徐曉園，李文麗，徐 嵐，李 蕊，

(1．汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東汕頭 515041；2．汕頭大學醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室，廣東 汕頭 515041)

手足口病是一種由腸道病毒感染引起的傳染性疾病，多發(fā)于5歲以下嬰幼兒，在手、足、口腔黏膜、肛周等部位出現(xiàn)皰疹或潰瘍[1-2]。手足口病通常具有自限性，多數(shù)患兒1周左右自愈，但少數(shù)患兒會出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、心肌炎、肺水腫等中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥，迅速進展為重癥手足口病，嚴重時可造成死亡[3-4]。手足口病在我國高發(fā)，為我國公共健康帶來巨大威脅，2008年衛(wèi)生部將其納入丙類傳染病進行管理[5]。

引發(fā)手足口病的腸道病毒有柯薩奇病毒A組2-10、12、16、24型，B組1-5型以及腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)等，其中最主要的病原為EV71和柯薩奇病毒A組16型(coxsackie virus group A type 16，CA16)[6-8]。通常CA16引起的癥狀相對較輕但感染病例數(shù)量大，EV71則更容易引起神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，導致重癥手足口[9-10]。

CA16和EV71均屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，為無包膜的正向單鏈RNA病毒，其衣殼為二十面體對稱結構，病毒衣殼有VP1、VP2、VP3和VP4構成，四種衣殼蛋白均由共同的蛋白前體逐步水解而來。對于腸道病毒屬的病毒來說，VP1是重要的衣殼蛋白，是病毒吸附蛋白，在病毒吸附和穿入過程中起決定作用；同時VP1又是病毒的中和抗原，可誘導機體產(chǎn)生中和抗體。手足口病疫情呈逐年嚴重趨勢，而在預防手段方面，針對EV71病毒目前僅有滅活疫苗上市，CA16尚無疫苗應用[11-12]。因此本研究構建CA16和EV71的VP1真核表達載體，一方面重組表達的VP1具有潛在的亞單位疫苗應用前景，另一方面亦可考慮作為DNA疫苗，為CA16和EV71的疫苗研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臨床及實驗室確診的CA16和EV71感染病例糞便標本由微生物學與免疫學教研室保存；質(zhì)粒pcFlag、大腸桿菌DH5α菌株由微生物學與免疫學教研室保存；293T細胞及RD細胞均購自中國科學院上海細胞所。高特異性PCR擴增酶Pfu Taq，通用型DNA回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、病毒RNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。DNA分子量標準，限制性內(nèi)切酶Hin dⅢ、XhoⅠ及T4 DNA ligase購自NEB(北京)公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。細胞培養(yǎng)基DMEM為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)為杭州四季青公司產(chǎn)品。蛋白酶抑制劑(complete Mini，EDTA-free protease inhibitor cocktail)為Roche公司產(chǎn)品。鼠抗FLAG一抗，HRP標記羊抗鼠二抗，Cy3標記羊抗鼠二抗均為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

1.2 病毒RNA提取與逆轉錄

CA16和EV71感染病例糞便標本經(jīng)無菌生理鹽水重懸震蕩混勻后，離心收取上清，使用病毒RNA提取試劑盒分別提取病毒RNA，利用SuperScriptⅢ逆轉錄酶和隨機引物，逆轉錄獲得CA16和EV71的病毒cDNA。

1.3 目的片段獲取

VP1編碼區(qū)的擴增分別以CA16和EV71病毒cDNA為模板，CA16病毒VP1基因的上游引物5′-CC TAAGCTTTCTGGGTACTTTGACTATTACACC-3′，下游引 物 5′-CAGCTCGAGTCATGTTGTTATCTTGTCTCTA CTAC-3′。EV71病毒VP1基因的上游引物5′-CCTAA GCTTTATGCCCGAGATGGAGTGTTTGAC-3′，下游引物 5′-CAGCTCGAGTCATTTCCCAAGAGTGGTGATTG CTG-3′。反應條件：94℃預變性3 min后進入循環(huán)，94℃變性30 s，52℃復性30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)后72℃延伸5 min。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，回收相應的產(chǎn)物片斷。

