金 磊，周珈右，韓家誠 ，管浩軍，王 帥，彭 潔，王 欣，海春旭，李文麗，

(1．空軍軍醫(yī)大學預防醫(yī)學系軍事毒理學與防化醫(yī)學教研室，特殊作業(yè)環(huán)境危害評估與防治教育部重點實驗室，陜西省自由基生物學與醫(yī)學重點實驗室，陜西 西安 710032；2．空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院學員隊，陜西 西安 710032）

二型糖尿病(type 2 diabctesmellitus，T2DM)是威脅全球人類健康的最重要的非傳染性疾病之一，近年來，T2DM及糖尿病前期罹患率飛速增長。糖尿病不僅損害了患者的精神和肉體，還使得個體生存質(zhì)量顯著下降，罹患心血管事件及死亡風險明顯升高，由此導致的衛(wèi)生支出增加也給個體和社會造成了沉重負擔。T2DM的發(fā)病機制不清，有許多假說，如遺傳學說、肥胖學說、胰島素失代償學說、脂毒性學說、氧化應激學說等。隨著對T2DM發(fā)病機制研究的深入[1]，有關的治療藥物日趨豐富與多樣化[2]，但多存在非治療副反應。而中藥日益受到人們的關注。研究發(fā)現(xiàn)，除根皮苷、小檗堿外，姜黃素、齊墩果酸、黃芪、葛根素等多種中藥組分及中成制劑均具有降低血糖、血脂，減輕胰島素抵抗(insulin resistance，IR)等效果。因此，對植物提取物的重新認識，讓人們對其作用的有效部位、作用機理有更深刻的認識，并對其改造成為治療T2DM的有生力量[3]。中藥槐角在臨床上能較好地控制高脂血癥，而降脂酮(JZT)是槐角提取后得到的有效制劑，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)其有較好降低脂肪和類脂效果，但在體外及IR中的效果尚無研究。我們前期建立了棕櫚酸(palmitic acid，PA）誘導大鼠肝細胞系BRL-3A胰島素抵抗細胞模型[4]。本實驗研究降脂酮對棕櫚酸誘導BRL-3A細胞IR模型糖脂代謝及氧化應激的影響，為探討降脂酮作為治療胰島素抵抗的T2DM候選藥提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

BRL-3A細胞為大鼠肝細胞系，購自中國科學院上海細胞生物學研究所。RMPI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，MTT購自Amresco公司，DMSO、PA、DCFH-DA購自Sigma公司，JZT由中國科學院化學研究所自由基研究室提供，新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶和BSA購自西安國安生物科技有限公司，BCA蛋白定量分析試劑盒購自Thermo公司，葡萄糖測定試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司，甘油三酯(TG)測試盒、微量還原性谷胱甘肽(GSH)測試盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測試盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、過氧化氫酶(CAT)測試盒、總抗氧化能力(T-AOC)測試盒、總膽固醇(TC)測試盒均購自南京建成生物工程研究所。其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

醫(yī)用型潔凈工作臺(SW-CJ，蘇州安泰空氣技術有限公司）；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司），全波段酶標儀(Infinite 200 PRO)；全自動高速冷凍離心機(Sigma公司），流式細胞儀(BD Accuri C6）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與分組當處于對數(shù)生長期BRL-3A肝細胞匯合度超過90%時，胰酶消化離心后棄去上清液將細胞收集，加入完全培養(yǎng)基重懸成單細胞懸液。調(diào)整細胞濃度約為1×105/mL，將細胞接種于微孔板，接種量為每孔100 μL/孔(96孔板)和500 μL/孔(96孔板)。在37℃恒溫、飽和濕度、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀察細胞匯合度超過80%時按實驗分組處理。觀察微孔板細胞處于對數(shù)生長期，用PBS溶液洗滌3次后，施加以下處理因素，置于37℃培養(yǎng)箱不同時間后實驗。對照組加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液；PA組100μmol/L PA培養(yǎng)12 h；JZT組用JZT預處理后，換用100μmol/L PA培養(yǎng)12 h。以上每組均設復孔，重復3次。

