陳立，謝波，葉文鑫，張心男

（浙江省立同德醫(yī)院 泌尿外科，浙江 杭州 310012）

前列腺癌（prostate cancer, PC）在男性惡性腫瘤發(fā)病率中居第2 位，并呈逐年遞增的趨勢[1]。PC 發(fā)病隱匿，確診時往往發(fā)展至晚期，存在腫瘤浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，失去根治性手術(shù)治療的機會，因此PC 早期診斷及治療水平的提高迫在眉睫[2]。Homeobox 基因家族在胚胎與器官發(fā)育、腫瘤的形成發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能[3]。HMBOX1（Homeobox containing 1）是2006年在人胰腺cDNA 文庫中新發(fā)現(xiàn)的基因，屬于Homeobox 家族中的肝細(xì)胞核因子基因簇（HNF class），廣泛表達(dá)于人體各器官組織中。作為一種新型的轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)控胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。本研究旨在探究HMBOX1 在PC 中的表達(dá)變化及其對前列腺癌上皮間質(zhì)化的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月—2017年10月在浙江省立同德醫(yī)院泌尿外科確診為PC 并接受根治性前列腺切除術(shù)的68 例作為研究對象（PC 組）。其中，年齡32 ～74 歲，平均（60.50±8.03）歲；腫瘤直徑＜2.5 cm 31 例，≥2.5cm 37 例；Gleason 評分2 ～4 分24 例，5 ～7分30 例，8 ～10 分14 例；TNM 臨 床 分 期Ⅰ、Ⅱ期30 例，Ⅲ、Ⅳ期38 例；前列腺特異抗原（prostate specific antigen, PSA）水平＜10ng/ml 33 例，≥10ng/ml 35 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32 例。選取同期本院就診的良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia， BPH）患者70 例作為對照組（BPH 組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢測首次確診為PC 患者并行根治性前列腺切除術(shù)；②所有患者術(shù)前未接受手術(shù)、放化療等抗癌治療；③臨床及隨訪資料完整；④無糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、嚴(yán)重自身免疫性疾病或其他惡性腫瘤；兩組患者的年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且所有患者自愿簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)胞系PC-3 購自上?？婆d生化試劑，pMD2.0 G 和pAXAS2 質(zhì)粒購自山東維真生物科技有限公司，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和HMBOX1 兔多克隆抗體均購自英國Abcam 公司，DAB顯色液和蘇木精染色液購自北京中杉金橋生物科技有限公司，HRP 標(biāo)記二抗、PEG8000、嘌呤霉素均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Transwell 小室、Matrigel 基質(zhì)膠購自美國Corning 公司，普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡均購自日本Olympus 公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測HMBOX1 的表達(dá)

組織標(biāo)本常規(guī)脫水、透明、包埋、切片處理后，依次于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中處理4min。自來水沖洗，檸檬酸鹽緩沖液中煮沸10min，蒸餾水沖洗2 次，5min/次。3%過氧化氫溶液孵育10min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 次，每次5min。1%牛血清清蛋白室溫封閉1h。1 ∶300 稀釋Anti-HMBOX1 兔多克隆抗體，4℃孵育過夜。PBS 洗滌2 次，每次5min。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，PBS 洗滌2 次，每次5min。雙花扁豆凝集素顯色液顯色10min，流動自來水沖洗5min。蘇木精復(fù)染1min，自來水沖洗5min。1%鹽酸乙醇分化3s，自來水沖洗5min。依次在70%、80%、90%、95%、100%梯度乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中處理4min，中性樹膠封片。判定標(biāo)準(zhǔn)：每張切片隨機選擇3 個高倍視野，綜合陽性細(xì)胞比例和染色強度進(jìn)行評分。陽性細(xì)胞比例：0 分為陽性細(xì)胞比例＜5%，1 分為陽性細(xì)胞比例5%～＜25%，2 分為陽性細(xì)胞比例25%～＜50%，3 分為陽性細(xì)胞比例50%～＜75%，4 分為陽性細(xì)胞比例≥75%。染色強度：0 分為不著色，1 分為淡黃色，2 分為黃色，3 分為棕黃色或褐色。陽性細(xì)胞比例與染色強度總分0 ～3 分為HMBOX1 低表達(dá)，4 ～7 為HMBOX1 高表達(dá)。

