宮亞婭 魯懷偉 王琦 操樂杰

結(jié)核病的準確診斷是有效治療的關(guān)鍵因素，目前主要的診斷方法包括痰涂片抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及分子生物學(xué)檢測等[1]。對于無痰患者，無法進行痰涂片抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。因此，可以考慮獲取組織學(xué)證據(jù)排除其他診斷，最終確診肺結(jié)核的存在。2010年12月，WHO的報告推薦使用GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)檢測技術(shù)應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷[2]。中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[3]也明確了病理學(xué)和分子生物學(xué)檢查在肺結(jié)核診斷中的地位。本研究以安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院疑診的肺結(jié)核患者為研究對象，評估抗酸染色和GeneXpert檢測對肺結(jié)核手術(shù)標本的診斷價值。

資料和方法

一、研究對象

1. 研究對象的選擇：收集2017年6月至2019年1月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，門診診斷為疑診肺結(jié)核，肺癌不能排除，行肺部手術(shù)治療的63例患者。排除病理標本不合適的3例患者，最終納入60例患者作為研究對象。其中，男42例，女18例；年齡21～80歲，平均年齡(48.0±13.4)歲。病理標本中，表現(xiàn)為干酪樣壞死性肉芽腫的標本16例，表現(xiàn)為肉芽腫不伴有干酪樣壞死的標本44例。

2. 納入標準：(1)根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[3]，影像學(xué)(CT檢查)提示結(jié)節(jié)病灶或空洞；考慮疑診肺結(jié)核，肺癌不能排除。(2)因患者病灶位置及大小等原因，無法行支氣管鏡下穿刺或肺穿刺等活檢-病理檢查，因而行肺部手術(shù)獲得病理組織，術(shù)后病理提示為肉芽腫性疾病，考慮為肺結(jié)核可能；依據(jù)《中國結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識》[4]，病理組織鏡下表現(xiàn)具有滲出性、壞死性、增生性3種基本病理變化中至少一種病變類型。

3. 排除標準：臨床資料不全，送檢標本因過小、破碎、固定不當、自溶、嚴重變形等，無法做出診斷者。

二、研究方法

(一)儀器與試劑

光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，型號CX31)、萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、GeneXpert檢測系統(tǒng)和檢測試劑盒[賽沛(上海)商貿(mào)有限公司]、晶芯?芯片分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法；博奧晶典生物技術(shù)有限公司)。

(二)檢測方法

1. 抗酸染色法：將肺手術(shù)標本置于10%中性福爾馬林溶液中充分固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度為3～4 μm，65 ℃烤片2 h，脫蠟2次，每次5～10 min，切片脫蠟后，待余液揮發(fā)干，用流水沖洗至無肉眼可見油狀物附著，使用Z-N方法染色。常規(guī)脫水和安裝后，由2位病理學(xué)家在油鏡下檢查處理過的樣本。具體操作參見《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[5]。

2. GeneXpert檢測：在一支干凈的離心管中加入8片10 μm厚手術(shù)肺組織石蠟包埋切片，加入320 μl脫蠟溶液，于56 ℃孵育3 min，加入180 μl ATL緩沖液，旋渦振蕩，11 000×g離心1 min，加入20 μl蛋白酶K至下部澄清的液相層中，于56 ℃孵育至少1 h直至組織切片完全消化，再于90 ℃孵育1 h。將下部無色透明的液相及底部沉淀一同吸出至一個新的螺蓋離心管中(>2 ml)，向其中加入2 ml樣本處理液，渦旋振蕩混勻后，加入試劑匣。GeneXpert檢測結(jié)果在2 h內(nèi)自動生成并報告為未檢測到MTB或檢測到MTB，半定量化為極少量、少量、中量、大量；同時報告利福平敏感或耐藥。實驗操作嚴格按照GeneXpert檢測試劑盒說明書使用。

3. 分枝桿菌菌種鑒定：采用晶芯?芯片分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)進行分枝桿菌菌種鑒定。將手術(shù)肺組織石蠟包埋切片標本置于無菌密封瓶，將標本分為2份，1份用于檢測，另1份用于兩種檢測有差異時的復(fù)查備用或進行重復(fù)性實驗；向滅活后的標本中加入等體積10%的NaOH溶液，于37 ℃液化30 min；取1 ml上述液化標本，以離心半徑8 cm，12 000 r/min離心5 min，去除上清液；向離心管中加入1 ml生理鹽水，渦旋后再次以離心半徑8 cm，12 000 r/min 離心5 min，去上清液備用。將上清液進行核酸提取、PCR擴增，將雜交溶液加入芯片，置于雜交儀，50 ℃雜交2 h后于雜交儀中洗滌，將完成洗滌、甩干的芯片插入LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀插槽中，運行相應(yīng)的分枝桿菌菌種鑒定程序，對芯片進行掃描及判讀。實驗操作嚴格按照分枝桿菌菌種鑒定試劑盒說明書使用。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以“率(%)”表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

60例疑診肺結(jié)核患者的手術(shù)病理標本中，抗酸染色檢出陽性29例，GeneXpert檢出陽性28例。抗酸染色、GeneXpert的陽性檢出率分別為48.3%(29/60)和46.7%(28/60)。其中，4例GeneXpert檢測陽性，抗酸染色結(jié)果為陰性；5例GeneXpert檢測陰性，抗酸染色結(jié)果為陽性。若以任意一種方法檢測陽性作為聯(lián)合檢測的陽性標準，聯(lián)合檢測的陽性率為55.0%(33/60)，較抗酸染色的陽性檢出率提高 6.7%，較GeneXpert的陽性檢出率提高8.3%。

