王 歡，席德州，黃永光,，曹文濤，尤小龍，程平言，胡

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州茅臺酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 習(xí)水 564622）

醬香型白酒是中國最傳統(tǒng)、最古老的三大香型白酒之一，也是華夏民族典型的發(fā)酵食品之一，以茅臺酒為代表，其他名優(yōu)酒有習(xí)酒、郎酒等。其酒體風(fēng)格特征為“無色（或微黃）透明，醬香突出，幽雅細(xì)膩，醇厚協(xié)調(diào)，回味悠長，空杯留香持久”[1]。其獨(dú)特的釀造工藝可概括為“高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、生產(chǎn)周期長、貯存時(shí)間長、用曲量大、多輪次（發(fā)酵）取酒”[2]。其中，高溫堆積發(fā)酵是醬香型白酒獨(dú)特的生產(chǎn)工序之一，也是其釀造工藝中最難掌控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具有“次制曲”之說[3]。堆積發(fā)酵過程可自然網(wǎng)羅、富集釀造環(huán)境中的微生物，形成獨(dú)特的微生物菌群結(jié)構(gòu)，其過程所富集的微生物菌群代謝產(chǎn)生豐富多的發(fā)酵酶類、風(fēng)味物質(zhì)對后期酒體醬香風(fēng)味的形成具有重要作用[1]， 同時(shí)也為下一步窖池發(fā)酵提供充足的微生物儲備[4-5]。其過程的菌群結(jié)構(gòu)包括酵母菌、細(xì)菌、放線菌和霉菌等。其中，細(xì)菌是醬香型白酒釀造過程中重要的產(chǎn)香功能微生物，能夠分泌代謝降解蛋白質(zhì)及淀粉的水解酶類，對酒體的風(fēng)味質(zhì)量有著極大貢獻(xiàn)和關(guān)鍵調(diào)控作用[4]。因，系統(tǒng)研究釀造過程的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及其演替規(guī)律是科學(xué)認(rèn)識和揭示其釀造品質(zhì)的關(guān)鍵。

近年，蓬勃發(fā)展的高通量測序及其數(shù)理分析研究[6]為深入探索、解析復(fù)雜發(fā)酵體系的微生物菌群組成和結(jié)構(gòu)提供了有效手段[7-10]。黃蘊(yùn)利等[11]利用高通量測序研究了醬香型白酒傳統(tǒng)釀造過程發(fā)酵酒醅中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)堆積酒醅中的優(yōu)勢細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬和乳桿菌屬。郭敏等[12]運(yùn)用高通量測序技術(shù)對醬香型白酒傳統(tǒng)釀造過程發(fā)酵酒醅的微生物菌群結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了研究，揭示了發(fā)酵過程優(yōu)勢菌屬與產(chǎn)酒之間的機(jī)制。李欣等[13]通過高通量測序技術(shù)對醬香型白酒傳統(tǒng)釀造不同發(fā)酵階段的優(yōu)勢菌屬進(jìn)行研究，揭示了優(yōu)勢菌屬對醬香型白酒生產(chǎn)的功能作用。但上述研究主要集中在于單一輪次或傳統(tǒng)釀造過程中菌群結(jié)構(gòu)的研究，缺乏對整個(gè)輪次堆積發(fā)酵全過程系統(tǒng)性的研究和解析，也缺乏對各輪次微生物結(jié)構(gòu)之間多性、異同性的系統(tǒng)分析。隨著濃香白酒領(lǐng)域的洋河[14]、今世緣的高度機(jī)械化[15]，清香型的勁酒機(jī)械化快速發(fā)展[16]，在傳統(tǒng)白酒行業(yè)掀起了新的機(jī)械化創(chuàng)新發(fā)展。機(jī)械化釀造不但可降低傳統(tǒng)模式的勞動強(qiáng)度，還可提升釀造質(zhì)量的穩(wěn)定性和可控性。