1.3.2 MTT法檢測細胞活力MTT(5 mg/mL)儲備液解凍后，將MTT儲備液：RPMI-1640培養(yǎng)液按1∶9比例稀釋成MTT工作液。細胞經(jīng)處理完畢后，每孔加入MTT工作液200μL，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。終止孵育，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150μL DMSO，振蕩溶解紫色結晶3 min。酶標儀上測定各孔490 nm波長處吸光度D(490)值。按下式計算處理組細胞相對生存率：

處理組細胞相對生存率=D(490)處理組/D(490)對照組×100%

1.3.3 糖代謝指標測定具體操作步驟參照參考文獻[4]。

1.3.4 脂代謝指標測定TG、TC、HDL-C、LDL-C測定按試劑盒說明書操作。酶標儀上測定500 nm波長處吸光度D(500)值，按下式計算各指標含量(以TG為例）：

1.3.5 DCFH-DA熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS6孔板中細胞按實驗分組處理后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，避光加入DCFH-DA(10μmol/L，每孔1 mL)，于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。PBS溶液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。胰酶消化離心收集細胞，PBS溶液洗滌，離心收集細胞沉淀。加入PBS溶液1 mL重懸成單細胞懸液，置于流式細胞儀檢測(EX 488 nm，EM 530 nm)。數(shù)據(jù)獲取和分析采用CFlowPlus軟件。

1.3.6 氧化還原指標測定MDA、T-AOC、CAT、GSH測定按試劑盒說明書操作。酶標儀測定各孔及空白孔吸光度D(520)值。按下式計算各指標含量(以MDA為例）：

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用xˉ±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA analysis)，并用LSD-t檢驗進行兩兩比較。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 降脂酮對BRL-3A細胞生存率的影響

2.1.1 高濃度降脂酮降低BRL-3A細胞的生存率MTT實驗結果見圖1，降脂酮對BRL-3A細胞生存率影響呈時間-效應和劑量-效應關系。25 mg/mL降脂酮作用于BRL-3A細胞12或24 h，細胞生存率與對照組相比顯著降低(P＜0.05)。因此，作為改善IR、治療T2DM候選藥物，篩選時應選擇0.062 5～1 mg/mL作用1、2 h。

圖1 1.562 5～25 mg/mL降脂酮對BRL-3A細胞相對生存率的影響

2.1.2 低濃度降脂酮對BRL-3A細胞生存率無明顯影響MTT實驗結果見圖2，低濃度降脂酮相對于高濃度組，對BRL-3A細胞生存率影響較小，0.062 5～1 mg/mL作用1、2 h對BRL-3A細胞生存率無明顯影響 (P＞0.05)。作用6、12 h還可輕度增加細胞生存率，而在長時間(24 h)作用后細胞生存率比對照組降低(P＜0.05)，為避免藥物對細胞的增殖和抑制作用對后續(xù)檢測指標造成偏倚，選0.062 5～1 mg/mL作用1、2 h為藥物實驗條件。

2.2 降脂酮增加IR模型細胞的糖代謝水平

2.2.1 高濃度降脂酮增加IR模型細胞的基礎葡萄糖消耗因降脂酮作用3、6、12、24 h對BRL-3A細胞生存率有影響，故選取0.5、1、2 h進行預處理。結果(圖3)顯示，較高濃度(0.625～10 mg/mL)降脂酮預處理不同時間(0.5、1、2 h)細胞葡萄糖攝取能力，與模型組相比均明顯改善(P＜0.05)，且與對照組相當(P＞0.05)。

2.2.2 低濃度降脂酮增加IR模型細胞的基礎葡萄糖消耗采用低濃度(0.062 5～1 mg/mL)降脂酮預處理0.5、1、2 h后造模檢測葡萄糖消耗結果見圖4，降脂酮預處理0.5 h未改善模型細胞葡萄糖攝取能力，而預處理1、2 h均可改善模型細胞葡萄糖攝取能力(P＜0.05)，其中1 h改善效果最明顯。故此后均采用1 h預處理后造模檢測相關指標。

