葛 維1,2，曾 斌1

(1.南華大學附屬第一醫(yī)院消化科，湖南 衡陽 421001；2.漢壽縣人民醫(yī)院胃鏡室，湖南 漢壽 415900)

胃癌是全球第四大常見癌癥和癌癥相關死亡的第三大原因，估計每年有723,100例死亡[1-2]。手術切除已被確立為早期胃癌患者的有效治療方法[3]。然而，在5年內(nèi)，高達30%至40%的患者出現(xiàn)復發(fā)[4]，這表明胃癌是一種臨床異質(zhì)性疾病,固有的臨床異質(zhì)性很可能是由于癌細胞的分子特征的差異。絕大多數(shù)胃癌屬于腺癌，早期無明顯癥狀，或出現(xiàn)上腹不適、噯氣等非特異性癥狀，常與胃炎、胃潰瘍等胃慢性疾病癥狀相似，易被忽略，因此，目前我國胃癌的早期診斷率仍較低。胃癌的預后與胃癌的病理分期、部位、組織類型、生物學行為以及治療措施有關。UNC5B-AS1定位于10號染色體NC_000010.11(71217224..71218228,complement),是lncRNA家族的成員之一,Wang Y等人[5]研究報道在RNA水平敲降UNC5B-AS1，顯著抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞系(TPC1和BCPAP)的細胞增殖，集落形成，遷移和侵襲。本研究擬在組織水平研究UNC5B-AS1的表達；在細胞水平研究UNC5B-AS1對胃癌增殖和遷移的影響。擬闡明UNC5B-AS1在胃癌中的臨床價值，評價UNC5B-AS1作為胃癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移的相關標志物和潛在的治療靶點的價值，為UNC5B-AS1陽性胃癌的靶向治療提供新策略和一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌RNA測序數(shù)據(jù) 從TCGA(The Cancer Genome Atlas)和GEO(Gene expression omnibus)數(shù)據(jù)庫中下載了人胃癌數(shù)據(jù)(STAD和GSE54129)，包括人胃癌組織和癌旁組織，及志愿者的正?；顧z胃粘膜，-80 ℃冰箱長期保存。

1.1.2 胃癌組織及細胞株 在醫(yī)院收集胃癌患者組織和臨近癌旁組織28對，-80℃冰箱保存,術前未經(jīng)放、化療等治療，均經(jīng)過病理學證實為胃癌，所有樣本均獲得患者的知情同意書和相關的倫理審核同意書；本實驗選用的胃癌細胞株，參考前人研究文獻，包括IM95和MKN-45，細胞株均購自美國標準菌種庫(ATCC)。

1.1.3 主要試劑 TRIzol Reagent購于中國賽默飛公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于諾唯贊；SYBR Mixture、CCK-8、Transwell小室、6孔板及12孔板、DMEM培養(yǎng)基、胰酶細胞消化液、青霉素、鏈霉素購于全基因公司；氯仿，異丙醇，乙醇，DEPC水購于碧云天公司；DMEM和1640，胎牛血清(FBS)購于美國BI公司。

1.1.4 主要儀器 移液器、臺式高速冷凍離心機、梯度PCR擴增儀購于德國Eppendorf公司；1.5 mL、2 mL EP管、1640培養(yǎng)基購于全基因公司；XH-B渦旋混合器、顯微鏡及熒光顯微鏡、購于日本O1ympus公司；掌式離心機購于美國ABSON公司；Vii7 PCR System購于美國ABI公司；雪花制冰機購于上海領城公司；-80 ℃冰箱、CO2細胞培養(yǎng)箱購于德國西門子公司；培養(yǎng)瓶、6孔12孔96孔細胞培養(yǎng)板、1.5 mL、2 mL EP管購于美國Corning公司；微型臺式真空泵購于江蘇康建公司；雙人單面超凈工作臺購于蘇潔凈化公司；-20 ℃青島海爾冰箱；液氮罐購于美國CBS公司；Invitrogen Lipofectamine 2000購于賽默飛公司；SiRNA UNC5B-AS1、UNC5B-AS1過表達質(zhì)粒購于廣東銳博公司。

