林洪斌，畢小朋，方佳興，劉 燕，劉 平，丁文武，車(chē)振明，何 強(qiáng)

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065）

郫縣豆瓣，四川省成都市郫都地區(qū)特產(chǎn)的一種蠶豆瓣辣椒醬，是中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品，具有二百余年悠久歷史的地方特色發(fā)酵食品，其制作技藝于2008年被列第2批國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄[1]。郫縣豆瓣香氣的形成極其復(fù)雜，與原料、米曲霉菌、非酶化學(xué)反應(yīng)生成物均可能有關(guān)系[2]。有研究表明，蠶豆瓣熱處理、制曲過(guò)程、甜瓣子發(fā)酵和后發(fā)酵是郫縣豆瓣制作的關(guān)鍵步驟[1-6]。

近年來(lái)，發(fā)酵調(diào)味品香氣物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中的變化規(guī)律逐漸受到人們的重視。國(guó)外如Lertsiri[7]采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS）聯(lián)用和氣相色譜-嗅聞法對(duì)泰國(guó)醬油的揮發(fā)性風(fēng)味化合物及其與風(fēng)味譜的關(guān)系進(jìn)行研究；Song等[8]采用培養(yǎng)依賴法和培養(yǎng)無(wú)關(guān)法對(duì)韓國(guó)醬油在發(fā)酵過(guò)程中酵母菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，同時(shí)用GC-MS法對(duì)揮發(fā)性化合物的變化進(jìn)行了分析；Kaneko等[9]采用香味提取稀釋法對(duì)日本生抽（未加熱）和加熱醬油中主要的香氣化合物進(jìn)行了研究。國(guó)內(nèi)如田甜等[10]采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS技術(shù)探索了傳統(tǒng)豆醬香氣品質(zhì)最佳的發(fā)酵時(shí)期。相歡等[11]通過(guò)固相微萃?。╯olidphase microextraction，SPME）、溶劑萃?。╯olvent extraction，SE）以及GC-MS結(jié)合的方法，研究不同固形物濃度對(duì)醬油香氣物質(zhì)的影響；趙星賀等[12]采用SPME對(duì)北京干黃醬中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了提取，提取物經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜-嗅覺(jué)檢測(cè)器聯(lián)用（gas chromatographyolfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）進(jìn)行分離與鑒定。郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)變化的報(bào)道較多，如黃湛[13]以一級(jí)傳統(tǒng)郫縣豆瓣為研究對(duì)象，運(yùn)用SPME、GC-MS和氣相色譜嗅覺(jué)（gas chromatographyolfactometry，GC-O）測(cè)量法對(duì)揮發(fā)性成分和特征香氣物質(zhì)進(jìn)行了鑒定，并結(jié)合偏最小二乘回歸和電子鼻技術(shù)分析郫縣豆瓣發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律，探究特征風(fēng)味物質(zhì)的形成規(guī)律。目前郫縣豆瓣發(fā)酵過(guò)程中香氣變化已有報(bào)道，然而關(guān)于郫縣豆瓣中香氣物質(zhì)來(lái)源及其與原料和整體工藝過(guò)程的關(guān)系尚不清楚。

本研究主要探究郫縣豆瓣香氣化合物在郫縣豆瓣生產(chǎn)過(guò)程的變化規(guī)律，包括原料、制曲、保溫發(fā)酵、后發(fā)酵階段香氣化合物的變化，明確其形成的時(shí)間點(diǎn)，推測(cè)香氣化合物形成途徑和機(jī)理，并探討其與整體風(fēng)味的關(guān)系，為郫縣豆瓣產(chǎn)品在發(fā)酵過(guò)程中的香氣調(diào)控和風(fēng)味的改善提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

郫縣豆瓣原料及發(fā)酵過(guò)程樣品取自四川郫縣豆瓣股份有限公司；取樣工藝點(diǎn)：原料：干蠶豆瓣、燙漂蠶豆瓣、椒醅，分別編號(hào)為D1、D2、J1；制曲3、6 d（成曲）樣品，分別編號(hào)為Q1、Q2；甜瓣子發(fā)酵15、30、60 d樣品，分別編號(hào)為H1、H2、H3；后發(fā)酵3、6、12、24、36 個(gè)月樣品，分別編號(hào)為3M、6M、1Y、2Y、3Y；于－4 ℃冷藏保存。

二氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水乙醚（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；1,2-二氯苯（標(biāo)準(zhǔn)品）、C8～C20正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品 西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄、75μm CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司；GCMS-QP2010 Plus GC-MS用儀 日本島津儀器公司；Olfactory Detection Port 3嗅聞儀 德國(guó)Gerstel科技有限公司；PEN 3.5系統(tǒng)便攜式電子鼻 德國(guó)Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 SE方法

稱取50.00 g郫縣豆瓣樣品于250 mL錐形瓶中，加入50 mL二氯甲烷，瓶口塞入脫脂棉并用保鮮膜密封，置于130 r/min、18 ℃的搖床中萃取20 h，然后于4 ℃冷凍離心15 min，減壓濃縮至5～6 mL，再用氮?dú)獯祾咧量傮w積為1 mL，于－4 ℃保存待GC-MS分析。

1.3.2 SPME方法

稱取4.000 g樣品于15 mL頂空進(jìn)樣瓶中，添加2 mL 19% NaCl溶液以提高提取率，用PTFE-silicone瓶蓋密封。55 ℃恒溫平衡30 min后，插入CAR/PDMS（75 μm）萃取頭在55 ℃萃取40 min，萃取結(jié)束后在GC進(jìn)樣口（240 ℃）解吸5 min。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS測(cè)定

1.3.3.1 氣相色譜條件

SE進(jìn)樣條件：Agilent DB-WAX-UI石英毛細(xì)柱（30 mh 0.25 mm，0.50 μm）。升溫程序：40 ℃保持1 min，以7 ℃/min升至150 ℃，保持10 min；以3 ℃/min升至185 ℃，保持5 min；以8 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。載氣（He）流速1.1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL；分流比為10∶1。兩次進(jìn)樣均以220 ℃老化20 min，去除色譜柱中殘留雜質(zhì)。

SPME進(jìn)樣條件：Agilent DB-WAX-UI石英毛細(xì)柱（30 mh 0.25 mm，0.50 μm）。升溫程序：40 ℃保持1 min，以7 ℃/min升至150 ℃，保持10 min；以3 ℃/min升至185 ℃，保持5 min。

載氣（He）流速1.0 mL/min，壓力2.4 kPa；分流比為1∶3。兩次進(jìn)樣均以220 ℃老化20 min，去除色譜柱中殘留雜質(zhì)。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度240 ℃；離子源溫度230 ℃；母離子m/z 285；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～350。

1.3.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性與定量

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性分析：GC-MS檢測(cè)所得化合物質(zhì)譜圖經(jīng)NST.2010質(zhì)譜庫(kù)檢索，按檢索結(jié)果相似性高低進(jìn)行定性，結(jié)合保留指數(shù)法對(duì)化合物輔助定性，即使用C6～C20正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下測(cè)試，得到一系列正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，并按照式（1）得到保留指數(shù)（RI）：

式中：N為與風(fēng)味物質(zhì)相鄰的較小烷烴的碳原子數(shù)；n為風(fēng)味物質(zhì)插入到的兩個(gè)系列烷烴碳原子數(shù)差值；tRa為保留時(shí)間、tR（N＋n）為相鄰較小烷烴的保留時(shí)間、tRN為相鄰較大烷烴的保留時(shí)間[14]。

定量分析采用內(nèi)標(biāo)法：以鄰二氯苯為內(nèi)標(biāo)物，其質(zhì)量濃度為250 μg/mL（二氯甲烷為溶劑）。在SE法中：萃取液總體積為1 mL，然后分別取50 μL萃取液與1 μL內(nèi)標(biāo)溶液混合，根據(jù)式（2）、（3）進(jìn)行計(jì)算。在SPME法中：向頂空瓶中加入1 μL內(nèi)標(biāo)溶液再進(jìn)行吸附萃取。

