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        11C-AZD9291分子探針檢測肺癌EGFR 19del突變的實(shí)驗(yàn)研究*

        2020-02-12 02:04:48劉佳馬進(jìn)安張錦明趙顏忠羅丹靜張曉軍付華平闕凱琳韓宸張穎
        關(guān)鍵詞:荷瘤昆明放射性

        劉佳,馬進(jìn)安,張錦明,趙顏忠,羅丹靜,張曉軍,付華平,闕凱琳,韓宸,張穎

        (1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 腫瘤科,湖南 長沙 410011;2.中國人民解放軍301 醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科,北京 100039;3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,湖南 長沙 410013)

        表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFRTKIs)吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼及奧希替尼(AZD9291)治療EGFR 突變的晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)療效超越了傳統(tǒng)化療[1-4]。約20%肺癌患者難以獲得組織學(xué)病理及突變基因檢測,基于EGFR 特異性分子探針的正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography,PET)可鑒定EGFR 突變。AZD9291 能與突變EGFR 特異性結(jié)合,理論上核素11C 標(biāo)記的AZD9291(11C-AZD9291)可作為檢測EGFR 突變的特異性分子探針[5]。本研究擬從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平驗(yàn)證11C-AZD9291 檢測19del 突變EGFR 蛋白的可行性。

        1 材料與方法

        1.1 設(shè)備、試劑和動(dòng)物

        11C-AZD9291 通過國產(chǎn)PET 自動(dòng)化11C 多 功能合成模塊來合成,11C-CH3-Triflate 與N-去甲基AZD9291 在堿性條件下反應(yīng),經(jīng)高效液相色譜法純化和固相萃取得11C-AZD9291。孵箱購自北京傲松欣實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司,12 孔板購自上海拜力科技有限公司,異氟烷購自華中海威(北京)基因科技有限公司,A549、HCC827 肺腺癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;普通昆明小鼠15 只購自中國人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心,BALB/c 裸鼠9 只購自中國科學(xué)院動(dòng)物研究所(北京),厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)品購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司,Explore Vista micro-PET/CT 成像及分析系統(tǒng)購自美國GE 公司。

        1.2 普通昆明小鼠體內(nèi)11C-AZD9291 的生物學(xué) 分布

        普通昆明小鼠尾靜脈注射300μCi 的11C-AZD9291,分別于5、15 及30 min 時(shí)處死5 只。稱取小鼠血、心及肝等重量并計(jì)算出每克組織攝取11C-AZD9291 注射劑量的百分?jǐn)?shù)。

        1.3 荷瘤鼠micro-PET/CT 顯像

        取正常傳代培養(yǎng)的人肺腺癌細(xì)胞株HCC827(EGFR 19del 突變)和A549(EGFR 野生型),常規(guī)培養(yǎng)后制成單細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/ml),取0.2 ml 皮下接種于BALB/c 裸鼠上肢。接種2~4 周后將6 只腫瘤大小合適(直徑5~10 mm)的HCC827 荷瘤鼠分成實(shí)驗(yàn)組和阻斷組,每組3 只。實(shí)驗(yàn)組:尾靜脈注射2 mCi11C-AZD9291(0.21 Ci/kg)后,異氟烷氣體麻醉固定,20 min 后進(jìn)行micro-PET 動(dòng)物活體顯像與分析。阻斷組:尾靜脈同時(shí)注射阻斷劑厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)品(50 mg/kg)和2 mCi11C-AZD9291,20 min 后進(jìn)行動(dòng)物活體顯像與分析。3 只A549 荷瘤鼠尾靜脈注射2 mCi11C-AZD9291 作為對照組,同上述方法進(jìn)行動(dòng)物活體顯像與分析。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗(yàn)或隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 普通昆明小鼠血液及各組織器官不同時(shí)間的放射性攝取率比較

        普通昆明小鼠經(jīng)尾靜脈注射11C-AZD9291 后,血液放射性攝取量隨著時(shí)間延長迅速清除,在30 min 時(shí)下降至最低。除血液外,11C-AZD9291 在普通昆明小鼠體內(nèi)的分布主要在肝、腎及肺,而骨、肌肉及腦則攝取相對較低。5、15 和30 min 時(shí)血、肝、腎、肺、心及肌肉放射性攝取率比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),5 min 較15 min 高(P<0.05)。見表1和圖1。

        表1 普通昆明小鼠血液及各組織器官不同時(shí)間的放射性攝取率比較 (n =5,%,±s)

        表1 普通昆明小鼠血液及各組織器官不同時(shí)間的放射性攝取率比較 (n =5,%,±s)

        標(biāo)本 5 min 15 min 30 min F 值 P 值血2.344±0.382 1.285±0.386 0.984±0.152 19.245 0.000心1.750±0.248 0.715±0.099 0.682±0.097 23.591 0.000 肺3.727±0.792 2.220±0.242 2.267±0.250 14.698 0.001脾1.957±0.294 1.963±0.633 2.482±0.302 2.354 0.137肝16.443±3.816 9.964±2.403 8.650±0.339 93.657 0.000腎4.845±0.775 2.207±0.168 2.075±0.208 54.513 0.000 肌肉 0.790±0.043 0.410±0.050 0.421±0.046 32.804 0.000骨0.693±0.177 0.494±0.081 0.550±0.115 3.077 0.083腦0.580±0.061 0.511±0.095 0.592±0.026 1.955 0.184