1.2 方法

1.2.1 篩選差異表達基因 從TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中下載STAD和GSE54129胃癌微陣列表達數(shù)據(jù)，在R語言軟件中，利用軟件包DE-seq篩選胃癌組織和癌旁組織中的差異表達的mRNAs和LncRNAs。

1.2.2 分析UNC5B-AS1與胃癌的臨床相關性 利用GEPIA網(wǎng)站以TCGA測序數(shù)據(jù)以及相關臨床數(shù)據(jù)為主，系統(tǒng)性分析基因與臨床病理特征的相關性，例如：總生存期(Overall survival, OS)、無復發(fā)生存期(Disease free survival，DFS)、病理分期等。

1.2.3 TRIzol法提取胃癌組織的總RNA Trizol是一種新型總RNA抽提試劑,用研磨器研磨胃癌組織，待組織破碎完全后，收集到1.5 mL無RNA酶EP管中，加入1～1.5 mL TRIzol;離心機4 ℃預冷,1.5 mL無RNA酶EP管中加入0.2 mL氯仿，混勻，劇烈震蕩30 s，室溫靜置5 min;13 000 rpm離心15 min，4 ℃離心，取上清至另一無RNA酶EP管，600 μL;取上述上清，加入等體積的異丙醇，上下倒置混勻，冰盒上靜置10 min;13 000 rpm離心15 min，4 ℃離心，吸棄上清;加入1 mL 4℃ 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4 ℃，13 000 rpm離心10 min，棄上清;吸去乙醇，瞬離，吸去乙醇。加入適量DEPC水溶解(20～40 μL);用超微量紫外分光光度計測RNA濃度和純度，-80 ℃長期保存。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板 Rnase-Free Water、4× g DNA wiper Mix 4 μL、RNA模板1 μg配置16 μL反應體系；用移液器輕輕吹打混勻，42 ℃ 2 min；短暫離心，使壁管上的溶液收集到管底，繼續(xù)向以上反應液中加入5× Hiscript Ⅱ qRT Super mix和5× NO RT control mix各4 μL，反應條件為50 ℃ 10 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存；反應結束后，Rnase-Free Water稀釋逆轉(zhuǎn)錄完成的cDNA模板，混勻，冰上冷卻，標記，-80 ℃長期保存。

1.2.5 qRT-PCR檢測胃癌及相應癌旁組織的UNC5B-AS1表達 選用全基因熒光定量PCR(聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR))試劑盒，16 μL反應體系中加入SYBR Mixture 8μL、引物：UNC5B-AS1，GAPDH 0.8μ、LcDNA Template 2 μL、dd H2O 5.2 μL。引物序列:LINC01510(Forward) CTGTGGAAGTTTGAGTGAC LINC01510(Reverse) T TCATCTATCCTCCTGCT β-Actin(Forward) CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT β-Actin(Reverse) GACAGCAC TGTGTTGGCGTA。溶解曲線(Dissociation curve)是指隨溫度升高DNA的雙螺旋結構降解程度的曲線。反應條件如下：

表1 PCR反應體系條件

1.2.6 細胞培養(yǎng)、凍存及復蘇 將細胞從液氮中取出，放入37 ℃溫水中，待凍存液融化后，1 000 rpm離心5 min，加入含10%/mL FBS，1%/mL青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，將細胞置于37 ℃、5% CO2，潮濕的培箱中培養(yǎng)。細胞生長至密度約90%～100%時，棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入大約0.5 mL的含EDTA的胰酶，消化細胞，使用含10%FBS，1%青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基進行傳代。待細胞長滿后，加入大約0.5 mL的含EDTA的胰酶，消化細胞，1 000 rpm離心5 min，棄掉上清，加入1 mL凍存液吹勻細胞，標記好細胞名稱和日期，放入凍存盒，-80 ℃保存，24 h后移入液氮中保存長期保存。

