張昕禹曹 妍嚴(yán)文靜王 雯

(1.首科醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系;2.代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)又稱為高半胱氨酸，是一種含硫氨基酸。在2018年高血壓防治指南中將空腹血漿總Hcy水平≥15 μmol/L定義為高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia，HHcy)[1]。HHcy作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。由于心肌細(xì)胞收縮舒張需要大量的ATP，心臟是人體中能量消耗最多的器官。線粒體對(duì)于心肌的能量代謝至關(guān)重要。線粒體自噬是可清除受損線粒體，減少受損線粒體的蛋白外泄，發(fā)揮質(zhì)量調(diào)控的作用，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。多項(xiàng)研究表明，線粒體自噬對(duì)于維持心血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定尤為重要[3-4]。那么，HHcy是否可以通過介導(dǎo)線粒體自噬受損，進(jìn)而破壞線粒體結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷？本研究擬探討線粒體自噬在Hcy誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中的作用，為進(jìn)一步闡明HHcy導(dǎo)致心肌損傷的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級(jí)雄性8周齡SD大鼠由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;大鼠血漿Hcy濃度Elisa試劑盒(南京建成,中國);胎牛血清(Gibco公司，美國);高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司,美國);Hcy試劑(Sigma-Aldrich公司,美國);Drp1抗體(Mouse mAb：14647，CST，美國)、COX IV抗體(Mouse mAb：11967，CST，美國)、LC3抗體(Rabbit mAb：12741，CST，美國)和PINK抗體(Rabbit mAb：ab23707，Abcam,美國);GAPDH抗體、山羊抗兔IgG/生物素標(biāo)記、山羊抗小鼠IgG/生物素標(biāo)記(中杉金橋,中國);ECL超敏二步法檢測(cè)試劑盒(Merck Millipore公司,德國);ATP檢測(cè)試劑盒(碧云天,中國)；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)(碧云天,中國)；Western blot小垂直板電泳槽和電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國)；Spectra Max M2/M2e酶標(biāo)儀(MD公司，美國)。

1.2 主要方法

1.2.1 HHcy大鼠模型建立及Hcy濃度的檢測(cè) 高蛋氨酸飲食法構(gòu)建HHcy大鼠模型。SD大鼠隨機(jī)自由分組：正常飲食組和2.5%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)組,6個(gè)月后,Elisa試劑盒檢測(cè)大鼠血漿Hcy濃度確定造模成功。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒流程操作。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將H9C2細(xì)胞置于含1%雙抗和10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基以及95%O2、5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育。待細(xì)胞復(fù)蘇貼壁及形態(tài)狀態(tài)完好后,隔天換液培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30%～40%進(jìn)行傳代至6孔板繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：Control組、Hcy組。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇時(shí)間點(diǎn)及刺激濃度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3 LC3和COX IV免疫熒光共定位染色 將心臟組織冰凍切片從-80 ℃冰箱取出，50 ℃烘箱烘片20 min，用PBS漂洗5 min×3次,10%多聚甲醛固定10 min,再用PBS漂洗5 min×3次，2%Triton處理10 min，用PBS漂洗5 min×3次，1%BSA封閉1 h，甩掉封閉液,同時(shí)加入LC3和COX IV抗體(1:200),4 ℃孵育過夜;隔日,室溫30 min,PBS漂洗5 min×3次,滴加熒光二抗,37 ℃水浴鍋1 h，PBS漂洗5 min×3次，DAPI染核5 min。熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu) 將約1 mm3新鮮心肌組織迅速固定于2.5%戊二醛溶液中4 h，PB漂洗10 min×3次，進(jìn)行標(biāo)本制備(上述操作均在4 ℃進(jìn)行)。透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.5 JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位 當(dāng)6孔板細(xì)胞密度達(dá)30%～40%,給予細(xì)胞500 μM Hcy共孵育48 h。在1×PBS中重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞篩選分析；進(jìn)行細(xì)胞爬片用共聚焦顯微鏡觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照J(rèn)C-1試劑盒流程操作。

1.2.6 18F-FDG PET/CT檢測(cè)心肌對(duì)葡萄糖的攝取 將大鼠置于固定器中，經(jīng)鼠尾靜脈注入顯像劑18F-FDG，經(jīng)過1 h完全吸收后，麻醉后仰臥位進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。先行CT掃描，再行PET掃描。SUV計(jì)算公式：SUV=局部感興趣區(qū)放射性活度(MBq/mL)/注射放射性活度(MBq)/體質(zhì)量(g)。