式中：A0為內(nèi)標(biāo)物鄰二氯苯的峰面積；Ai為待測(cè)物質(zhì)的峰面積；C0為內(nèi)標(biāo)溶液的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Ci為待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；X為待測(cè)物質(zhì)的含量/（μg/g）；Vi進(jìn)樣體積/mL；V0為混合液中所含的內(nèi)標(biāo)物體積/mL；i為萃取液體積/mL；m為處理前樣品的 質(zhì)量/g。為簡(jiǎn)化計(jì)算i/（v0＋i）統(tǒng)一近似處理為1。

1.3.4 香氣活性物質(zhì)的測(cè)定

采用GC-O-MS對(duì)郫縣豆瓣活性物質(zhì)進(jìn)行鑒定，GC條件同1.3.3節(jié)，同時(shí)連接嗅聞儀裝置，流出柱子的揮發(fā)性物質(zhì)1∶1（V/V）分流到質(zhì)譜檢測(cè)器和嗅聞口。挑選3 位有嗅聞描述經(jīng)驗(yàn)的感官評(píng)定員，按時(shí)間強(qiáng)度法進(jìn)行嗅聞實(shí)驗(yàn)，嗅聞的同時(shí)進(jìn)行時(shí)間強(qiáng)度和香氣描述。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每個(gè)樣品每位嗅聞?wù)咧貜?fù)嗅聞3 次，嗅聞時(shí)間為程序時(shí)間，統(tǒng)一由一名人員對(duì)氣味出現(xiàn)時(shí)間、氣味強(qiáng)度、香氣特征描述進(jìn)行記錄。

1.3.5 電子鼻分析

電子鼻測(cè)定時(shí)間240 s；頂空溫度25 ℃；內(nèi)部流量300 mL/min；進(jìn)樣流量300 mL/min。每種樣品平行 測(cè)定6 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行主成分分析和聚類分析，Excel 2016和Origin 9進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 郫縣豆瓣發(fā)酵過(guò)程揮發(fā)性物質(zhì)變化規(guī)律

從郫縣豆瓣原料到發(fā)酵整個(gè)過(guò)程共鑒定出240 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中有醇、醛、酸、酯、酮、烴、醚、雜環(huán)、酚、胺和其他類。各階段檢出的風(fēng)味物質(zhì)的組成和各揮發(fā)性風(fēng)味成分的濃度均不同，D1、D2、J1、Q1、Q2、H1、H2、H3、3M、6M、1Y、2Y、3Y樣品分別檢出32、29、27、50、35、49、45、70、61、54、49、42、36 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

圖 1 郫縣豆瓣發(fā)酵全過(guò)程揮發(fā)性物質(zhì)種類變化Fig. 1 Changes in the types of volatile components of Pixian broad-bean paste throughout the fermentation process

從圖1可以看出，在H1和6M兩個(gè)工藝點(diǎn)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)增加最多，后發(fā)酵期間揮發(fā)性物質(zhì)含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，由此判斷香氣物質(zhì)從制曲逐漸開(kāi)始產(chǎn)生，接著在甜瓣子發(fā)酵過(guò)程中大量形成并積累，后發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)選擇性的消長(zhǎng)，風(fēng)味逐漸形成。

在郫縣豆瓣發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程中，各類物質(zhì)的此消彼長(zhǎng)并沒(méi)有呈現(xiàn)明顯變化規(guī)律，其中椒胚中醇類含量最高，占揮發(fā)性成分的67.13%；同時(shí)，醇類物質(zhì)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，醛類物質(zhì)在甜瓣子發(fā)酵過(guò)程中大量產(chǎn)生，酯類物質(zhì)在后發(fā)酵過(guò)程中逐漸積累。而結(jié)合香氣化合物來(lái)看，醛類物質(zhì)對(duì)整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)占據(jù)主導(dǎo)地位。