1.2.7 qRT-PCR檢測胃癌細胞株的UNC5B-AS1表達 培養(yǎng)胃癌細胞株IM95和MKN-45(均在6孔板中培養(yǎng))，細胞生長至密度約90%～100%時，消化細胞，通過qRT-PCR檢測細胞中UNC5B-AS1表達水平(方法同1.2.5)。

1.2.8 siRNA-UNC5B-AS1的轉(zhuǎn)染 將IM95和MKN-45接種到6孔板中，大約(1-5)×106例細胞，待IM95和MKN-45細胞密度達到80%時開始轉(zhuǎn)染。RNAi干擾序列為TGGAAACAACATAAATAT TA，配置轉(zhuǎn)染液：①siRNA-UNC5B-AS1組：A液：5μL siRNA-UNC5B-AS1+250μL相應的無血清培養(yǎng)基。siRNA-UNC5B-AS1-NC組：B液：5μL siRNA-UNC5B-AS1-NC+250μL相應的無血清培養(yǎng)基。室溫放置15 min到20 min。②C液：5 μL Lipo2000+250 μL相應的無血清培養(yǎng)基(3個siRNA-UNC5B-AS1，3個siRNA-UNC5B-AS1-NC，30 μL Lipo2000+500 μL全培)。室溫放置15 min到20 min。③混合250 μL A或B和250 μL C培養(yǎng)液，室溫放置15 min到20 min。④6孔板中加入1 mL相應的無血清培養(yǎng)基，15 min到20 min后加入c相應混合培養(yǎng)液。⑤6～8小時后IM95更換無血清培養(yǎng)基液為相應的高糖DMEM培養(yǎng)基(另加入10%FBS，1%青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)，而MKN-45用高糖1640培養(yǎng)基(另加入10%FBS，1%青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時后，顯微鏡下進行細胞計數(shù)，按照1 000個/孔密度接種到96孔板中，設置至少3個復孔。接種到96孔板的第二天，丟棄原培養(yǎng)液，每孔中加入90 μL無血清培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，2 h后用多功能微孔板檢測吸光度數(shù)據(jù)，每天測3例復孔。用多功能微孔板檢測吸光度數(shù)據(jù)，連續(xù)測5天。Excel表格統(tǒng)計吸光度數(shù)據(jù)，計算平均值和標準差，利用Graphpad prism5繪制CCK-8增殖曲線。

1.2.9 OE-UNC5B-AS1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 方法同上(siRNA-UNC5B-AS1的轉(zhuǎn)染)

1.2.10 CCK8實驗檢測UNC5B-AS1表達對胃癌細胞增殖的影響 實驗組和陰性對照組細胞接種于96孔板中，每組各取5個時間點(0 h，24 h，48 h，72 h，96 h)，每個時間點設置三個復孔。接種時將處于對數(shù)生長期的細胞，用0.25%的胰酶消化下來，計數(shù)，以2 000個細胞/孔的數(shù)量接種于96孔板中，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基。接種后第二天細胞生長至貼壁正常形態(tài)(此時算作0 h)，每孔加入10 μL CCK8，避光，置于培養(yǎng)箱中孵育90 min后，用酶標儀檢測450 nm波長下各孔的光密度(optical density，OD)值。同理，在24 h，48 h，72 h和96 h用同樣步驟檢測各孔OD值。根據(jù)OD值數(shù)據(jù)繪制細胞活力曲線。