1.4 重組載體構建與鑒定

將上述PCR產(chǎn)物及pcFlag載體利用Hin dⅢ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)DNA回收試劑盒回收，外源片段分別與pcFlag載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接，得到真核表達質(zhì)粒pcFlag-EV71-VP1及pcFlag-CA16-VP1。兩種質(zhì)粒分別轉化DH5α感受態(tài)細胞，篩選具有卡那霉素抗性的單克隆進行菌落PCR鑒定。菌落PCR所用引物為測序引物，反應條件同前。選擇菌落PCR陽性的單菌落送至華大基因科技有限公司測序。經(jīng)序列分析，選取測序正確的克隆擴大培養(yǎng)，利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒。

1.5 細胞培養(yǎng)與轉染

293T細胞及RD細胞均用DMEM(含10%FBS)在37℃、CO2體積分數(shù)為5%條件下培養(yǎng)。轉染前，將生長至95%以上融合率的細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板(用于免疫熒光檢測的細胞，在6孔板內(nèi)放置無菌蓋玻片，使細胞爬片生長)。待細胞生長20～24 h至鋪滿70%～90%瓶底面積時進行轉染。轉染操作按照Lipofectamine 2000轉染試劑的操作手冊進行。轉染后48 h檢測外源蛋白表達及定位情況。

1.6 Western blot檢測外源蛋白表達

6孔板培養(yǎng)的細胞棄去培養(yǎng)基后，每孔加入200 μL含蛋白酶抑制劑的1×SDS-PAGE上樣緩沖液，冰浴條件下裂解細胞，10 min之后進行12%SDS-PAGE電泳，利用半干轉印系統(tǒng)轉移蛋白至NC膜。5%脫脂奶粉室溫封閉NC膜1 h，1∶200稀釋鼠抗FLAG一抗，4℃孵育NC膜過夜，HRP標記羊抗鼠二抗(1∶2 500稀釋)室溫孵育1～1.5 h，曝光觀察結果。

1.7 免疫熒光檢測外源蛋白細胞內(nèi)定位

轉染后的細胞，取出蓋玻片經(jīng)PBS清洗、4%多聚甲醛室溫固定以及穿透液處理后，使用3%BSA室溫封閉30 min，加入一抗37℃孵育1 h，清洗后加入Cy3標記羊抗鼠二抗，37℃避光孵育30 min清洗3次，每張蓋玻片上滴加0.5μg/mL的DAPI 100μL，避光染色5 min，清洗3次。最后用30%甘油封片，在熒光顯微鏡(Olympus BX51)下觀察細胞核(藍色)及細胞內(nèi)紅色熒光的分布。

2 結果

2.1 CA16和EV71毒株VP1片段的擴增

以本實驗室所保存的確診CA16和EV71感染病例糞便標本所轉錄出的cDNA為模板，使用材料方法中的引物進行PCR擴增，其產(chǎn)物應為1 089 bp的DNA片段，該序列所編碼的蛋白含363個氨基酸，相對分子質(zhì)量約3.9×104。電泳結果如圖1所示，PCR產(chǎn)物主帶長度約為1 100 bp，與預計相符。

圖1 CA16和EV71毒株VP1片段PCR擴增電泳圖

2.2 CA16和EV71毒株VP1片段及真核表達載體pc Flag的酶切回收與連接

CA16和EV71毒株VP1 PCR產(chǎn)物，利用瓊脂糖凝膠電泳，回收預計片段長度的擴增主帶，利用HindⅢ和XhoⅠ對VP1片段和pcFlag質(zhì)粒進行雙酶切，酶切產(chǎn)物再次利用瓊脂糖凝膠電泳回收相應片段(圖2)，CA16和EV71毒株VP1分別與pcFlag質(zhì)粒進行連接。

