楊 武，王 威，向世海，夏志蘭，羅 坤，**

（1.湖南農業(yè)大學 植物保護學院，湖南 長沙410128；2.湖南農業(yè)大學 食用菌研究所，湖南 長沙410128）

木霉（Trichoderma） 又叫綠霉，是食用菌生產中普遍發(fā)生的一個競爭性雜菌，具有適應性強、繁殖速度快、為害期長的特性，可侵染靈芝(Ganoderma lucidum）、杏鮑菇（Pleurotu eryngii）、香菇（Lentinus edodes）、木耳（Auriculariaspp.） 等多種食用菌的栽培料、菌種和子實體，可造成減產甚至絕收，嚴重影響商業(yè)化生產[1-4]。目前，競爭性病害常見的處理措施有蒸汽滅菌、熱水浸泡、接種室熏蒸消毒、及時清理廢料和化學防治[5-6]。物理措施并不能避免病害的發(fā)生，因此主要采取的措施還是化學防治。然而，盡管化學防治在病害防治中占主導地位，但是一些殺菌劑如多菌靈，木霉已產生了較強的抗性，并且化學藥劑的不合理使用會導致農藥殘留問題，影響食用菌品質，引發(fā)一系列安全問題[7-9]。因此，尋找一種新的安全高效的食用菌病害防治措施迫在眉睫[10]。生物防治具有對人畜無害、對環(huán)境友好和對病原菌特異性強等優(yōu)點[11]，已成為近年來國內外的研究熱點。筆者在調查湖南省木耳病害時，發(fā)現(xiàn)綠霉病發(fā)生嚴重的地塊污染率達30%，有的地塊甚至絕收。從湖南省麻陽縣中采集回來的30 個發(fā)病面積較小的綠霉病害樣品中，分離篩選了一株對木霉有較強抑制作用的菌株，經鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），并進行了抗菌譜試驗，旨在發(fā)掘其抗菌廣譜特性，為食用菌病害的防治提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

30 個木霉病害樣品由湖南省麻陽縣提供，其發(fā)病面積較小，供試病原真菌長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum） 為湖南農業(yè)大學食用菌研究所前期研究分離。食用菌（杏鮑菇、靈芝、大球蓋菇、雙胞蘑菇、姬松茸、秀珍菇及黑木耳） 菌種均由湖南農業(yè)大學食用菌研究所提供。用于抗菌譜試驗的4 種食用菌病害真菌，蘑菇鐮胞霉病菌（Fusarium equiseti）、平菇毛霉病菌（Lichtheimia corymbifera）、黑木耳青霉病菌（Penicillium paneum） 和黑木耳鏈孢霉病菌（Neurospora crassa） 為本課題組分離并保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基及試劑盒

供試細菌與真菌的培養(yǎng)分別采用LB 培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDA） 培養(yǎng)基。生化鑒定所用試劑為細菌微量生化鑒定管，均由北京陸橋技術股份有限公司提供。Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒和SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒均由生工生物工程（上海） 股份有限公司提供。

1.2 細菌的分離、純化和保存

細菌的分離采用稀釋分離[12]的方法，從菌袋的病鍵交界處取木屑5 g，將其與45 mL 無菌水混合，后置于振蕩培養(yǎng)箱中充分振蕩，10 min 后取出，即得到濃度為10-1的菌懸液。靜置3 min，用移液槍吸取1 mL 上清液，加入到盛有9 mL 無菌水的試管中，充分搖勻，制成濃度為10-2的菌懸液，重復上述操作，分別制成濃度為10-3、10-4和10-5的菌懸液。在超凈工作臺下，用移液槍分別吸取10-5～10-2四個濃度的菌懸液各800 μL 于LB 固體培養(yǎng)基，用涂布棒涂布均勻，每個濃度設3 個重復，并設等量無菌水為對照（CK），30℃恒溫培養(yǎng)1 d~2 d。將上述菌株分別進行純化，后轉入斜面培養(yǎng)基于4℃保存。

1.3 細菌對食用菌綠霉病病菌拮抗作用的測定

1.3.1 初篩

采用平板對峙法[13]，用打孔器取一新鮮的木霉菌餅（8 mm） 倒置于PDA 培養(yǎng)基中央，用接種環(huán)挑取純化后的細菌于中央右側1/2 處，并劃一道豎直長線（接近培養(yǎng)皿邊緣），每個細菌設3 個重復。將平板置于30℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3 d~4 d，觀察記錄木霉的生長情況，選出對木霉生長有較強抑制作用的菌株進入復篩。

1.3.2 復篩

采用管碟法[13]，將初篩過的具有拮抗作用的細菌，接種于LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h 后備用。將木霉菌株培養(yǎng)3 d 后，用無菌水洗下培養(yǎng)基表面的孢子，4 層紗布過濾后，制成孢子懸浮液。無菌操作下用移液槍吸取800 μL 木霉懸浮液于PDA 培養(yǎng)基中均勻涂布，靜置10 min 后，取牛津杯（內徑6 mm，外徑8 mm） 于平板中央，取培養(yǎng)24 h 后的拮抗菌發(fā)酵液200 μL，用0.22 μL 的細菌過濾器過濾后，將濾液緩慢注入牛津杯中央，并設等量無菌水為對照，每個菌種設3 個重復，30℃培養(yǎng)3 d~4 d 后用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.4 拮抗菌分類鑒定