通過(guò)聚類分析對(duì)郫縣豆瓣發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行相似性分析，分析不同發(fā)酵時(shí)期郫縣豆瓣香氣成分差異性。 由圖2可知，樣品D1和樣品Q1在最小距離水平上形成一個(gè)小類，表明兩者之間具有較大的相似性；同時(shí)樣品H3和樣品3M也在最小距離水平上形成一個(gè)小類，也表明兩者之間具有較大的相似性，但隨著歐式距離增大到15左右時(shí)，樣品1～8聚為一類，說(shuō)明樣品D1、D2、Q1、Q2、H1、H2、H3、3M的揮發(fā)性化合物具有較大差異。當(dāng)歐氏距離增至將近20時(shí)，樣品6M、1Y、2Y、3Y聚為一類，而當(dāng)歐式距離到25時(shí)，所有樣品才聚在一起，說(shuō)明在整個(gè)發(fā)酵階段郫縣豆瓣的香氣成分差異性很大。圖2可以明顯看出，香氣物質(zhì)形成主要分為兩個(gè)階段，從制曲階段到后發(fā)酵前期的樣品聚為一大類，而后發(fā)酵中后期階段自成一類，說(shuō)明郫縣豆瓣在前發(fā)酵和后發(fā)酵階段香氣物質(zhì)的含量變化很大。

圖 2 郫縣豆瓣揮發(fā)性物質(zhì)聚類分析Fig. 2 Cluster analysis of volatile compounds of Pixian broad-bean paste

2.2 郫縣豆瓣香氣活性物質(zhì)的鑒定

在兩種提取方式得到的郫縣豆瓣揮發(fā)性物質(zhì)體系中，GC-O嗅聞結(jié)果總共檢出36 種香氣化合物，見(jiàn)表1、2。SE法、SPME法GC-O嗅聞分別得到18、21 種香氣化合物，為醛、醇、酮、酚、酯、吡嗪、吡咯類，其中醛類為最主要的香氣化合物。共同嗅聞到的物質(zhì)僅有2,3,5,6-四甲基吡嗪和4-乙基愈創(chuàng)木酚2 種。通過(guò)GC-O檢測(cè)出郫縣豆瓣中的香氣活性物質(zhì)共29 種，分為6 類，分別為：醬香、烤土豆類似香味；水果醇香；蜂蜜、甜香；類似大曲的霉味；苦辣刺激氣味；草木、煙熏、生青味。

表 1 郫縣豆瓣GC-O測(cè)定的香氣化合物（SE法萃?。㏕able 1 Important aroma compounds identified in Pixian broad-bean paste by SE-GC-O

表 2 郫縣豆瓣GC-O檢測(cè)到的香氣化合物（SPME法萃?。㏕able 2 Important aroma compounds identified in Pixian broad-bean paste by SPME-GC-O

2.3 郫縣豆瓣重要特征香氣化合物形成機(jī)理

在本課題組早前的研究中確定了11 種香氣物質(zhì)為郫縣豆瓣重要特征香氣化合物[14]，包括3-甲硫基丙醛、苯甲醛、異戊醇、2-乙?；量?、2,5-二甲基吡嗪、糠醛、2,3,5,6-四甲基吡嗪、苯乙醛、苯乙醇、2-乙基苯酚和4-乙基-2-甲氧基苯酚。在郫縣豆瓣的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，各類物質(zhì)含量變化與發(fā)酵階段的關(guān)系如圖3所示。

圖 3 郫縣豆瓣發(fā)酵全過(guò)程重要香氣化合物組成及含量Fig. 3 Changes in the composition and contents of important aroma compounds in Pixian broad-bean paste throughout the fermentation process