2.3 含有CA16和EV71毒株VP1的真核表達質(zhì)粒構建和鑒定

CA16和EV71毒株VP1分別與pcFlag質(zhì)粒進行連接，轉化感受態(tài)細胞后，經(jīng)抗性篩選的單菌落各挑選8個進行菌落PCR鑒定，如圖3所示，CA16的VP1真核表達質(zhì)粒pcFlag-CA16-VP1和EV71的VP1真核表達質(zhì)粒pcFlag-EV71-VP1的16個菌落均能擴增出相應的VP1片段。

圖3 pc Flag-CA16-VP1及pc Flag-EV71-VP1重組質(zhì)粒的PCR鑒定

經(jīng)菌落PCR鑒定陽性的菌落各挑取2個克隆進行細菌培養(yǎng)和質(zhì)粒提取，進行酶切鑒定，如圖4所示，經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后，均出現(xiàn)1100 bp左右的VP1外源片段和約5 kb的pcFlag載體片段。酶切鑒定的質(zhì)粒進行測序分析，結果完全正確，質(zhì)粒分別命名為pcFlag-CA16-VP1和pcFlag-EV71-VP1。

圖4 重組質(zhì)粒pcFlag-CA16-VP1和pcFlag-EV71-VP1的雙酶切鑒定

2.4 VP1蛋白在細胞中的外源重組表達

經(jīng)酶切以及測序驗證的重組質(zhì)粒pcFlag-CA16-VP1和pcFlag-EV71-VP1分別轉染293T和RD細胞，利用抗FLAG抗體進行Western blot檢測。結果如圖5所示，在約39 kD的位置出現(xiàn)了與預計長度相符的條帶，表明所構建的重組真核表達質(zhì)?？稍?93T和RD細胞中表達出與FLAG融合的VP1重組蛋白。

2.5 重組VP1蛋白在細胞內(nèi)的定位

重組質(zhì)粒pcFlag-CA16-VP1和pcFlag-EV71-VP1分別轉染293T細胞，利用免疫熒光檢測重組VP1的表達，結果如圖6所示，CA16和EV71重組VP1蛋白(紅色)主要分布于轉染細胞的細胞質(zhì)中。

圖5 重組VP1蛋白在293T和RD細胞中外源表達的Western blot檢測

圖6 重組VP1蛋白在293T和RD細胞中外源表達及定位的免疫熒光檢測

3 討論

手足口病在我國高發(fā)流行，為兒童的公共健康帶來巨大威脅，位居2015年我國法定傳染病報告發(fā)病率首位，感染人數(shù)高達1 997 371人(數(shù)據(jù)來源：http://www.nhfpc.gov.cn/，2015年全國法定傳染病疫情概況)。目前臨床缺乏手足口特異性治療藥物，多以對癥和支持治療為主。盡管可引起手足口病的病原包括CA16和EV71在內(nèi)的20余種/型腸道病毒，但在免疫預防方面，目前僅有EV71的滅活疫苗應用于臨床[12-13]。該滅活疫苗是利用已滅活無感染性的EV71病毒衣殼，經(jīng)肌注后依靠體內(nèi)專職抗原提呈細胞加工處理后，激活機體產(chǎn)生免疫應答，為MHC-II類分子依賴的外源性抗原提呈。自然條件下病毒感染更多的是以MHC-I類分子依賴的內(nèi)源性抗原提呈方式激活機體免疫，因此，為更好地提高疫苗的免疫保護力，除滅活疫苗外有多種其他形式的疫苗被研究或應用[11-14]。

鑒于目前手足口病的預防，CA16尚無疫苗應用，EV71僅有滅活疫苗，免疫效果更好，可針對多種手足口病原體的疫苗研究，仍是亟待解決的問題。本實驗成功構建了CA16和EV71的真核重組表達載體，在體外轉染細胞中成功表達出兩種病毒的重組VP1蛋白，且外源表達的VP1蛋白均分布于細胞質(zhì)中。我們的研究為進一步構建手足口病的DNA疫苗提供研究基礎；同時，作為腸道病毒最為重要的中和抗原，真核重組表達的VP1蛋白亦可考慮作為免疫原應用于亞單位疫苗的研究，為手足口病的亞單位疫苗研究提供了重要基礎。