1.2.7 心肌ATP檢測(cè) 常規(guī)提取心肌組織裂解液，加100 μL ATP檢測(cè)工作液到避光孔內(nèi)。在避光孔內(nèi)加上20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速用微量移液器混勻。至少間隔2秒后，用化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定RLU值。測(cè)定樣品中的蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP的濃度，然后把ATP的濃度換算成nmol/mg蛋白的形式進(jìn)行標(biāo)化。

1.2.8 Western blot 從-80 ℃取出組織，用RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制劑)進(jìn)行裂解,超聲破碎，4 ℃、14 000 rpm離心20 min，上清即為蛋白提取液。BCA法檢測(cè)蛋白濃度。加入30 μg蛋白樣品，以80～120 V的SDS-PAGE電泳條件分離蛋白,后以恒壓100 V、1.5 h的電轉(zhuǎn)條件將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后孵育一抗,4 ℃過夜。常規(guī)洗膜孵育二抗,加入ECL超敏發(fā)光液，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光,得到灰色條帶。通過Image Lab軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用Prism6.0軟件進(jìn)行分析,并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,P<0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HHcy大鼠模型構(gòu)建成功

采用2.5%蛋氨酸飲食飼養(yǎng)SD大鼠6個(gè)月后，其血漿Hcy濃度顯著高于正常飲食飼養(yǎng)的大鼠，提示HHcy大鼠模型構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 大鼠血清Hcy濃度*P<0.05 vs Control, n=9

2.2 HHcy大鼠心肌組織線粒體自噬水平下降

首先對(duì)大鼠心肌組織冰凍切片進(jìn)行線粒體標(biāo)志LC3-COX IV免疫熒光共定位染色。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，HHcy 組心肌組織線粒體中LC3(自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3)表達(dá)下調(diào)(圖2A)，其熒光強(qiáng)度下降；線粒體動(dòng)態(tài)的分裂/融合過程也對(duì)線粒體自噬有著重要影響。我們采用Western blot法對(duì)大鼠心肌組織中線粒體融合/分裂的標(biāo)記蛋白Drp1(動(dòng)力相關(guān)蛋白1)和介導(dǎo)線粒體自噬的PINK-Parkin通路中PINK的蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，HHcy組心肌組織中Drp1和PINK蛋白的表達(dá)均減少(圖2B)，提示HHcy大鼠心肌線粒體自噬降低。

圖2 HHcy大鼠心肌線粒體自噬水平的改變A:大鼠心肌線粒體自噬LC3-COX IV免疫熒光共定位染色(20×)；B:大鼠心肌線粒體分裂/融合標(biāo)記蛋白和PINK-Parkin通路蛋白表達(dá)情況*P<0.05 vs Control, n=5

2.3 HHcy大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)受損

我們進(jìn)一步探究HHcy介導(dǎo)的線粒體自噬不足是否能夠引起線粒體的損傷。首先，通過透射電鏡對(duì)HHcy模型大鼠心肌的線粒體微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示與對(duì)照組大鼠相比，HHcy大鼠心肌的線粒體排列紊亂，輪廓模糊，膜破損溶解，嵴消失(圖3A)；接著，給予H9C2細(xì)胞Hcy刺激48 h，進(jìn)行JC-1染色，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，Hcy導(dǎo)致線粒體膜電位下降(圖3B)，進(jìn)一步提示心肌細(xì)胞中的線粒體結(jié)構(gòu)受損。

圖3 HHcy大鼠心肌組織線粒體結(jié)構(gòu)的改變A: 透射電鏡觀察大鼠心肌組織中線粒體超微結(jié)構(gòu)；B:Hcy刺激H9C2觀察線粒體膜電位(MMP)的變化*P<0.05 vs Control, n=5