圖2 0.062 5～1 mg/mL降脂酮對BRL-3A細胞相對生存率的影響

圖3 0.625～10 mg/mL降脂酮對IR模型細胞基礎葡萄糖消耗的影響

圖4 0.0625～1 mg/mL降脂酮對IR模型細胞基礎葡萄糖消耗的影響

2.3 降脂酮改善IR模型細胞的脂代謝水平

2.3.1 降脂酮降低IR模型細胞的TG含量培養(yǎng)液中TG含量檢測結果如圖5A所示，與對照組(0.018 mmol/L)相比，模型組細胞的培養(yǎng)液中TG含量(0.059 mmol/L)明顯增加(P＜0.05)。用降脂酮預處理后有所降低(0.034、0.034、0.035、0.030 mmol/L)，與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。細胞中TG含量檢測結果如圖5B所示，與對照組(0.808 nmol/mg)相比，模型組細胞TG含量(1.805 nmol/mg)明顯增高(P＜0.05)。各劑量降脂酮預處理組細胞內(nèi)TG含量明顯降低(0.539、0.534、0.459、0.407 nmol/mg，P＜0.05)。因此，降脂酮可改善PA導致的BRL-3A細胞內(nèi)外TG代謝紊亂，減輕細胞IR。

圖5 降脂酮對IR模型BRL-3A型細胞TG含量的影響

2.3.2 降脂酮降低IR模型細胞的TC含量培養(yǎng)液中TC含量檢測結果如圖6A所示，與對照組(0.110 mmol/L)相比，模型組及降脂酮組BRL-3A細胞模的培養(yǎng)液中TC含量(0.096、0.105、0.109、0.098、0.100 mmol/L，P＞0.05)無明顯變化。細胞中TC含量檢測結果如圖6B所示，與對照組(0.680 nmol/mg)相比，模型組細胞TC含量(1.249 nmol/mg)明顯增加(P＜0.05)。各劑量降脂酮組預處理后細胞內(nèi)TG含量明顯降低(0.521、0.463、0.261、0.359 nmol/mg，P＜0.05)。因此，降脂酮可改善PA導致的BRL-3A細胞TC代謝紊亂，減輕細胞IR。

圖6 降脂酮對IR模型細胞TC含量的影響

2.3.3 降脂酮增加IR模型細胞HDL-C含量和降低LDL-C含量HDL-C檢測結果如圖7A所示，與對照組(0.193 nmol/mg)相比，模型組細胞中HDL-C含量(0.020 nmol/mg)明顯降低(P＜0.05)。用降脂酮預處理后，隨著濃度加大，細胞HDL-C含量逐漸增高(0.024、0.038、0.108 nmol/mg)，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應關系。1 mg/mL降脂酮預處理細胞后，其HDL-C水平達到最高(0.172 nmol/mg)，與模型組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。提示降脂酮可改善PA導致的BRL-3A細胞HDL-C水平降低，使得細胞逆向膽固醇轉運能力增強，從而改善細胞IR。

細胞中LDL-C含量檢測結果如圖7B所示，與對照組(0.186 nmol/mg)相比，模型組細胞中LDL-C含量(0.947 nmol/mg)明顯增加(P＜0.05)。在加用降脂酮預處理后，隨著濃度加大，細胞中LDL-C含量逐漸降低(0.704、0.533、0.639 nmol/mg)，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應關系。在1 mg/mL降脂酮預處理細胞后，其LDL-C水平達到最低(0.185 nmol/mg)，與模型組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。表明降脂酮可改善PA導致的BRL-3A細胞LDL-C含量升高，從而改善細胞IR。

