樊瓊玲，王家威，俞金秀，馬正文，張石蕾，蔣 紅，由淑萍，

(1．新疆醫(yī)科大學護理學院，新疆 烏魯木齊830011；2．新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，新疆烏魯木齊 830011)

截至2018年，我國高血壓患病人數(shù)高達2.45億[1]。左室肥厚作為高血壓靶器官損害之一，使心肌細胞從成熟的“收縮狀態(tài)”向“胚胎型合成狀態(tài)”轉(zhuǎn)化，是冠心病、心力衰竭、腦卒中等心血管疾病的獨立危險因素[2]。因此，減緩和逆轉(zhuǎn)左室肥厚迫在眉睫。課題組前期對哈薩克族高血壓患者外周血樣本研究發(fā)現(xiàn)[3]，差異甲基化基因參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、離子代謝和細胞分化等多個生物學過程，其中內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶(endothel in converting enzyme，ECE)基因甲基化參與了代謝相關(guān)通路。內(nèi)皮素1(endothelin 1，ET-1)作為最強的活性多肽可直接參與心肌肥厚的形成及病理過程。ECE-1是ET-1生成的主要限速酶，是調(diào)控ET-1水平的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，ECE-1位于染色體1p36.1，在啟動子區(qū)域有1個CpG島，ECE-1c基因甲基化會降低其轉(zhuǎn)錄活性，而導致ET-1生成減少；同樣，ECE-1基因去甲基化會增加其轉(zhuǎn)錄活性，使體內(nèi)ET-1生成增多，血壓升高而促進心肌肥厚。因此，ECE-1基因去甲基化可能是高血壓心肌肥厚的一個新靶點，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB)信號通路是重要的生存信號通路。研究表明[6]，PI3K/PKB信號通路及通路中的眾多受體和激酶與心血管疾病有著密切的聯(lián)系，并在其病理過程中發(fā)揮著重要的作用。因此，本實驗通過腹主動脈縮窄術(shù)(abdominal aortic constriction，AAC)建立大鼠壓力超負荷左室肥厚模型，探討ECE-1基因去甲基化在高血壓左室肥厚大鼠中的作用，及對PI3K/PKB信號通路的影響，為高血壓左室肥厚尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SYXK(新)2016-0003，合格證號SCXK(新)2016-0002。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24℃，相對濕度45%～55%，每天按12 h/12 h明/暗交替。本動物實驗由新疆醫(yī)科大學第一臨床附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(20180223-183)。

1.2 實驗試劑

ANP、ECE-1引物及探針及ECE-1甲基化引物，由上海生工生物工程公司合成；β-actin引物，購于北京博奧森生物科技有限公司；DNA提取試劑盒、DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒，購于北京天根生化科技有限公司；2×Tap PCR Master Mix，購于美國Biomiga公司。兔抗PI3K、PKB、p-PI3K、p-PKB和β-actin抗體、ET-1 ELISA試劑盒，購于北京博奧森生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，購于北京索萊寶生物有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購于美國Thermo Scientific公司；熒光定量試劑盒，購于大連TaKaRa公司。

1.3 實驗儀器

-80℃醫(yī)用低溫保存箱，產(chǎn)自青島海爾特種電器有限公司；HD11 XE超聲診斷儀，產(chǎn)自德國飛利浦有限公司；液氮罐，產(chǎn)自四川樂山市東亞機電工貿(mào)有限公司；移液器、QuantStudio實時熒光定量PCR儀、全波長自動酶聯(lián)免疫反應檢驗測試儀，產(chǎn)自美國Thermo Scientific公司；Western blot使用的電源、電泳裝置及轉(zhuǎn)膜裝置，產(chǎn)自美國Bio-Rad公司；FluorChem E化學發(fā)光高靈敏凝膠成像儀，產(chǎn)自美國Protein Simple公司；基因擴增儀，產(chǎn)自美國Bio-Rad公司。

1.4 動物分組與心肌肥厚模型的制備

大鼠左心室肥厚模型制備參照文獻[7]。健康SPF級SD大鼠30只，采用隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、假手術(shù)組，每組10只。大鼠禁食12 h后，按0.002 mL/g給予2.5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，備皮，無菌環(huán)境下腹正中剖開腹腔2～2.5 cm，將腹內(nèi)臟器推向右側(cè)，于右腎動脈上方0.5 cm處剝離并充分暴露腹主動脈，將8號針頭平行腹主動脈用2號線一并結(jié)扎后，抽出針頭，造成腹主動脈狹窄，隨后腹腔滴注20萬U青霉素預防感染，關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組大鼠剖腹后，分離腹主動脈，不予結(jié)扎；對照組不進行手術(shù)。