為揭示機(jī)械化釀造過程中不同輪次堆積發(fā)酵微生物菌群結(jié)構(gòu)的多性、差異性，利用高通量測序及其數(shù)理分析，對醬香型白酒機(jī)械化釀造不同輪次堆積發(fā)酵酒醅中的微生物菌群結(jié)構(gòu)及其多性等進(jìn)行系統(tǒng)研究，為機(jī)械化釀造醬香型白酒的發(fā)展和工藝優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DNA試劑盒 美國Omega BioTek公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增引物 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；E002092超凈工作臺 蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；渦旋振蕩器 北京同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；PCR儀 美國伯公司； 電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

圖 1 堆積酒醅取樣Fig. 1 Sampling points for stacking fermented grains

1.3.3 PCR擴(kuò)增及凝膠電泳

細(xì) 菌 P C R 擴(kuò) 增 引 物 ： 3 3 8 F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）；PCR體系：10h Buffer 2 mL，dNTPs 2 μL，正反引物各0.8 μL，rTaq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.2 μL，總計(jì)20 μL反應(yīng)體系。PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，29 個(gè)循環(huán)；72 ℃再 延伸10 min。

凝膠電泳： 1 % 瓊脂糖凝膠， 核酸染料（Gengreen），電壓90 V，電泳時(shí)間40 min。

1.3.4 高通量測序

采用Illumina高通量測序技術(shù)，基于Illumina MiSeq測序平臺，分別對細(xì)菌V4高變區(qū)序列進(jìn)行測序分析（由專業(yè)檢測公司完成）。

1.3.5 理化指標(biāo)的測定

水分測定采用135 ℃的烘干法；酸度測定采用酸堿滴定法；淀粉、還原糖檢測采用斐林試劑法。具體參照DB 34/T 2264ü 2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》[17]。

1.3.6 機(jī)械化釀造工藝

本機(jī)械化釀造工藝流程與傳統(tǒng)釀造工藝流程相同，主要是在釀造過程采用機(jī)械化代替人工操作，具體概述如下：應(yīng)用潤糧設(shè)備代替人工潤糧，采取三段式潤糧，控制每段的潤糧時(shí)間、水分和溫度；蒸糧蒸酒采用機(jī)械設(shè)備自動上甄，上甄下料采用垂直式下料、紅外感應(yīng)見汽下料，做到疏、松、勻、薄、輕、平等要求；攤涼、下曲、拌勻、運(yùn)醅均為一體式機(jī)械設(shè)備，在線風(fēng)冷攤涼、自動計(jì)量下曲、絞龍拌勻、傳送帶運(yùn)醅，按工藝參數(shù)控制過程工藝參數(shù)，嚴(yán)格模擬傳統(tǒng)釀造工藝要求；堆積采用垂直式、轉(zhuǎn)盤設(shè)備下醅、堆積，地面堆積，參數(shù)控制按傳統(tǒng)工藝執(zhí)行；下窖、起窖采用傳統(tǒng)釀造的行車、抱斗，工藝操作和控制嚴(yán)格執(zhí)行傳統(tǒng)工藝要求。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)和分析?；贗llumina MiSeq測序平臺，群落組成圖、Heatmap圖、冗余分析圖利用R語言工具，物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用Cytoscape軟件，豐度圖利用Origin軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多性

圖 2 酒醅樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（門水平）Fig. 2 Bacterial community structure of fermented grain samples at phylum level

圖 3 酒醅樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（屬水平）Fig. 3 Bacterial community structure of fermented grain samples at genus level