1.4 HMBOX1 過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建

分子克隆構(gòu)建plenti-GFP-HMBOX1 慢病毒表達(dá)載體，將輔助質(zhì)粒pMD2.0 G 和pAXAS2 分別與plenti-GFP-HMBOX1 或plenti-GFP 空載共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h 后更換新鮮DMEM 培養(yǎng)基，在48 和72 h 時分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，收集的病毒溶液按每4 ∶1 的比例加入PEG8000 進(jìn)行濃縮，4℃靜置12 h，8 000 r/min 離心20 min，沉淀用新鮮DMEM重懸后加入到處于對數(shù)生長期的PC-3 細(xì)胞中，感染48 h 后，嘌呤霉素（1 μg/ml）篩選1 ～3 d，顯微鏡下觀察，當(dāng)存活細(xì)胞全部表達(dá)綠色熒光時即穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。plenti-GFP 空載和plenti-GFP-HMBOX1細(xì)胞系分別為對照組和實驗組。

1.5 Western blotting 檢測HMBOX1、E-cadherin及Vimentin 的表達(dá)

PC-3 HMBOX1及對照組穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功后，分別計數(shù)2×106個細(xì)胞，12 000 r/min 離心3 min，收集細(xì)胞沉淀，加入200 μl SDS 上樣緩沖液，沸水浴煮10 min，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。1 ∶1 500 稀釋的HMBOX1 和Vimentin、1 ∶500稀釋的E-cadherin 兔多克隆抗體4℃孵育過夜。PBS洗滌3 次，8 min/次。1 ∶5 000 稀釋的羊抗兔HRP二抗室溫封閉1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.6 劃痕實驗（Wound-Healing Assay）

將處于對數(shù)生長期的PC-3 HMBOX1 過表達(dá)及對照組細(xì)胞用胰酶消化后，DMEM 完全培養(yǎng)基重懸。以60%的細(xì)胞密度鋪96 孔板，每組設(shè)置3 個平行復(fù)孔。37℃，5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱過夜。更換低濃度血清培養(yǎng)基（1% FBS），用1ml 槍頭對準(zhǔn)96 孔板下端中央部位，向上輕推形成劃痕，PBS 漂洗3 次，低濃度血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在12h 時使用細(xì)胞成像設(shè)備掃版進(jìn)行掃描讀板，采用Image J 分析劃痕的修復(fù)狀況。

1.7 Transwell 檢測HMBOX1 過表達(dá)對細(xì)胞侵襲能力的影響

分別收集PC-3 HMBOX1 過表達(dá)及對照組細(xì)胞，PBS 洗滌3 次，重懸于無血清DMEM 培養(yǎng)基中，并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個/ml。取100 μl 細(xì)胞懸液接種于Transwell 小室，下室則加入含10%血清的DMEM完全培養(yǎng)基500μl。培養(yǎng)24h 后，Transwell 小室用PBS 洗2 次，甲醇溶液固定30 min。PBS 洗2 次，0.1%結(jié)晶紫染色20min。PBS 洗2 次，然后用棉簽輕輕拭去上層未侵襲的細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5 個視野并統(tǒng)計平均穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMBOX1 在PC 組織中的表達(dá)變化

免疫組織化學(xué)檢測及統(tǒng)計結(jié)果顯示，HMBOX1 蛋白主要定位于細(xì)胞核和胞質(zhì)中。BPH 組HMBOX1 蛋白的陽性表達(dá)率為55.71%（39/70），PC 組HMBOX1蛋白的陽性表達(dá)率下降至19.12%（13/68），兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.023，P=0.000）。見圖1。

2.2 HMBOX1 過表達(dá)對Vimentin 和E-cadherin的影響

Western blotting 結(jié)果顯示，細(xì)胞中HMBOX1、E-cadherin、Vimentin 蛋白的相對表達(dá)水平，對照組分別為（0.33±0.04）、（0.41±0.06）、（2.15±0.17），實驗組分別為（1.91±0.14）、（1.70±0.15）、（0.62±0.05）。HMBOX1 在對照組細(xì)胞中的表達(dá)水平較低，而在實驗組細(xì)胞中的表達(dá)水平增加（t=13.026，P=0.000），表明HMBOX1 過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。與對照組細(xì)胞比較，實驗組E-cadherin 的表達(dá)水平增加，Vimentin 的表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.377和8.706，P=0.021 和0.006）。見圖2。