在60例疑診肺結(jié)核患者中，GeneXpert檢測在干酪樣和非干酪樣壞死標本中的陽性檢出率分別為81.2%(13/16)和34.1%(15/44)；抗酸染色在干酪樣和非干酪樣壞死標本中的陽性檢出率分別為87.5%(14/16)和34.1%(15/44)。GeneXpert檢測和抗酸染色檢測干酪樣壞死標本的檢出率均明顯高于非干酪樣壞死標本，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.48，P=0.001；χ2=13.40，P<0.001)。

60例標本中，5例標本抗酸染色陽性，GeneXpert檢測為陰性；為排除非結(jié)核分枝桿菌感染的可能，此5例標本進行分枝桿菌菌種鑒定，結(jié)果顯示5例均為結(jié)核分枝桿菌，提示GeneXpert檢測存在假陰性的可能。在GeneXpert檢測陽性的28例標本中，有3例(10.7%)被報告為對利福平耐藥。

討 論

由于結(jié)核分枝桿菌病原菌的基因變異，糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，抗生素的不規(guī)范使用等原因，越來越多肺結(jié)核患者的癥狀、體征變得不典型，當影像學(xué)表現(xiàn)為結(jié)節(jié)或腫塊時，容易與肺癌或結(jié)節(jié)病相混淆[6]。病理檢查為診斷結(jié)核病的方法之一，不同結(jié)核病患者的病理標本可以見到滲出、增生、變性壞死等不同類型的結(jié)核病病理表現(xiàn)，不同病理類型反映了患者機體的不同免疫狀態(tài)[7]。同時，能引起與結(jié)核病相似的肉芽腫性炎和壞死的病因很多，包括非結(jié)核分枝桿菌感染、曲霉菌病、隱球菌病、異物肉芽腫等，需要與結(jié)核病鑒別[8]。由于抗酸染色易受非結(jié)核分枝桿菌的干擾，因此不能僅憑抗酸染色陽性就確診結(jié)核病，而只能提示可能存在結(jié)核病[5]。而新近發(fā)展的分子檢測方法針對結(jié)核分枝桿菌核酸進行檢測，可以對結(jié)核病患者進行明確診斷。

GeneXpert檢測為一種全自動實時聚合酶鏈反應(yīng)測定法，由工作人員進行較少的培訓(xùn)即可完成，可以在2 h內(nèi)提供結(jié)果，同時具有操作簡便、核酸污染低、操作人員安全等優(yōu)點[9]。對肺結(jié)核的診斷有很高的特異度，并且已廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的診斷[10-11]。Rindi等[12]評估了石蠟包埋的組織標本行GeneXpert檢測的可行性，研究共收集了14份標本，3份來自胸膜，1份來自鎖骨上淋巴結(jié)，10份來自肺組織，在所有14份抗酸染色陽性標本中GeneXpert檢測結(jié)果均為陽性。但本研究有5份標本抗酸染色結(jié)果為陽性，GeneXpert檢測為陰性，且隨后進行的分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果均為結(jié)核分枝桿菌，原因可能在于石蠟組織經(jīng)固定、脫水、透明等前期處理時，對結(jié)核分枝桿菌DNA產(chǎn)生了影響，特別是對于含菌量極少的組織，長期儲存可能導(dǎo)致DNA降解(本研究收集的標本時間為2年內(nèi))，使其GeneXpert檢測結(jié)果顯示為陰性[13]。此外，當患者肺組織標本中含菌量極少時，抗酸染色切片和GeneXpert檢測切片不在同一切面上，有可能存在GeneXpert切片組織內(nèi)不含菌的情況。因此，獲得合適的肺組織病理切片，并立即進行檢測可提高GeneXpert的陽性檢出率。抗酸染色因具備簡便、花費少的特點，可在患者初篩時使用，但是由于其無法鑒別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，僅能做出提示性診斷，無法最終確診，為獲得明確診斷結(jié)果，仍需依賴GeneXpert檢測，必要時可采取兩種方法聯(lián)合檢測。本研究結(jié)果顯示，GeneXpert與抗酸染色方法聯(lián)合檢測的陽性檢出率為55.0%，達到“十三五”全國結(jié)核病防治規(guī)劃要求的到2020年病原學(xué)檢出率提高至50%的目標。

本研究結(jié)果顯示，4例患者GeneXpert檢測結(jié)果為陽性，抗酸染色未能檢出，提示如果患者臨床表現(xiàn)符合肺結(jié)核特征，抗酸染色陰性不能完全排除結(jié)核病。同時，GeneXpert檢測可以利用實時熒光定量核酸檢測技術(shù)，在檢測結(jié)核分枝桿菌的同時檢測是否對利福平耐藥，且GeneXpert檢測與藥物敏感性試驗在檢測利福平耐藥性上具有高度一致性，可為后續(xù)治療提供依據(jù)[14]。本研究中，檢測出利福平耐藥的比率為10.7%，說明在明確診斷肺結(jié)核的患者中存在一定比例的耐利福平患者，如果能夠同時將耐藥結(jié)果檢測出來，對于規(guī)范結(jié)核病的診斷、及時合理治療耐藥結(jié)核病具有重要意義。

本研究存在很多不足之處：首先，研究樣本量偏小；其次，本研究僅對抗酸染色陽性、GeneXpert檢測陰性的標本進行了菌種鑒定，未對全部患者標本進行菌種鑒定；再者，本研究未納入非結(jié)核病患者，無法進行特異度及其他檢測效能的比較。未來還需要收集更多的病理標本進行相關(guān)的驗證。