1.2.11 劃痕實驗檢測UNC5B-AS1對胃癌細胞遷移的影響 分別在6孔板中用si-UNC5B-AS1轉(zhuǎn)染IM95和MKN-45細胞，OE-UNC5B-AS1轉(zhuǎn)染IM95和MKN-45細胞，并且設置對照組。轉(zhuǎn)染完成后，用10 μL槍尖在六孔板中劃3例平行的線，PBS清洗三次，加入2 mL相應的無血清培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照。24小時后顯微鏡下拍照，觀察細胞遷移的程度，實驗獨立重復三次。統(tǒng)計數(shù)據(jù)，制作圖片。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用統(tǒng)計軟件Graphpad prism 5軟件進行繪圖和統(tǒng)計，利用Kaplan-miere進行生存分析。實驗結果均重復三次，數(shù)據(jù)以平均值+標準差的形式展示,采用t檢驗比較兩組間差異，LogFC>=1.5.P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 篩選出差異表達的11個差異表達lncRNAs

TCGA(癌癥基因組圖譜)包括343例胃癌組織和30例癌旁組織，GSE54129(一個胃癌基因芯片數(shù)據(jù)集)包括111例人胃癌組織和21例非癌胃組織，t檢驗結果顯示：胃癌和非胃癌組織中共有539個差異表達的mRNAs和lncRNAs，t檢驗得出其中11個P<0.01且logFC>1的LncRNAs(圖1)，其具體logFC和P值如表2。

圖1 TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫差異表達lncRNA的篩選

表2 腫瘤與正常組相比差異表達的11個lncRNAs

2.2 UNC5B-AS1在胃癌中的臨床特征

在GEPIA網(wǎng)站中進一步分析UNC5B-AS1對胃癌臨床相關的病理特征以及預后的影響，結果顯示與正常組織相比(n=36)，UNC5B-AS1在胃癌組織(n=408)中顯著低表達，然而差異表達的UNC5B-AS1對胃癌患者的總生存期無顯著影響。高表達UNC5B-AS1與較差的DFS生存期顯著相關，且與較高的TNM分期(胃癌臨床分期，采用2010年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(UICC/AJCC)TNM分期標準)相關，見圖2。

2.3 UNC5B-AS1在胃癌組織中的表達

在胃癌組織中，mRNA水平的UNC5B-AS1表達較臨近的正常組織相比顯著低表達，P<0.05，見圖3。

圖2 UNC5B-AS1與胃癌臨床特征的相關性A:UNC5B-AS1在胃癌組織中的表達；B：UNC5B-AS1在組織中差異表達對總生存期的影響；C：不同表達的UNC5B-AS1對無復發(fā)生存期的影響；D：不同臨床分期胃癌患者的UNC5B-AS1的表達，*P<0.05

圖3 UNC5B-AS1在組織中的差異表達

2.4 UNC5B-AS1對胃癌細胞遷移的影響

在胃癌細胞株IM95細胞和MKN-45細胞中敲降和過表達UNC5B-AS1，通過CCK-8實驗檢測UNC5B-AS1對胃癌細胞增殖的影響，結果顯示UNC5B-AS1對胃癌細胞的增殖無顯著影響，見圖4。

我們進一步通過劃痕實驗檢測UNC5B-AS1對胃癌細胞遷移的影響，結果顯示敲降UNC5B-AS1顯著促進胃癌細胞的遷移；過表達UNC5B-AS1顯著抑制胃癌細胞的遷移，見圖5。

圖4 UNC5B-AS1對胃癌細胞增殖的影響與對照組比較，*P<0.05

圖5 UNC5B-AS1對胃癌細胞遷移的影響遷移率=(0 h距離-24 h后距離)/0h距離；與對照組比較，*P<0.05

3 討 論

在過去十年中胃癌的治療取得了重大進展，但由于癌癥特異性死亡的發(fā)生率高以及分子機制尚不清楚，患者的預后仍待評估。越來越多的研究表明lncRNAs在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起著至關重要的作用，lncRNA機制可能是胃癌干預和治療的關鍵節(jié)點。