2.3 HMBOX1 過表達(dá)對PC-3 細(xì)胞遷移的影響

與對照組細(xì)胞愈合度（87.42±9.10）比較，實驗組細(xì)胞12h 后的劃痕愈合度（41.33±9.10）增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.187，P=0.007）。見圖3。

2.4 HMBOX1 過表達(dá)對PC-3 侵襲的影響

對照組和實驗組侵襲至Transwell 上室膜上的細(xì)胞數(shù)分別為（421.88±45.70）和（172.06±19.25）個，實驗組侵襲細(xì)胞數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.507，P=0.004）。見圖4。

圖1 HMBOX1 在不同組織中的表達(dá) （×200）

圖2 HMBOX1 過表達(dá)對Vimentin 和E-cadherin 的影響

圖3 HMBOX1 過表達(dá)對PC-3 細(xì)胞遷移的影響 （×200）

圖4 HMBOX1 過表達(dá)對PC-3 侵襲能力的影響 （×400）

3 討論

HMBOX1并在人類胰腺、肝臟、腦及胎盤等組織中呈高表達(dá)[5]。已有文獻(xiàn)報道，Homeobox 家族基因在細(xì)胞增殖和凋亡、血管生成、DNA 修復(fù)以及腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程中起重要作用[6-7]。目前關(guān)于HMBOX1基因的研究仍處于初始階段，主要集中在對NK 細(xì)胞的殺傷調(diào)控、參與骨髓基質(zhì)細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化及DNA 的修復(fù)等[8]。此外HMBOX1 在腫瘤中的表達(dá)異常也引起眾多學(xué)者的關(guān)注，如HMBOX1 在肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及卵巢癌中低表達(dá)，而在腎透明細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，廣泛參與腫瘤形成及進(jìn)程調(diào)控[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)HMBOX1 蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)水平較前列腺增生組織下降，表明HMBOX1 蛋白可能在前列腺癌的發(fā)生及進(jìn)展中扮演著重要的角色。

Ⅲ型細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指原本具有上皮細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞極性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，細(xì)胞形態(tài)趨長梭形，具備更強的移動能力，更易從原始部位脫離，通過血液或淋巴系統(tǒng)定植遠(yuǎn)處器官或組織，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。大量研究顯示，EMT 與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、免疫抑制以及耐藥等密切相關(guān)[12]。EMT 的發(fā)生涉及大量轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化及Wnt/β-catenin、Notch、STAT3、PI3K/Akt、Pten 等多種信號通路，并伴隨上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin、角蛋白的下調(diào)及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin）、Vimentin 的上調(diào)[13-14]。已有研究表明PC 組織中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平發(fā)生變化，并與PC 的分期、組織分級、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)等存在緊密的聯(lián)系[15]。

本結(jié)果顯示，與對照組PC 細(xì)胞比較，過表達(dá)HMBOX1 的細(xì)胞中E-cadherin 的表達(dá)水平增加，Vimentin 的表達(dá)水平則下降，劃痕創(chuàng)口愈合慢，遷移速度降低。Transwell 小室實驗也同時證明過表達(dá)HMBOX1 的細(xì)胞較對照組細(xì)胞比較，其黏附性增強，細(xì)胞穿膜數(shù)降低。這表明過表達(dá)HMBOX1 后，PC 細(xì)胞的EMT 現(xiàn)象得到抑制，腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力受到明顯的削弱。既往研究表明，HMBOX1 可能通過多種途徑參與腫瘤信號通路的調(diào)節(jié)，如HMBOX1 通過NKG2D/DAP10 信號途徑來抑制NK 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷功能[16]。本研究證明，HMBOX1 與前列腺癌EMT 相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)有密切關(guān)系。EMT 受Snail、Zeb、Twist等眾多重要轉(zhuǎn)錄因子及Wnt、Notch、STAT3、PI3K/Akt等信號通路的復(fù)雜調(diào)控[17]，本研究雖然證明，轉(zhuǎn)錄抑制因子HMBOX1 可能通過EMT 相關(guān)路徑參與PC 的作用機制，但其也可能通過其他作用靶標(biāo)發(fā)揮PC 抑制效應(yīng)，并且HMBOX1 究竟通過何種信號通路調(diào)控PC EMT 現(xiàn)象也有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，HMBOX1 在PC 組織中表達(dá)下調(diào)，HMBOX1 過表達(dá)能抑制PC 的上皮間質(zhì)化現(xiàn)象及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，有望成為PC 診斷及治療的新靶點。