dá)，也會(huì)影響11C-AZD9291 對EGFR19del 突變?nèi)朔伟┑母闻K、腎臟轉(zhuǎn)移灶的顯影[17]。大腦的放射性攝取率較低可能與正常腦組織中EGFR 表達(dá)水平低有關(guān)[18]。

本研究仍存在不足，例如11C-AZD9291 探針不能區(qū)分EGFR 突變的類型，只能通過檢測腫瘤與探針結(jié)合的能力，間接反映是否存在EGFR 突變。所用標(biāo)記核素11C 的半衰期過短，不適合臨床的廣泛應(yīng)用。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)11C-AZD9291 分子探針對存在19del 突變的EGFR 蛋白具有較好的特異性結(jié)合能力。11C-AZD9291 分子探針能否示蹤存在L858R、T790M等突變的EGFR 蛋白，后續(xù)將進(jìn)一步研究。