TCGA數(shù)據(jù)庫已經(jīng)測量了癌癥患者的大規(guī)?；蚪M學和臨床特征，以便科學家們可以研究腫瘤基因組并破譯癌癥的遺傳基礎[6]。在本研究中，通過整合TCGA和GEO數(shù)據(jù)的mRNA表達譜，我們鑒定了11種在胃癌組織和癌旁組織中差異表達的lncRNAs，包括HAND2-AS1、MIR100HG和UNC5B-AS1等。其中，Miao F等人[7]報道HAND2-AS1通過與TGF-β1的相互作用抑制非小細胞肺癌遷移，侵襲并維持細胞干性。Su X等人[8]報道ELK1誘導的MIR100HG的上調(diào)預測不良預后并通過表觀遺傳沉默LATS1和LATS2促進骨肉瘤的進展。Wang Y等人[5]報道UNC5B-AS1促進乳頭狀甲狀腺癌細胞系的增殖，遷移和侵襲。然而UNC5B-AS1在胃癌中的作用未見任何報道。UNC5B，該基因編碼netrin受體家族的成員。這種特殊的蛋白質(zhì)介導netrin-1的排斥作用，是血管內(nèi)皮素受體。這種編碼的蛋白質(zhì)也在一組稱為依賴性受體(DpRs)的蛋白質(zhì)中，這些蛋白質(zhì)參與促凋亡過程和抗細胞凋亡過程。許多DpR參與胚胎發(fā)生和癌癥進展。已經(jīng)描述了該基因的兩種可變剪接的轉(zhuǎn)錄物變體[provided by RefSeq, Oct 2011]。UNC5B-AS1作為UNC5B的反義鏈，可能具有與UNC5B相似的生物功能，影響著腫瘤的進展。我們驗證了從醫(yī)院收集的28對胃癌組織和配對正常組織中UNC5B-AS1表達的結果，證實UNC5B-AS1在胃癌中表達顯著下調(diào)。研究報道lncRNA OCC-1(Overexpressed in colon carcinoma-1)在結腸癌組織中高表達[9]，然而lncRNA OCC-1卻通過破壞結直腸癌中的HuR蛋白抑制細胞生長[10]。OCC-1(也稱為ADG3(31))首次被鑒定為在結腸癌中過表達的lncRNA，然而與原位癌(Tis)和Ⅰ期腫瘤相比，晚期T期(Ⅱ期至Ⅳ期)樣本中OCC-1表達顯著下調(diào)，敲低OCC-1在體外和體內(nèi)促進結腸癌細胞的生長[10]。Lan Y等人[10]使用OCC-1 3′UTR作為RNA探針進行RNA pull-down測定，結果顯示OCC-1 RNA與HuR蛋白結合，進一步Western blot實驗表明OCC-1通過增強其與泛素E3連接酶β-TrCP1的結合來促進HuR的泛素化和降解，認為OCC-1可能調(diào)節(jié)HuR蛋白的穩(wěn)定性。由此，我們推測在胃癌組織中UNC5B-AS1可能同樣與某個基因結合，通過調(diào)節(jié)該基因的泛素化和降解，影響胃癌細胞的遷移。在臨床病理特征分析和生存分析中，我們發(fā)現(xiàn)UNC5B-AS1高表達與較差的DFS顯著相關，并且高分級的胃癌組織較低分級的胃癌組織高表達UNC5B-AS1。進一步的功能實驗顯示UNC5B-AS1促進胃癌細胞的遷移，然而對胃癌細胞的增殖無顯著影響。

根據(jù)UNC5B-AS1在胃癌組織中低表達，以及UNC5B-AS1對胃癌細胞遷移的抑制作用，我們推測UNC5B-AS1有可能是一個抑癌基因。但是為何相對于Ⅰ期胃癌患者，Ⅱ期至Ⅳ期的胃癌患者高表達UNC5B-AS1，且高表達UNC5B-AS1的胃癌患者DFS較差還有待進一步的研究。

總之，本研究表明，UNC5B-AS1在胃癌中顯著下調(diào)，可能與無復發(fā)生存期密切相關。UNC5B-AS1促進胃癌細胞的遷移。該研究為胃癌提供了新的預測胃癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移的生物標志物和治療靶點，為胃癌的治療奠定理論基礎。