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)測量大鼠行腹主動脈縮窄術(shù)6周后，進行超聲心動檢查，后經(jīng)腹主動脈采血處死。處死后立即打開胸腔，取出心臟，去除主動脈和左右心耳，4℃生理鹽水沖洗心腔3次，用干凈濾紙吸干水分后稱取體質(zhì)量(body weight，BW)和心臟質(zhì)量(heart weight，HW)，按下式計算心臟質(zhì)量指數(shù)(heart weight index，HWI)：

HWI=HW/BW

1.5.2 大鼠超聲心動檢查腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，左側(cè)上腹部及胸部備皮后仰臥并固定大鼠四肢。以頻率60 Hz小動物超聲探頭于胸骨左側(cè)檢測，顯示左室短軸切面。選擇清晰的圖像進行分析。檢測指標包括左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVED)、左室舒張末后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWT)、射血分數(shù)(ejection fractions，EF)、左室短軸收縮率(fractional shortening，F(xiàn)S)。以上指標均取3個測量值后取平均值。

1.5.3 心肌病理學檢查剪取心尖部位部分心肌，以4%多聚甲醛固定后石蠟包埋組織，切片厚度4μm，置于60℃烤箱2 h烘干，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片后光學顯微鏡下觀察并拍照。用Image J圖像分析軟件測量單個細胞表面積，每組隨機取4張切片，每張切片隨機取3個視野，每個視野檢測10～15個細胞，取其平均值為單個細胞表面積(the area of myocardial cells，AMC)。

1.5.4 甲基化特異性PCR檢測ECE-1基因的甲基化狀態(tài) 采用DNA提取試劑盒提取大鼠左室心肌組織中全基因組DNA，按說明書進行。分光光度計檢測DNA濃度，要求吸光度值=D(260)/D(280)在1.8～1.9之間，DNA量不少于200 ng，體積不高于20μL，以符合甲基化修飾要求。使用DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒對各樣本基因組DNA進行亞硫酸鹽修飾及純化，按說明書操作。甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)反應體系為25μL，其中含亞硫酸鹽修飾后DNA模板 3 μL，10×Buffer 2.5 μL，22.5 mmol/L 的dNTPs 2.5μL，10 μmol/L的基因引物各1μL，HotStar Taq DNA聚合酶0.1μL，用雙蒸水調(diào)整體系，使得終體積為25μL。循環(huán)反應共45個循環(huán)；72℃延伸5 min；ECE-1基因甲基化引物經(jīng)Methprimer網(wǎng)站在線設計，由上海生工合成，引物序列見表1。反應結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)攝像并分析甲基化條帶及非甲基化條帶的光密度值。以經(jīng)SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理的DNA為甲基化的陽性對照，以正常對照組DNA為未甲基化的陽性對照。按下式計算待測基因的去甲基化率：

去甲基化率=D(302)非甲基化/[D(302)甲基化+D(302)非甲基化]×100%

表1 MSP檢測引物序列

1.5.5 血漿ET-1水平檢測抽取大鼠腹主動脈血，置于抗凝管內(nèi)，常溫放置2 h后，3 000 r/min離心，用移液器吸取上層清液，-80℃保存待測。據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒說明書檢測大鼠血漿ET-1水平。

1.5.6 熒光定量PCR檢測心肌肥厚因子心房利鈉肽和ECE-1mRNA表達取50 mg心肌樣品，以Trizol法提取左室心肌組織總RNA，純化后紫外分光光度計檢測純度，吸光度值D(260)/D(280)＞1.8。定量后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取產(chǎn)物2μL在實時熒光定量PCR儀中進行擴增。總反應體系為20μL，擴增條件：95℃、30 s；95℃、3 s，60℃、30 s，40個循環(huán)；95℃、15 s，60℃、60 s。結(jié)束后設基線值、閾值，取循環(huán)閾值(CT)，目的基因相對表達量以采用法分析。目的基因心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、ECE-1和內(nèi)參β-actin引物序列見表2。

表2 熒光定量PCR檢測引物序列

1.5.7 Westernblot檢測心肌p-PI3K、PI3K、p-PKB、PKB蛋白表達在50 mg大鼠左室心肌樣品中加入3次液氮冷凍后，加入RIPA裂解液研磨提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取蛋白樣品40μg，100℃下熱變性5 min，上樣于聚丙烯酰胺凝膠進行還原性SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)(PVDF膜)，200 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min。封閉液(5%脫脂奶粉)封閉 PVDF膜過夜，用1×TBST緩沖液充分振蕩清洗3次，每次10 min，TBST稀釋抗體，一抗?jié)舛葹椋簆-PI3K，PI3K，p-PKB，PKB均按1∶1 000稀釋；ECE-1，1∶200稀釋；β-actin，1∶5 000稀釋。ECL顯色，F(xiàn)luorChem E化學發(fā)光高靈敏凝膠成像儀上檢測條帶灰度值，按下式計算蛋白相對表達水平：