1.4.1 拮抗菌的形態(tài)特征和生理生化性狀

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]和《伯杰細菌鑒定手冊》[15]對效果最好的拮抗菌的形態(tài)特征與生理生化性狀進行分析鑒定。

1.4.2 拮抗菌的分子生物學鑒定

1） 拮抗菌me-1 基因組DNA 的提取

采用上海生工生物工程有限公司Ezup 柱氏細菌基因組抽提試劑盒提取拮抗菌基因組DNA。

2） 拮抗菌me-1 的16S rDNA 的PCR 擴增回收與測序

以27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’為正向引物，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’為反向引物，菌株DNA 為模板，采用20 μL 反應體系進行DNA 的擴增，流程為94℃預變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保溫。采用1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA、20 min 對PCR 擴增產物進行電泳觀察。采用SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒對純化后的產物進行回收，并將其送至上海生工進行測序。

3） 測序與系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序結果通過BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/） 進行分析，將BLAST 結果中相似菌株選取出來，用Mega 7 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 拮抗菌對不同食用菌的抑制作用

將拮抗效果最好的細菌（me-1） 分別與杏鮑菇、靈芝、雙孢蘑菇、大球蓋菇、姬松茸、黑木耳共6種食用菌進行平板對峙培養(yǎng)（操作方法同1.3.1），2 d、5 d、10 d 分別觀察菌株me-1 對不同食用菌的抑制作用。

1.6 抗菌譜試驗

以me-1 為指示菌，采用1.3.1 中的方法對4 種供試食用菌病原真菌進行初篩，采用菌絲生長速率法[14]對初篩后的真菌進行抑菌效果的測定。用0.22 μm 的細菌過濾器過濾30℃培養(yǎng)2 d 的me-1 的發(fā)酵液，取1 mL 發(fā)酵液過濾液原液于培養(yǎng)皿中，將10 mL 的PDA 培養(yǎng)基（55℃左右） 倒入皿中，充分混勻，制成平板，待冷卻后，向平板中央接種新鮮真菌菌餅（8 mm），并設等量無菌水作為對照，每個處理各設4 個重復，置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)，待對照菌落長滿整個培養(yǎng)皿的2/3 時，用十字交叉法測定菌落直徑，抑菌率（P，%） 計算公式為：

式中：X為對照菌落直徑（mm）；Y為處理菌落直徑（mm）；Z為菌餅直徑（mm）。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離與純化

從懷化市麻陽縣采集回來的30 個污染菌袋中分離得到20 種細菌菌株，經純化2 次～3 次后置于4℃冰箱保存。

2.2 細菌對食用菌綠霉病病菌拮抗作用的測定

2.2.1 初篩

通過平板對峙，從20 種細菌中篩選得到5 種對木霉具有明顯抑制作用的菌株，命名為me-1、me-2、me-3、me-4、me-5。由于拮抗細菌的抑制，木霉在培養(yǎng)基上無法全部伸展，靠近拮抗菌這一側菌絲和孢子受到抑制，見圖1a。

2.2.2 復篩

在管碟法試驗中，由于拮抗菌株代謝物的拮抗作用，me-1、me-2、me-3、me-4、me-5 抑制了牛津杯周圍木霉的生長，其中菌株me-1 的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到24.7 mm，見圖1b，在1%和5%的顯著水平上高于其他幾種細菌，見表1。

由圖1 可知，無論是平板劃線的菌體還是無菌發(fā)酵過濾液，菌株me-1 對長枝木霉有明顯的抑制作用，使得木霉無法繼續(xù)擴展。

表1 不同拮抗菌對木霉的抑菌圈的大小Tab.1 The size of inhibition zone of different antagonistic bacteria against Trichoderma longibrachiatum

由表1 可知，不同的菌株對木霉的抑菌圈直徑不同，表現(xiàn)出不同的抗性，其中，菌株me-1 對木霉的抑菌圈直徑最大，為24.7 mm。

2.3 拮抗菌me-1 的分類鑒定

2.3.1 形態(tài)特征和生理生化性狀

拮抗菌me-1 的形態(tài)特征見圖2。

由圖2 可知，菌株me-1 的形態(tài)特征為，菌落表面粗糙不透明，具有很多皺褶，白色或者微黃色。光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌體呈桿狀，革蘭氏陽性。電子顯微鏡下觀察，菌體大小為（0.7～0.8） μm×（2.0～2.5） μm，菌體兩個相接或分散，周生鞭毛。菌株me-1 的生理生化性狀見表2。