2.4 降脂酮改善IR模型細胞的氧化應激水平

2.4.1 降脂酮降低IR模型細胞的ROS水平與對照組相比，模型組細胞內(nèi)ROS峰值發(fā)生右移，從對照組的50%依次升高至68.4%，在降脂酮預處理后ROS升高的細胞比例逐漸下降(67.5%、67.5%、62.1%、61.7%)。分析熒光強度發(fā)現(xiàn)，模型組相對熒光度與對照組相比明顯增加(P＜0.05)，小劑量降脂酮(0.125 mg/mL)未降低PA導致細胞ROS水平升高。隨降脂酮濃度增加，細胞內(nèi)ROS水平逐漸下降，雖相對熒光度仍較高，但與對照組相比已無統(tǒng)計學差異(圖8）。因此，降脂酮可降低PA導致的BRL-3A細胞內(nèi)ROS水平升高，改善了細胞的氧化應激損傷程度，且存在劑量-效應關系。

圖8 降脂酮對IR模型細胞ROS水平的影響

2.4.2 降脂酮降低IR模型細胞的MDA含量、CAT活性和GSH含量細胞MDA含量檢測結果如圖9A所示，與對照組(0.27 nmol/mg)相比，模型組細胞內(nèi)MDA含量明顯增高(2.63 nmol/mg，P＜0.05)。用降脂酮預處理后細胞MDA含量明顯下降(0.63、0.77、0.87、0.50 nmol/mg，P＜0.05)。因此，降脂酮可減少PA導致的BRL-3A細胞內(nèi)MDA含量增高，降低了脂質(zhì)過氧化程度，進一步驗證了降脂酮可減輕PA對細胞造成的氧化應激損傷。

CAT活性檢測結果如圖9B所示，與對照組(2.08 U/mL)相比，模型組CAT活性(0.30 U/mL)明顯降低(P＜0.05)，用降脂酮預處理后細胞CAT活性明顯改善(0.85、0.91、1.14、1.74 U/mL，P＜0.05)。因此，降脂酮可改善IR引起的CAT活性下降，恢復細胞清除羥自由基(·OH)的能力，減輕細胞氧化應激損傷，進而保護細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細胞的正常代謝。GSH檢測結果如圖9C所示，與對照組相比，模型組及降脂酮組BRL-3A細胞內(nèi)GSH含量均無明顯變化(P＞0.05)。

2.4.3 降脂酮增強IR模型細胞的T-AOCT-AOC檢測結果如圖10所示，與對照組相比，模型組細胞內(nèi)及培養(yǎng)液T-AOC均明顯下降(P＜0.05)，用降脂酮預處理后細胞內(nèi)及培養(yǎng)液T-AOC明顯改善(P＜0.05)。因此，IR可產(chǎn)生細胞及外環(huán)境總抗氧化能力下降，降脂酮可改善此過程，減輕細胞氧化應激損傷。

圖9 降脂酮對IR模型細胞MDA含量、CAT活性和GSH含量的影響

圖10 降脂酮對IR模型細胞T-AOC的影響

3 討論

血漿中膽固醇主要以LDL-C形式存在，被氧化修飾后(Ox-LDL-C)沉積于血管內(nèi)壁是導致動脈粥樣硬化的主因之一[5]。肝臟作為機體代謝中心是調(diào)控TG、TC、HDL-C、LDL-C等脂類物質(zhì)代謝的關鍵器官，生物體內(nèi)LDL-C絕大部分由肝細胞通過LDL-R途徑清除[6]，而高脂條件肝組織中LDL-R的mRNA表達降低。研究發(fā)現(xiàn)許多黃酮類如小檗堿[7]、葛根素可以促進肝臟LDL-R的mRNA和蛋白表達，從而有效降低血脂，減少罹患動脈粥樣硬化風險。中藥槐角含有多種黃酮及異黃酮類成分，由此制成的中藥復合制劑-槐角顆粒在臨床上可較好地控制高脂血癥[8]。降脂酮是槐角經(jīng)乙醇提取后用大孔吸附樹脂法分離得到的總黃酮有效部位制劑，槐角總黃酮含量達60%以上[9]，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)其有較好降低脂肪和類脂效果，但在體外及IR中的效果尚無研究。