如圖3所示，在屬水平上，不同輪次機(jī)械化釀造堆積發(fā)酵酒醅中的細(xì)菌菌群在數(shù)量及結(jié)構(gòu)分布上多性特征明顯，但菌群的屬類種別基本一致，1輪次共檢測出130 個(gè)屬，2輪次126 個(gè)屬，3輪次129 個(gè)屬，4輪次119 個(gè)屬，5輪次125 個(gè)屬，6輪次164 個(gè)屬，7輪次136 個(gè)屬。1輪次的菌屬分布較均勻，相對豐度大于1%的有10 個(gè)屬，包括Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Pediococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella，其中以前5 種為主（總相對豐度為84.74%）。從2輪次開始，Acinetobacter的相對豐度均大于50%，成為主導(dǎo)菌屬。其中，2輪次的菌群多性有所降低，共6 個(gè)屬的相對豐度大于1%，包括Acinetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus和Thermoactinomyces。3、4、5輪次的產(chǎn)酒酒質(zhì)最好，出酒率也高，被稱為“大回酒”[19]，且4、5輪次香氣特征較為相似，圖3 表明其菌群結(jié)構(gòu)也較相似。其中，3輪次有9 個(gè)屬相對豐度大于1%，主要是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Sphingomonas和Thermoactinomyces。4輪次有9 個(gè)屬相對豐度大于1%，以Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Rhodococcus、Sphingomonas和Thermoactinomyces為主。5輪次相對豐度大于1%的有8 個(gè)屬，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus和Sphingomonas。6、7輪次的菌群結(jié)構(gòu)也相似，6輪次有9 個(gè)屬相對豐度大于1%，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Rhodococcus和Sphingomonas；7輪次共有8 個(gè)相對豐度大于1%的屬，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus和Sphingomonas。機(jī)械化釀造各個(gè)輪次堆積酒醅中的共有優(yōu)勢菌屬主要為Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia，這些菌屬在部分輪次中的相對豐度都在5%以上。上述結(jié)論表明，在醬香型白酒機(jī)械化釀造的各輪次之間參與堆積發(fā)酵并富集的微生物菌群結(jié)構(gòu)多性特征非常明顯，其各輪次的菌群結(jié)構(gòu)共性特征顯著性大于差異性，說明各輪次釀造的釀酒微生物穩(wěn)定性較好，也表征了醬香型白酒釀造過程存在固有的特征性菌群結(jié)構(gòu)。

2.2 核心微生物菌群及其功能

研究表明[20-22]，平均相對豐度大于1%且至少出現(xiàn)在一個(gè)品以上的菌屬被定義為核心微生物屬。本研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械化釀造不同輪次堆積發(fā)酵酒醅中的細(xì)菌平均豐度大于1%且至少出現(xiàn)在1 個(gè)品以上的屬有12 個(gè)，分別是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Pediococcus、Rhodococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella。如圖4所示，該12 個(gè)菌屬1～7輪次總相對豐度分別為97.98%、97.82%、97.20%、98.28%、97.52%、95.57%、95.51%，說明這12 個(gè)菌屬一直穩(wěn)定存在于醬香型白酒機(jī)械化釀造的堆積發(fā)酵過程，而且成為主導(dǎo)性菌群結(jié)構(gòu)，可將其認(rèn)為是機(jī)械化釀造堆積發(fā)酵過程的核心微生物結(jié)構(gòu)菌群。其中，Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia在7 個(gè)輪次中的相對豐度均大于1%，且后4 種（Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia）為傳統(tǒng)釀造酒醅中的優(yōu)勢菌群和功能菌群，對酒體醬香風(fēng)味的形成具有重要貢獻(xiàn)[23]。

圖 4 酒醅樣品中的核心細(xì)菌群落豐度圖（屬水平）Fig. 4 Abundance of core bacterial community in fermented grain samples at genus level