蛋白相對表達水平/%=目的條帶灰度/β-actin條帶灰度×100%

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0版軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料以xˉ±s表示，多組間均數(shù)比較采用ONE-WAY ANOVA，多組間兩兩比較采用LSD法，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的HWI的比較

各組大鼠HWI結(jié)果見表3。三組大鼠的BW沒有明顯差異；與空白組比，假手術(shù)組的HW、HWI沒有明顯差異。與假手術(shù)組相比，模型組HW、HWI顯著增加，其中HWI增加31.5%，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。表明模型組大鼠出現(xiàn)心肌肥厚。

表3 各組大鼠HWI的比較

2.2 各組大鼠超聲心動圖檢測指標的變化

各組大鼠超聲心動圖檢測結(jié)果見表4。與對照組比較，假手術(shù)組大鼠的LVPWT、LVED、EF和FS無明顯統(tǒng)計學差異；與假手術(shù)組比較，模型組LVPWT明顯上升，LVED、EF和FS明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。提示模型組大鼠壓力負荷型心肌肥厚模型成功建立，出現(xiàn)心功能下降表現(xiàn)。

表4 各組大鼠超聲心動圖檢測結(jié)果

2.3 各組大鼠心肌組織病理學的變化

各組大鼠心肌組織病理學檢測結(jié)果見圖1。蘇木素-伊紅染色顯示，對照組與假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列整齊，單位視野內(nèi)細胞數(shù)量和細胞間距正常，未見明顯炎性浸潤。與假手術(shù)組比較，模型組的心肌細胞排列紊亂，組織中可見炎性細胞浸潤間質(zhì)增大，單位視野內(nèi)細胞核的數(shù)量減少，細胞間距變小，AMC明顯增大(P＜0.01)。提示腹主動脈縮窄術(shù)后6周大鼠心肌肥厚形成。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學變化

2.4 各組大鼠心肌組織中ECE-1基因去甲基化水平的改變

各組大鼠心肌組織ECE-1基因去甲基化水平檢測結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，與對照組、假手術(shù)組相比，模型組去甲基化水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。提示心肌肥厚的發(fā)生與ECE-1基因去甲基化水平升高有關(guān)。

2.5 各組大鼠血漿ET-1水平改變

各組大鼠血漿ET-1水平檢測結(jié)果見表5。與對照組比，假手術(shù)組血漿ET-1水平?jīng)]有明顯差異；與假手術(shù)相比，模型組血漿ET-1濃度顯著升高(P＜0.01)。

表5 各組血漿ET-1水平

圖2 各組大鼠心肌組織ECE-1基因甲基化水平

2.6 各組大鼠心肌組織中心肌肥厚因子ANP和ECE-1 mRNA表達的改變

各組大鼠心肌組織中心肌肥厚因子ANP和ECE-1 mRNA表達檢測結(jié)果見圖3。與對照組比較，假手術(shù)組大鼠心肌組織的ANP和ECE-1 mRNA表達水平無明顯統(tǒng)計學差異；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織的心肌肥厚因子ANP和ECE-1的mRNA表達明顯上調(diào)(P＜0.01)。

圖3 各組大鼠ANP、ECE-1 mRNA的相對表達水平

2.7 各組大鼠心肌組織中的PI3K/PKB通路相關(guān)基因的蛋白表達的變化

各組大鼠心肌組織中PI3K/PKB通路相關(guān)蛋白表達檢測結(jié)果見圖4。與對照組比較，假手術(shù)組大鼠心肌組織的PI3K、PKB、p-PI3K、p-PKB蛋白表達水平無明顯統(tǒng)計學差異；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心肌組織中PI3K、PKB蛋白表達無明顯變化，磷酸化蛋白p-PI3K、p-PKB表達明顯下調(diào)(P＜0.01)。

圖4 各組大鼠p-PI3K、p-PKB蛋白表達水平

3 討論

心肌肥厚的形成與高血壓的關(guān)系密切，是最為常見的高血壓靶器官損害和最嚴重的并發(fā)癥之一[8]。近年來的研究表明，心肌肥厚的逆轉(zhuǎn)可降低心血管疾病發(fā)病率、死亡率及總死亡率，其作用優(yōu)于單純的高血壓患者血壓水平的降低及降壓治療方案的調(diào)整[9-10]。因此，對高血壓的治療不應局限于血壓的控制，更應該關(guān)注逆轉(zhuǎn)左室肥厚并防止心肌的纖維化，使心肌恢復正常結(jié)構(gòu)和功能。