2.4 HHcy大鼠心肌組織線粒體功能受損

生理情況下，心肌細(xì)胞所需的ATP主要來自線粒體的氧化代謝，極少量來源于糖酵解。在有氧條件下，正常心臟優(yōu)先利用脂肪酸。為探究HHcy對(duì)心臟能量代謝情況的影響， 我們通過18F-FDG PET/CT對(duì)HHcy大鼠心肌葡萄糖攝取情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HHcy大鼠心肌的葡萄糖攝取率增加(圖4A)，提示HHcy大鼠心肌對(duì)能量物質(zhì)的利用發(fā)生改變，心肌對(duì)能量底物代謝從優(yōu)先利用脂肪酸向利用葡萄糖轉(zhuǎn)變，是心肌能量代謝失衡的表現(xiàn)之一。我們進(jìn)一步對(duì)大鼠心肌組織中的ATP含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，HHcy大鼠心肌組織中ATP含量降低，提示HHcy大鼠心肌線粒體能量供應(yīng)障礙(圖4B)。

圖4 HHcy大鼠心肌線粒體功能的改變A:18F-FDG PET/CT觀察大鼠心肌葡萄糖攝取情況；B:大鼠心肌線粒體ATP含量的變化*P<0.05 vs Control，n=5

3 討 論

多項(xiàng)研究表明，血漿Hcy病理性升高是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但是關(guān)于HHcy造成心腦血管疾病的具體機(jī)制尚不明確。在神經(jīng)元中，線粒體自噬在代謝穩(wěn)態(tài)、能量供應(yīng)、神經(jīng)元存活和健康中起著重要作用。線粒體自噬缺陷會(huì)導(dǎo)致受損線粒體的積累和細(xì)胞功能障礙，引起衰老和年齡易感性神經(jīng)退化[5]。與神經(jīng)元類似，心肌細(xì)胞也是終末分化細(xì)胞，且一直在不停的收縮與舒張，消耗大量的能量。線粒體是心肌細(xì)胞能量代謝的重要細(xì)胞器。而線粒體自噬是維持線粒體能量供應(yīng)的有效機(jī)制[6]。近年來，線粒體自噬的激活被認(rèn)為是具有心臟保護(hù)性的。例如PTEN介導(dǎo)的線粒體自噬可防止心臟缺氧/復(fù)氧損傷[7]，Ulk1/Rab9介導(dǎo)的線粒體自噬在能量應(yīng)激期間提供心臟保護(hù)作用[8]。線粒體自噬還可以保護(hù)心臟免受糖尿病損傷[7]，且抑制Sirt3-Foxo3A-Parkin信號(hào)介導(dǎo)的線粒體自噬的下調(diào)可能在糖尿病心肌病的發(fā)展中起重要作用[9-10]。多項(xiàng)研究表明，Hcy 能夠抑制自噬的發(fā)生[11]，Hcy能夠通過mTOR信號(hào)通路抑制乳鼠心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生[12]，也能通過 AMPK/mTOR信號(hào)通路抑制平滑肌細(xì)胞自噬[13]。線粒體自噬是一種選擇性自噬，Hcy是否也能影響心肌細(xì)胞的線粒體自噬及線粒體功能，鮮少報(bào)道。

本研究通過免疫熒光共定位染色和Western blot檢測(cè)了HHcy大鼠心肌組織線粒體自噬的發(fā)生情況，結(jié)果提示，HHcy 組心肌組織線粒體中自噬關(guān)鍵相關(guān)蛋白 LC3表達(dá)下調(diào)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)調(diào)控線粒體自噬的分裂/融合蛋白中，HHcy組心肌組織中介導(dǎo)分裂的Drp減少，PINK-Parkin信號(hào)通路相關(guān)蛋白PINK1降低；以上均提示HHcy大鼠的心肌組織中線粒體自噬水平明顯降低。為進(jìn)一步驗(yàn)證在此過程中線粒體自噬的不足是否會(huì)引起線粒體的損傷，我們對(duì)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HHcy大鼠的心肌組織中線粒體排列紊亂，輪廓模糊，膜破損溶解，嵴消失；進(jìn)而又在離體細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，Hcy導(dǎo)致線粒體膜電位降低。最后，我們又對(duì)線粒體功能進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HHcy大鼠的心肌組織中線粒體對(duì)葡萄糖的攝取增加，ATP產(chǎn)生減少，提示HHcy大鼠心肌線粒體能量代謝障礙。

綜上，本研究表明在HHcy可能是通過降低線粒體自噬的發(fā)生，進(jìn)而損傷線粒體的結(jié)構(gòu)和功能, 最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡。這可能是HHcy參與心腦血管疾病的關(guān)鍵機(jī)制之一。本研究擴(kuò)展了HHcy對(duì)心肌損傷的機(jī)制研究, 為防治HHcy導(dǎo)致的心血管疾病提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。