如圖4所示，Acinetobacter在1～7輪次機(jī)械化釀造堆積發(fā)酵酒醅中均為絕對優(yōu)勢菌屬，但1輪次中的Acinetobacter含量較其余幾個(gè)輪次少，而在4、5輪次發(fā)酵酒醅中的豐度含量最高，可能的原因是1輪次釀造正處于寒冬季節(jié)，環(huán)境溫度較低，微生物生長較緩慢，而4、5輪次生產(chǎn)恰逢5、6月份，較高的環(huán)境溫度與空氣濕度為其提供了良好的生長條件。Acinetobacter主要來源于釀酒環(huán)境的空氣[24]和生產(chǎn)用大曲[25]，是一種釀造環(huán)境優(yōu)勢細(xì)菌。該菌屬也在傳統(tǒng)釀造堆積發(fā)酵酒醅中檢出，郭敏等[12]發(fā)現(xiàn)其在第7輪次發(fā)酵中的豐度較高（13.26%），在2、3輪次中其豐度則低于1%。該菌屬成為機(jī)械化釀造堆積發(fā)酵中的絕對優(yōu)勢菌屬，其可能源于機(jī)械攪拌增加了發(fā)酵酒醅的破碎率，再加上機(jī)械化堆積過程酒醅的堆料方式導(dǎo)致酒醅的緊密度過高，致使堆積酒醅間的氧容量降低，進(jìn)而為Acinetobacter提供了良好的生長環(huán)境[26-27]，該菌屬的多數(shù)菌在白酒釀造過程主要利用糖類物質(zhì)產(chǎn)酸，改善發(fā)酵環(huán)境的酸度[28]。Bacillus在1～3輪次中豐度較高（圖4），研究表明[4]其也是大曲中的優(yōu)勢菌群，是醬香白酒醬香風(fēng)味物質(zhì)形成的主要代謝貢獻(xiàn)菌群，能產(chǎn)生蛋白酶與淀粉酶等水解酶類，其水解原料形成豐富的發(fā)酵前體物質(zhì)，有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成。Pediococcus、Lactobacillus與Weissella屬于乳酸菌菌系，乳酸菌大多是兼性厭氧或厭氧菌[29]，在發(fā)酵過程具有重要的生物學(xué)結(jié)構(gòu)調(diào)控功能[30]。在中國白酒釀造發(fā)酵體系中，乳酸菌主要代謝產(chǎn)乳酸，乳酸可與發(fā)酵體系中的其他代謝產(chǎn)物發(fā)生生化反應(yīng)合成多種呈香、呈味物質(zhì)，如乳酸乙酯等[31]。同時(shí)，乳酸菌還可促進(jìn)發(fā)酵過程的美拉德反應(yīng)，增加酒體中的呈香物質(zhì)；乳酸菌代謝產(chǎn)生的各種有機(jī)酸還可維持酸性發(fā)酵環(huán)境，調(diào)控發(fā)酵體系中微生物結(jié)構(gòu)間的平衡關(guān)系。乳酸桿菌也可利用霉菌等微生物代謝生成的朊、胨和多肽類物質(zhì)形成氨基酸[32]，氨基酸進(jìn)一步代謝產(chǎn)生酒體中的風(fēng)味物質(zhì)，對醬香風(fēng)格的形成有重要貢獻(xiàn)。Kroppenstedtia和Lentibacillus均被發(fā)現(xiàn)存在于大曲中，其在白酒生產(chǎn)中的具體作用尚不明確。Kroppenstedtia是1輪次中的優(yōu)勢菌屬（圖4），姚粟等[33]發(fā)現(xiàn)其也是高溫大曲中細(xì)菌Firmicutes的第2優(yōu)勢菌屬，且是一種嗜熱菌屬。Thermoactinomyces也是大曲中的優(yōu)勢菌屬[33]，其在1～7輪次機(jī)械化釀造堆積發(fā)酵酒醅中的豐度含量隨著輪次的增加而減少（圖4），在5～7輪次中豐度低于1%，李豆南等[34]發(fā)現(xiàn)，該菌屬可產(chǎn)生吡嗪和芳香類物質(zhì)，對醬香型白酒的風(fēng)味具有重要的作用。劉洋等[35]發(fā)現(xiàn)該菌屬發(fā)酵代謝產(chǎn)堿性磷酸酶、酯酶、脂質(zhì)酯酶和萘酚AS-BI磷酸水解酶，還具有糖化力、液化力和較高的蛋白質(zhì)分解力，可降解釀酒原料中的淀粉、蛋白等生成香味物質(zhì)。圖4表明，Sphingomonas在機(jī)械化釀造堆積發(fā)酵過程隨發(fā)酵輪次遞增，豐度呈現(xiàn)一致的增加趨勢。同時(shí)，該菌屬能夠降解芳香類化合物和產(chǎn)生多糖類物質(zhì)[36]，還具有較強(qiáng)的產(chǎn)輔酶Q能力[29]，該菌屬也存在于傳統(tǒng)釀造堆積發(fā)酵的部分輪次中[37]。在機(jī)械化釀造中還檢測到大量的Caulobacter，該菌屬在1、2輪次中豐度含量較低，6、7輪次中含量最高，其在傳統(tǒng)釀造堆積發(fā)酵酒醅中鮮見報(bào)道，是機(jī)械化釀造過程中的特有菌屬，可能來源于機(jī)械設(shè)備和環(huán)境，在白酒發(fā)酵過程中的作用還有待進(jìn)一步研究。Rhodococcus在整個(gè)群落結(jié)構(gòu)中所占比例很小（圖4），是一類可以從土壤等環(huán)境中分離獲得的革蘭氏陽性菌，屬于Actinobacteria，可分泌大量的活性酶，能夠充分利用有機(jī)化合物作為能源和碳源，對石油烴、有機(jī)腈和霉菌毒等具有降解 作用[38]，且具有降解白酒釀造廢水的功能[39]。華茍 根等[40]等發(fā)現(xiàn)Rhodococcus屬的fascians可降解檸檬苦，增加苦味果汁的香氣。該菌屬在傳統(tǒng)釀造堆積發(fā)酵酒醅中鮮見報(bào)道，在白酒中的功能還有待進(jìn)一步研究。上述結(jié)論表明，在機(jī)械化釀造堆積發(fā)酵過程其核心菌群結(jié)構(gòu)相對性穩(wěn)定程度高，對堆積發(fā)酵整體菌群結(jié)構(gòu)的變化調(diào)控功能明顯，這也是醬香型白酒釀造過程需要堆積發(fā)酵的必要，為下一步窖池發(fā)酵的微生物多性和穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)研究提供參考依據(jù)，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的前提條件。