從圖3可知，椒醅中共檢出4 種關(guān)鍵香氣物質(zhì)：苯甲醛、異戊醇、2-乙基苯酚和4-乙基-2-甲氧基苯酚。

苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣，在郫縣豆瓣中表現(xiàn)出草木香氣、植物的生青味，在自然界中廣泛存在于植物中，在多種發(fā)酵糧食酒、果酒中均有檢出，同時(shí)在柿醋、棗醋、腌菜、豆醬以及酸肉、南京醬牛肉、火腿股二頭肌等產(chǎn)品中香氣成分分析時(shí)，也都檢測(cè)到苯乙醇的存在。苯乙醇是雜醇油的重要組分之一，部分微生物（如釀酒酵母、黑曲霉、白地霉等）可通過(guò)代謝生成苯乙醇，從而賦予發(fā)酵產(chǎn)品（如面包、干酪、酒和醬油等）香氣[15]。苯乙醇在郫縣豆瓣成曲中第1次檢出，制曲過(guò)程中米曲霉大量繁殖代謝，是苯乙醇的主要來(lái)源[16]。苯乙醛在郫縣豆瓣中表現(xiàn)為花香、甜香、蜂蜜香，與苯丙氨酸的代謝相關(guān)，也是郫縣豆瓣重要香氣化合物，其第1次檢出晚于苯乙醇，在甜瓣子發(fā)酵H2階段產(chǎn)生，這也符合苯乙醇與苯乙醛生成順序。

異戊醇的風(fēng)味特點(diǎn)為果香，略帶酸味，Yoshimoto等[17]認(rèn)為異戊醇、異丁醇、乙酸異戊酯是釀酒酵母發(fā)酵果酒中的重要香味物質(zhì)；Kang等[18]研究表明異戊醇由亮氨酸生成，并帶有香蕉果香，是韓國(guó)果酒和日本米酒里面的重要香味物質(zhì)；但Watanabe等[19]研究認(rèn)為過(guò)量的異戊醇使面包的風(fēng)味有不好的感受。成熟的郫縣豆瓣異戊醇的含量適中，對(duì)郫縣豆瓣的整體香氣貢獻(xiàn)顯著。

苯甲醛廣泛存在于植物中，特別是在薔薇科植物中，主要以苷的形式存在于植物的莖皮，葉或種子中，具有堅(jiān)果香味。本研究在蠶豆原料與辣椒醅中都檢出了苯甲醛，說(shuō)明蠶豆和辣椒中都含有苯甲醛。苯甲醛在風(fēng)味研究領(lǐng)域有著特殊的意義，Martres[20]首次從苦杏仁中提取并鑒定為香味物質(zhì)，后來(lái)被報(bào)道苯甲醛是日本和韓國(guó)醬油中的香氣活性物質(zhì)，其在霉菌發(fā)酵的食品中常被檢出，如腐乳、發(fā)酵干香腸和韓式豆醬等[21-23]。苯甲醛在郫縣豆瓣中呈現(xiàn)類似醬油的咸香、醬香，與壬醛、糠醛、3-甲硫基丙醛一起使郫縣豆瓣的醬香更加豐富。除原料帶入外，低分子質(zhì)量揮發(fā)醛的主要來(lái)源還有氨基酸降解和微生物的轉(zhuǎn)化，它們的閾值都比較低，能夠帶來(lái)清香、花果香和類似堅(jiān)果香的芳香特質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)各組檢出的支鏈醛主要是2-甲基丁醛和苯甲醛，它們可以由微生物利用支鏈氨基酸降解產(chǎn)物得到。在發(fā)酵過(guò)程中，苯甲醇、苯甲醛和苯甲酸等中間物質(zhì)被檢出，他們可能相互轉(zhuǎn)化。

糠醛在干蠶豆瓣中初次檢出，含量較低，糠醛在蠶豆瓣?duì)C漂后含量升高，其氣味描述為堅(jiān)果香味，但其氣味強(qiáng)度比苯甲醛較低。有研究報(bào)道糠醛來(lái)源于麥芽糖、乳糖等與氨基酸的熱反應(yīng)或糖類物質(zhì)的熱降解[24]，在制曲過(guò)程中持續(xù)檢出，保溫發(fā)酵期間沒(méi)有檢出，與董丹等[25]的研究結(jié)果一致。在保溫發(fā)酵H2～H3期間檢出了較高含量的糠醇，可能是此期間糠醛在微生物的作用下氧化反應(yīng)生成糠醇，部分糠醇進(jìn)一步被氧化為糠酸。后發(fā)酵期間隨著郫縣豆瓣中蔗糖被利用，轉(zhuǎn)化成糖醛、戊聚糖又再降解生成糠醛，所以隨著糠醛呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，減少的同時(shí)檢出糠醇下游產(chǎn)物5-甲基呋喃醛。