表2 菌株me-1 的生化試驗結果Tab.2 Biochemical test results of strain me-1

由表2 可知，經相關試驗測定，菌株me-1 與枯草芽孢桿菌生化的試驗結果完全一致。

2.3.2 菌株的分子生物學鑒定

經測定，菌株me-1 的分子生物學鑒定結果見圖3、圖4。

由圖3 可知，16S rDNA 序列的全長為1 310 bp。

由圖4 可知，BLAST 比對發(fā)現(xiàn)me-1 與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） 相似度達到100%。用Mega 7 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，me-1 與Bacillus subtilis菌株HN-4 聚為一枝。同時結合形態(tài)特征與生理生化性狀分析，將me-1 鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.4 拮抗菌對不同食用菌的抑制作用

木霉拮抗菌me-1 對不同食用菌抑制作用結果見表3。

由表3 可知，拮抗菌對姬松茸（Agaricus blazei）、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、大球蓋菇（Stropharia rogosoannulata） 有抑制作用，而對黑木耳（Auricularia auricula）、靈芝、杏鮑菇，10 d 內都沒有產生抑制作用，說明菌株me-1 不會抑制其菌絲的生長，但能抑制其病原菌木霉的擴展。

表3 菌株me-1 對不同食用菌的抑制作用Tab.3 Inhibition of me-1 strain to different edible fungi

2.5 抗菌譜試驗

采用對峙培養(yǎng)法和生長速率法測定拮抗菌me-1對其他4 種常見食用菌病原菌的作用，結果見表4。

表4 me-1 對其他食用菌病原真菌的抑菌效果Tab.4 Antifungal effect of me-1 on other fungal pathogens of edible fungi

由表4 可知，拮抗菌me-1 發(fā)酵液除對黑木耳鏈孢霉病菌（Neurospora crassa） 無抑制作用外，對其他3 種供試真菌均有效果，抑菌率為64.2%～92.9%。其中，對黑木耳青霉病菌（Penicillium paneum） 的抑菌率達到了92.9%，在1%和5%顯著水平上明顯高于其他病菌。

3 討論

從湖南省麻陽縣采集的發(fā)病面積較小的綠霉病害樣品中，分離篩選得到1 株對食用菌綠霉病菌有較強拮抗作用的菌株me-1，管碟法測得其對長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum） 的抑菌圈達到24.7 mm，經過培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征、生理生化性狀和16S rDNA 測定，將其鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。抑制作用測定試驗結果表明，該菌株不會抑制黑木耳、杏鮑菇和靈芝菌絲的生長，有較好的開發(fā)潛力。

目前，關于食用菌綠霉病生物防治的報道較少，張旭等[8]通過平板對峙和杯碟法篩選出了1 株地衣芽孢桿菌，其發(fā)酵液上清液對木霉抑菌圈為（19.02±1.65） mm，并確定其最適生長條件為溫度37℃、pH 7.0、接種量為1%。陳發(fā)川等[17]通過稀釋涂布平板法從蘆薈和香蕉皮等植物和土壤中分離出了木霉拮抗菌，經鑒定為枯草芽孢桿菌。馬林等[18]從土壤中分離得到對食用菌綠霉病有明顯拮抗作用的菌株，該菌株MS82（熒光假單孢菌） 對雙孢蘑菇的菌絲沒有影響。國內外學者對木霉的研究一般是將其作為一種生防菌株，因其可以抗多種植物病害并且對環(huán)境友好，在植物病害的生物防治中起到越來越重要的作用[19-21]。長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum） 是食用菌污染料中常見的木霉種[22]，本研究從食用菌綠霉病害菌袋中分離得到5 株木霉拮抗菌，其中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） me-1 抑制效果最好，抑菌圈達24.7 mm，為進一步開發(fā)安全、高效的食用菌綠霉病害的生防制劑提供了菌種資源。

枯草芽孢桿菌是一種優(yōu)良的生防菌株，可以產生70 多種抗菌物質，如肽類、氨基酸類和核酸類等多種化合物，其防病主要機制為營養(yǎng)競爭、誘導抗性、抗生作用和促生作用，并且具有繁殖快、營養(yǎng)簡單、儲藏時間長等特性[23]，已受到國內外學者的關注和研究。目前，我國利用枯草芽孢桿菌防治病害的研究已處于世界先進水平，成功開發(fā)投入生產的商品制劑有亞寶、百抗和紋曲靈等[24]。但目前關于枯草芽孢桿菌抗食用菌綠霉病的報道很少，本研究不僅分離出了對長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum） 拮抗作用較好的枯草芽孢桿菌，而且經抗菌譜試驗，表明枯草芽孢桿菌me-1 除對黑木耳鏈孢霉病菌無抑制作用外，對3 種其他常見食用菌病原真菌均有抑制作用，其對黑木耳青霉病菌的抑制率達92.9%，在1%和5%水平上顯著高于其他2 種病原菌，有較好的應用前景，為對食用菌病害具廣譜抗性的生防制劑的開發(fā)和利用提供了理論依據。