2.3 核心微生物的相互作用

圖 5 酒醅樣品中的核心細(xì)菌群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（屬水平）Fig. 5 Network of core bacterial community in fermented grain samples at genus level

為深入挖掘特定環(huán)境中復(fù)雜微生物群落物種之間相關(guān)性，系統(tǒng)認(rèn)識核心微生物菌群之間的相互關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制，將12 個(gè)核心細(xì)菌屬進(jìn)行物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析。如圖5A所示，12 個(gè)核心細(xì)菌屬之間具有極其復(fù)雜的相互生物學(xué)作用，這些復(fù)雜的共生關(guān)系和拮抗關(guān)系形成了穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)，這也是發(fā)酵過程微生物菌群穩(wěn)定性和演替的內(nèi)在調(diào)控動力和機(jī)制。Bacillus、Lactobacillus、Thermoactinomyces、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Weissella、Pediococcus和Oceanobacillus屬于Firmicutes，它們之間絕大部分呈現(xiàn)共生關(guān)系 （圖5B）。其中，Bacillus與Thermoactinomyces極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Kroppenstedtia與Lentibacillus極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。Pediococcus與Thermoactinomyces顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Weissella與Thermoactinomyces、Lentibacillus顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Acinetobacter、Caulobacter和Sphingomonas屬于Proteobacteria，Rhodococcu屬于Actinobacteria，從圖5C可知，該3 個(gè)菌屬和其他9 個(gè)基本都呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。其中，Acinetobacter與Kroppenstedtia顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Caulobacter與Thermoactinomyces和Weissella顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Thermoactinomyces與Sphingomonas和Pediococcus極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與Bacillus顯著負(fù)相關(guān) （P＜0.05）；Rhodococcus與Weissella極顯著負(fù)相關(guān) （P＜0.01）。Caulobacter與Rhodococcus和Sphingomonas極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。從核心菌屬之間的相關(guān)性結(jié)果表明，在堆積發(fā)酵的菌群多性復(fù)雜體系中，正是因?yàn)楹诵木褐g形成的共生、拮抗等生物學(xué)關(guān)系，才構(gòu)成了復(fù)雜體系中的協(xié)同共生關(guān)系，維持整個(gè)發(fā)酵體系的正常、穩(wěn)態(tài)發(fā)展，推進(jìn)釀造進(jìn)程沿襲乙醇發(fā)酵和風(fēng)味富集方向發(fā)展。