3-甲硫基丙醛具有醇厚的醬香和烤土豆香氣，也是郫縣豆瓣中醬香味的主要來(lái)源物質(zhì)，在韓式醬油、高鹽稀態(tài)醬油、酵母抽提物等的香氣物質(zhì)研究中被認(rèn)為是主要貢獻(xiàn)成分，然而，并非所有食品中的Strecker醛都為大家所喜聞樂(lè)見(jiàn)，有研究表明，3-甲硫基丙醛和苯乙醛在啤酒中的含量與其質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，隨啤酒貯藏期的延長(zhǎng)而有所增加，是啤酒老化風(fēng)味的來(lái)源之一[26]。3-甲硫基丙醛在甜瓣子發(fā)酵H3時(shí)期第1次檢出，可能來(lái)自甲硫氨酸的降解，也是發(fā)酵過(guò)程中蛋氨酸的Strecker降解產(chǎn)物，并可能進(jìn)一步在微生物的作用下轉(zhuǎn)化成3-甲硫基丙醇。

2-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚兩種酚類僅在椒醅原料中檢出，在蠶豆、制曲及甜瓣子中均沒(méi)有檢出，后發(fā)酵時(shí)期椒醅和甜瓣子混合后再次檢出，由此可知椒醅是酚類物質(zhì)的主要來(lái)源，并且在后發(fā)酵時(shí)會(huì)繼續(xù)生成。有報(bào)道在威士忌[27]、香草[28]、咖啡[29]里發(fā)現(xiàn)其具有木香、辛香、丁香香氣，其中4-乙基愈創(chuàng)木酚被認(rèn)為是日韓醬油誘人香味的重要貢獻(xiàn)物質(zhì)，并且其與酵母的代謝活動(dòng)有關(guān)[30]。

2,3,5,6-四甲基吡嗪的風(fēng)味描述是醬香味，在干蠶豆瓣中初次檢出，在H3時(shí)期第2次檢出，在甜瓣子發(fā)酵后期開(kāi)始逐漸積累在后發(fā)酵3 個(gè)月時(shí)含量到達(dá)峰值，隨后逐漸下降。說(shuō)明2,3,5,6-四甲基吡嗪開(kāi)始來(lái)源于蠶豆，隨后在發(fā)酵過(guò)程中可以由微生物作用產(chǎn)生和降解。吳建峰[31]認(rèn)為在白酒釀造中，細(xì)菌制曲階段所生成的4-甲基吡嗪是酒中4-甲基吡嗪的主要來(lái)源之一。Huang等[32]研究了葡萄糖氨基酸體系下二甲基吡嗪和三甲基吡嗪反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)2-甲基吡嗪和2,5-二甲基吡嗪是賴氨酸葡萄糖系統(tǒng)中兩種最豐富的生物堿。本研究在制曲階段到甜瓣子發(fā)酵2 個(gè)月期間并未檢出2,3,5,6-四甲基吡嗪，在郫縣豆瓣中制曲及甜瓣子階段的優(yōu)勢(shì)菌為米曲霉，細(xì)菌和酵母菌可能在這個(gè)階段被抑制，而在后發(fā)酵過(guò)程中逐漸積累，證實(shí)了細(xì)菌與四甲基吡嗪的緊密聯(lián)系。另外氨基酸在氨基酸脫氫酶的作用下脫氫生成氨，與3-羥基-2-丁酮通過(guò)縮合作用合成四甲基吡嗪。3-羥基-2-丁酮是2,3,5,6-四甲基吡嗪的主要上游基礎(chǔ)物質(zhì)，3-羥基丁酮主要由雙乙酰途徑獲得，雙乙酰是合成3-羥基丁酮和2, 3-丁二醇的前體物質(zhì)[33]。2,3-丁二醇在郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程中持續(xù)檢出且含量較高， Yaylayan等[34-35]通過(guò)研究碳標(biāo)記的葡萄糖和丙氨酸之間的熱反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)2,3-丁二酮來(lái)自于單一的葡萄糖降解途徑。2,3-丁二酮和3-羥基丁酮在蠶豆、制曲、甜瓣子發(fā)酵期間也不連續(xù)的檢出，為2,3,5,6-四甲基吡嗪的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。研究四甲基吡嗪生成途徑可為提高其含量提供參考。