本實驗結果表明，降脂酮對細胞生存率的影響呈時間-效應和劑量-效應關系。綜合考慮MTT結果選取小劑量短時間預處理后，檢測基礎葡萄糖消耗發(fā)現(xiàn)，各劑量降脂酮組的攝糖能力較模型組明顯改善，說明降脂酮可改善細胞糖代謝，減輕IR。脂代謝指標結果顯示，模型組與對照組相比，培養(yǎng)液及細胞內(nèi)TG水平明顯增高，降脂酮處理后TG水平均明顯下降，細胞中TG水平下降程度有統(tǒng)計學差異。在TC水平上，培養(yǎng)液中各組無差異，在細胞中，各劑量降脂酮組明顯降低了PA導致的TC水平升高。另外模型組細胞中，促進膽固醇酯逆向轉運的HDL-C水平明顯下降，而動脈粥樣硬化相關指標LDL-C水平則明顯增高。各劑量降脂酮組則能明顯改善以上兩項指標，并可使之達到對照組水平。說明降脂酮改善TG、TC、HDLC、LDL-C作用均較強，其中，中劑量組和高劑量組的效果尤為明顯。因此降脂酮可改善IR模型BRL-3A細胞的糖脂代謝，減輕IR。

ROS在IR的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用，槐角中富含黃酮類物質(zhì)在結構上多具有酚羥基和羥基，具有較強的抗氧化活性。實驗表明，高脂產(chǎn)生的IR會使細胞ROS水平升高，而各劑量降脂酮組較模型組降低，說明降脂酮有減輕氧化應激損傷作用。MDA含量反映了脂質(zhì)過氧化程度，降脂酮可降低PA導致的BRL-3A細胞內(nèi)MDA水平增高，降低了脂質(zhì)過氧化，進一步驗證了降脂酮可降低細胞的氧化應激損傷程度。CAT、T-AOC反映了細胞的抗氧化能力，間接反應肝細胞損傷程度。IR模型組細胞中二者均明顯降低，用降脂酮后二者能力均明顯增強，尤以中高劑量組效果最為明顯。GSH在模型組及降脂酮組中均無明顯變化?？傊抵ㄟ^調(diào)節(jié)細胞氧化應激程度途徑改變糖脂水平，從而改善IR，且此途徑很可能是通過酶促體系完成的。.

近年來由于科學研究發(fā)現(xiàn)脂肪在脂代謝、脂肪因子及激素方面的特殊作用，傾向于將其歸類于內(nèi)分泌器官[1，10-14]。其在IR的發(fā)生發(fā)展中居于核心地位，而氧化應激又是其中的關鍵一環(huán)。選擇一種能有效調(diào)節(jié)氧化應激，改善糖脂代謝，同時又能對肝臟這一關鍵器官具有靶向作用的藥物，對于T2DM藥物的研發(fā)十分重要。中成藥在治療IR及相關疾病方面取得了較大進展。多種中草藥及復合制劑均被證明在調(diào)節(jié)血糖、血脂、減輕IR、調(diào)節(jié)氧化應激方面有較好療效。本實驗結果顯示，降脂酮能有效降低細胞ROS水平，減輕脂質(zhì)過氧化程度，提高細胞抗氧化能力，從而減輕氧化應激損傷，恢復氧化與抗氧化平衡。并能夠降低肝細胞脂類(TG、TC、LDL-C)水平，提高膽固醇酯逆向轉運能力及葡萄糖攝取能力，從而減輕肝細胞炎性損傷和IR程度，保持肝細胞的結構和功能。

因此，降脂酮同時具有保肝、降糖、降脂、抗氧化、減輕IR等多重效應，其作用機制可能是：抑制ROS生成、脂質(zhì)過氧化和提高抗氧化能力，調(diào)節(jié)脂代謝，減輕游離脂肪酸毒性作用，從而恢復細胞糖代謝，改善IR。降脂酮的作用機制及其能否作為治療T2DM的候選藥物還需要進一步研究。