DNA甲基化是指在DNA序列里特定的堿基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，通過共價鍵結(jié)合獲得一個甲基的觀遺傳學DNA甲基化修飾過程[11]。ET-1是迄今所知最強的縮血管物質(zhì)，可強烈收縮入球動脈和出球動脈，導致尿液和排鈉減少，血壓升高。而ECE-1作為內(nèi)皮素生成過程中最后一步反應的關(guān)鍵酶，限制著ET-1的合成。同時，ET-1和ECE-1在心血管疾病中共存，ECE-1可調(diào)節(jié)ET-1的生成對疾病發(fā)生發(fā)展十分重要[12]。在體外血管內(nèi)皮細胞實驗中[4-5]，ECE-1c基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化會降低其轉(zhuǎn)錄活性，導致ECE-1c表達下降，從而進一步導致體內(nèi)ET-1生成減少，血壓降低，提示ECE-1甲基化可能參與了高血壓的病理過程。在本研究中，我們運用MSP法檢測了ECE-1基因甲基化狀態(tài)在正常大鼠心肌組織和AAC術(shù)后的壓力超負荷的肥厚心肌組織中的差異。實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織的ECE-1基因去甲基化水平相較于假手術(shù)組和對照組明顯升高。因此，ECE-1基因去甲基化也可能參與了心肌肥厚的發(fā)生。

研究表明[13]，ET-1可通過內(nèi)皮素受體B1調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性及一氧化氮(nitric oxide，NO)的釋放。NO作為一種重要的舒張血管物質(zhì)，可以從多個水平拮抗ET-1的縮血管作用，維持心血管的正常功能[14]。PI3K/PKB是NO的重要的上游信號通路，直接影響著NO的生成與釋放。PI3K/PKB信號通路及通路中的眾多受體和激酶與高血壓、心力衰竭等心血管疾病有著密切的聯(lián)系[15-16]。PKB是此通路的信號核心，其活化可通過磷酸化激活或抑制下游效應分子，從而調(diào)節(jié)分子功能[17]。PKB在早期心衰病人中的短暫活化，對心肌細胞是有利的，其可通過抑制細胞凋亡，增強血管生成，促進心肌能量代謝和抑制炎癥反應等反應完成，但是PKB的持續(xù)性激活，將會導致心臟功能嚴重下降[18]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在腹主動脈縮窄術(shù)后6周的大鼠發(fā)生了壓力超負荷心肌肥厚，Western blot顯示，相較于假手術(shù)組，模型組大鼠心肌組織中PPI3K、P-PKB蛋白表達顯著降低。因此，ECE-1基因去甲基化可能與PI3K/PKB信號通路中PI3K、PKB蛋白磷酸化水平被抑制有關(guān)，從而導致了高血壓心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。

腹主動脈縮窄術(shù)可通過增加外周循環(huán)阻力使心臟后負荷增加，與原發(fā)性高血壓的形成過程類似，是研究壓力超負荷心肌肥厚及心衰的病理生理、分子生物學機制和心血管系統(tǒng)藥理學的理想動物模型。本實驗以超聲心動檢查、病理組織學檢測以及心肌肥厚因子ANP mRNA表達水平評價心肌肥厚模型。實驗發(fā)現(xiàn)，造模6周后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的BW和HW顯著下降，HWI顯著上升(P＜0.01)。超聲心動圖作為篩查及診斷心肌病的首選影像學方法，可以為心功能的評價提供全面客觀的依據(jù)[19]。實驗顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的LVPWT呈明顯上升，LVED、EF和FS呈明顯下降，心功能明顯變差(P＜0.01)。從心肌病理學檢查發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心肌細胞排列紊亂，組織中可見炎性細胞浸潤間質(zhì)增大，單位視野細胞核的數(shù)量減少，AMC明顯增加(P＜0.01)；以上都明確提示了模型組大鼠發(fā)生了心肌肥厚。此外，ANP是心肌肥厚的標志性基因，在實時熒光定量PCR檢測中發(fā)現(xiàn)模型組組ANP mRNA相對表達水平明顯升高(P＜0.01)。以上4個方面，從超聲、病理到分子水平證實了AAC后大鼠壓力超負荷心肌肥厚模型的成功建立，從而進一步佐證ECE-1基因在心肌肥厚中的作用。

綜上所述，在本實驗中，我們對高血壓左室肥厚與ECE-1基因甲基化水平、PI3K/PKB信號通路的關(guān)系進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)ECE-1去甲基化參與了壓力超負荷心肌肥厚的形成過程，且與心肌肥厚正相關(guān)，該過程可能與PI3K/PKB信號通路的抑制有關(guān)。