2-乙酰基吡咯檢出于甜瓣子發(fā)酵前期，隨后其含量開(kāi)始逐漸降低，后發(fā)酵階段隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)含量逐漸增高，后發(fā)酵中后期含量增加較為明顯。Arsa等[36]研究酶水解米糠蛋白濃縮液發(fā)現(xiàn)2-乙?；量┦瞧渲幸环N重要風(fēng)味物質(zhì)，主要呈可可香、堅(jiān)果香。Jeong等[37]研究認(rèn)為2-乙酰基吡咯是韓國(guó)大醬的香氣活性物質(zhì)之一。

2.4 不同階段的郫縣豆瓣香氣相關(guān)性分析

2.4.1 郫縣豆瓣各發(fā)酵階段香氣主成分分析

表 3 總方差解釋Table 3 Total variance interpretation

對(duì)郫縣豆瓣不同階段11 種重要香氣成分進(jìn)行主成分分析。上表表明3 個(gè)主成分貢獻(xiàn)率達(dá)80.156%，即可以用這3 個(gè)主成分代替上述11 種重要香氣成分物質(zhì)對(duì)不同時(shí)期的豆瓣進(jìn)行區(qū)分。根據(jù)成分矩陣得：Z1=0.883X1＋0.832X2＋0.828X3＋0.802X4＋0.399X5＋0.337X6＋0.535X7－0.525X8＋ 0.206X9－0.080X10＋0.001X11；Z2=－0.189X1－0.109X2－0.181X3－0.031X4－0.208X5－0.216X6－0.099X7＋0.948X8＋ 0.852X9＋0.612X10－0.387X11；Z3=－0.161X1＋0.263X2＋0.428X3－0.375X4－0.334X5－0.305X6＋0.427X7＋0.005X8＋ 0.017X9＋0.408X10＋0.770X11。

由圖4可以看出，以主成分1（33.50%）和主成分2（23.83%）作得分散點(diǎn)圖能夠得到郫縣豆瓣不同發(fā)酵階段的樣品分布情況。在前發(fā)酵時(shí)期，甜瓣子發(fā)酵H1至H3期間每個(gè)樣品之間都有一定間距，說(shuō)明在甜瓣子發(fā)酵期間微生物持續(xù)頻繁的活動(dòng)，物質(zhì)反應(yīng)變化較快，所以香氣成分變化較大，3-甲硫基丙醛、吡嗪等香氣成分主要在此階段產(chǎn)生。后發(fā)酵階段3M和6M以及1Y之間距離最大，說(shuō)明后發(fā)酵3～12 個(gè)月階段郫縣豆瓣中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化最大。樣品2Y和3Y的間距相較1Y間距較小，說(shuō)明樣品2Y和3Y差異較小，即發(fā)酵后期，特征香氣成分趨于穩(wěn)定。

圖 4 郫縣豆瓣各發(fā)酵階段香氣主成分分析Fig. 4 Score scatter plot of principal component 1 versus 2 for aroma compounds in Pixian broad-bean paste

2.4.2 電子鼻分析不同發(fā)酵階段對(duì)郫縣豆瓣香氣物質(zhì)的貢獻(xiàn)性

線性判別式分析（linear discriminant analysis，LDA）是一種常用的多變量統(tǒng)計(jì)分類方法，該方法需要樣本空間呈正態(tài)分布，并有相等的離差。原始變量經(jīng)過(guò)線性組合后得到判別函數(shù)，從而壓縮空間維數(shù)，同時(shí)減少信息的丟失[38]。使用電子鼻對(duì)樣品Q1、Q2、H1、H2、H3、3M、6M、1Y、2Y、3Y進(jìn)行測(cè)定，并作LDA圖。