        圖1 普通昆明小鼠血液及各組織器官11C-AZD9291 的生物分布 (n =5)

        2.2 荷瘤鼠micro-PET/CT 顯像

        實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠尾靜脈注射11C-AZD9291 20 min 后micro-PET/CT 成像顯示,接種腫瘤區(qū)存在明顯放射性濃聚;對照組瘤荷鼠尾靜脈注射11C-AZD9291 20 min后micro-PET/CT 成像顯示接種腫瘤區(qū)僅輕度放射性濃聚。實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠標(biāo)準(zhǔn)攝取值(standard uptake value,SUV)為(5.20±0.137),對照組為(2.60±0.066),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=29.566,P=0.000),實(shí)驗(yàn)組高于對照組。見圖2。

        2.3 荷瘤鼠阻斷后micro-PET/CT 顯像

        阻斷組荷瘤鼠尾靜脈同時(shí)注射阻斷劑厄洛替尼和11C-AZD9291 20 min 后micro-PET/CT 成像顯示,接種腫瘤區(qū)僅輕度放射性濃聚。實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠SUV 為(5.20±0.137),阻斷組為(2.10±0.089),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.799,P=0.000),實(shí)驗(yàn)組高于阻斷組。見圖2。

        圖2 各組荷瘤鼠micro-PET/CT 顯像

        3 討論

        核醫(yī)學(xué)PET 成像技術(shù)是一種非侵入性和高度敏感的檢測方法,可以對體內(nèi)靶向分子的表達(dá)進(jìn)行定性及定量分析,研發(fā)出合適的放射性示蹤劑是實(shí)施此檢測技術(shù)的關(guān)鍵。第一、二代EGFR-TKIs 在人體內(nèi)既能與敏感突變的EGFR 結(jié)合,也能與野生的EGFR 結(jié)合,以其為基礎(chǔ)的分子探針,如11C-吉非替尼、18F-吉非替尼、11C-厄洛替尼及18F-阿法替尼等均為非特異性探針,能夠檢測EGFR 蛋白表達(dá)水平,但特異性識(shí)別腫瘤組織EGFR 突變的作用較差[6-13]。11C-厄洛替尼能有效地檢測EGFR 突變,但也存在著本底攝取較高、正常組織顯影的問題。第三代EGFR-TKIs產(chǎn)品AZD9291(奧希替尼)可與存在19del、L858R、T790M 等突變的EGFR 蛋白不可逆特異性結(jié)合,與突變型EGFR 的結(jié)合力是野生型的40 倍,具有較高的靶/本比。使用同位素標(biāo)記AZD9291,并將其作為PET-CT 示蹤劑檢測肺癌組織中EGFR 突變蛋白狀態(tài)是一項(xiàng)非常有意義的探索。

        本研究結(jié)果顯示,11C-AZD9291 在實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠移植瘤區(qū)呈放射性濃聚,而周圍組織無或輕度攝取,對照組則顯示輕度放射性濃聚,實(shí)驗(yàn)組SUV 高于對照組。這說明11C-AZD9291 分子探針能與19del 突變的EGFR 蛋白特異性結(jié)合。阻斷組移植瘤區(qū)僅出現(xiàn)輕度放射性濃聚,實(shí)驗(yàn)組SUV 高于阻斷組。這說明在裸鼠模型中11C-AZD9291 能特異性結(jié)合移植瘤中19del 突變的EGFR 蛋白,并且能被厄洛替尼阻斷,證明11C-AZD9291 可用于檢測體內(nèi)EGFR 的19del突變狀態(tài)。結(jié)合本文所做的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,說明11C-AZD9291 作為載體特異性分子探針檢測EGFR 蛋白19del 突變是可行的。

        通過分析普通昆明小鼠血液及各器官的11C-AZD9291 的生物學(xué)分布,筆者發(fā)現(xiàn)11C-AZD9291 在肝臟的放射攝取值最高,并隨時(shí)間推移迅速下降,說明11C-AZD9291 的代謝可能是通過肝臟的快速清除實(shí)現(xiàn)的,這與其他EGFR-TKIs 分子探針的代謝機(jī)制相類 似[14-16]。肝臟對11C-AZD9291 攝取率最高,其次為腎、肺,這可能是由于野生型EGFR 在正常組織中也有一定表達(dá),也會(huì)影響11C-AZD9291 對EGFR19del 突變?nèi)朔伟┑母闻K、腎臟轉(zhuǎn)移灶的顯影[17]。大腦的放射性攝取率較低可能與正常腦組織中EGFR 表達(dá)水平低有關(guān)[18]。

        本研究仍存在不足,例如11C-AZD9291 探針不能區(qū)分EGFR 突變的類型,只能通過檢測腫瘤與探針結(jié)合的能力,間接反映是否存在EGFR 突變。所用標(biāo)記核素11C 的半衰期過短,不適合臨床的廣泛應(yīng)用。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)11C-AZD9291 分子探針對存在19del 突變的EGFR 蛋白具有較好的特異性結(jié)合能力。11C-AZD9291 分子探針能否示蹤存在L858R、T790M等突變的EGFR 蛋白,后續(xù)將進(jìn)一步研究。

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