圖 5 發(fā)酵全過(guò)程樣品電子鼻區(qū)分的LDA圖Fig. 5 LDA plot of samples distinguished by electronic nose

由圖5可知，第1主成分和第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為75.34%和17.86%。制曲階段的樣品存在明顯的重復(fù)區(qū)域，說(shuō)明制曲階段樣品的比較接近。后發(fā)酵3 個(gè)月和發(fā)酵6 個(gè)月的樣品在第1主成分上有區(qū)別，但在第2主成分上表現(xiàn)出相似性。后發(fā)酵6 個(gè)月的樣品與發(fā)酵12 個(gè)月的樣品在第1主成分和第2主成分上都存在十分明顯的區(qū)別。這也表明，郫縣豆瓣從后發(fā)酵開(kāi)始到后發(fā)酵6 個(gè)月的香氣成分持續(xù)變化，在發(fā)酵6 個(gè)月到12 個(gè)月開(kāi)始揮發(fā)性物質(zhì)出現(xiàn)顯著的變化。后發(fā)酵12 個(gè)月、后發(fā)酵24 個(gè)月的樣品相對(duì)獨(dú)立且與發(fā)酵前期的樣品存在明顯的差異。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)郫縣豆瓣原料到后發(fā)酵3 a期間的13 個(gè)樣品進(jìn)行了揮發(fā)性成分測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)郫縣豆瓣的發(fā)酵過(guò)程中，總體風(fēng)味物質(zhì)呈先增加后減少的趨勢(shì)，醛類物質(zhì)在甜瓣子發(fā)酵過(guò)程中大量產(chǎn)生，發(fā)酵過(guò)程中醇類、醛類、酯類呈先增加后減少的趨勢(shì)，其他類物質(zhì)沒(méi)有明顯變化規(guī)律。

本實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充了苯甲醛的天然來(lái)源，即蠶豆與辣椒。同時(shí)苯甲醛可以由微生物利用支鏈氨基酸降解得到。2-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚的主要來(lái)源是椒醅，并認(rèn)為與酵母的代謝活動(dòng)有關(guān)?？啡┑闹饕铣赏緩绞钦崽寝D(zhuǎn)化成糖醛、戊聚糖，再降解生成糠醛。3-甲硫基丙醛可能來(lái)自甲硫氨酸的Strecker降解，并可能進(jìn)一步在微生物的作用下轉(zhuǎn)化成3-甲硫基丙醇。苯乙醇主要通過(guò)微生物代謝產(chǎn)生。2,3,5,6-四甲基吡嗪在干蠶豆瓣中初次檢出，第2次檢出是在H3時(shí)期，2,3,5,6-四甲基吡嗪的來(lái)源是蠶豆原料及生物途徑代謝產(chǎn)生。

利用電子鼻探討發(fā)酵過(guò)程中各階段對(duì)郫縣豆瓣香氣物質(zhì)的貢獻(xiàn)性發(fā)現(xiàn)：制曲階段對(duì)香氣貢獻(xiàn)最小，甜瓣子期間香氣積累較多，但因?yàn)楹蟀l(fā)酵時(shí)混合大量椒醅導(dǎo)致貢獻(xiàn)率下降，椒醅對(duì)發(fā)酵前期香氣貢獻(xiàn)較大，郫縣豆瓣在后發(fā)酵開(kāi)始到后發(fā)酵6 個(gè)月的香氣成分變化明顯，在發(fā)酵6～12 個(gè)月，香氣成分出現(xiàn)顯著的變化。

本研究針對(duì)郫縣豆瓣整個(gè)發(fā)酵階段的香氣成分的規(guī)律進(jìn)行詳細(xì)分析，同時(shí)對(duì)某些特征香氣成分的合成機(jī)理進(jìn)行探究，但是某些特征香氣成分的形成機(jī)制還有待后續(xù)進(jìn)一步研究論證。