2.4 環(huán)境因子對核心細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

圖 6 環(huán)境因子對核心細(xì)菌群落的影響Fig. 6 Effects of environmental factors on core bacterial communities

圖 7 核心細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性HeatmapFig. 7 Heatmap for the correlation between core bacterial communities and environmental factors

核心微生物受環(huán)境因子影響也較大，如圖7 所示，Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus和Weissella均與淀粉含量顯著正相關(guān)（R分別為0.929、1、0.786、0.786），且Bacillus與淀粉含量極顯著正相關(guān) （P＜0.01），Thermoactinomyces與淀粉含量高度顯著正相關(guān)（P＜0.001）。這主要因?yàn)锽acillus能產(chǎn)生蛋白酶與淀粉酶等水解酶類，水解原料形成豐富的發(fā)酵前體物質(zhì)[4]，而Thermoactinomyces具有糖化力、液化力和較高的蛋白質(zhì)分解力，可降解釀酒原料中的淀粉、蛋白等生成香味物質(zhì)[34]。Caulobacter與淀粉含量顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05，R=0.821）、Sphingomonas與淀粉含量極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01，R=0.929），因?yàn)镾phingomonas降解芳香類化合物；Caulobacter可能來源于機(jī)械設(shè)備或環(huán)境。還原糖含量對核心微生物沒有影響。Caulobacter和Sphingomonas與水分顯著正相關(guān)（R分別為0.857、0.964），其中Sphingomonas高度正相關(guān) （P＜0.001），而Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus與水分顯著負(fù)相關(guān)（R分別為0.857、0.964、0.893），且Thermoactinomyces和Pediococcus極顯著和高度負(fù)相關(guān)（P ＜0.0 1，P ＜0.0 0 1）。Sphingomonas與酸度顯著正相關(guān)（P＜0.05，R=0.857），而Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus與酸度顯著負(fù)相關(guān)（R分別為0.857、0.857、0.929），且Pediococcus極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），這說明酸度高、水分大會抑制大部分微生物的生長，不利于發(fā)酵的進(jìn)行，因在生產(chǎn)上要控制Sphingomonas的生長。上述結(jié)果表明，在機(jī)械化釀造堆積發(fā)酵過程，環(huán)境因子水分、淀粉含量和酸度與核心細(xì)菌菌群中的菌屬之間具有密切的相關(guān)性，表明堆積發(fā)酵過程水分、淀粉含量和酸度對微生物生長具有緊密的調(diào)控作用，共同形成推動發(fā)酵過程的微生物菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)釀造發(fā)酵的正常進(jìn)行。

3 結(jié) 論

本研究利用高通量測序及數(shù)理分析方法系統(tǒng)性研究醬香型白酒機(jī)械化釀造不同輪次堆積發(fā)酵酒醅中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)特征，7 個(gè)輪次中共檢測出14 個(gè)門，456 個(gè)屬，優(yōu)勢菌門為Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes；在屬水平上，不同輪次堆積發(fā)酵酒醅中的細(xì)菌菌群在數(shù)量及結(jié)構(gòu)分布上多性特征明顯，且主要核心菌群種類基本一致。根據(jù)各菌群豐度將12 種菌群定義為醬香白酒機(jī)械化釀造的核心細(xì)菌屬，分別是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Pediococcus、Rhodococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella。核心微生物菌群之間的物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，Bacillus、Lactobacillus和Sphingomonas在醬香型白酒機(jī)械化釀造各輪次發(fā)酵過程堆積發(fā)酵核心微生物菌群中具有重要的生物學(xué)調(diào)控作用；Caulobacter與大部分核心微生物存在拮抗作用，Oceanobacillus與大部分核心菌屬屬于共生關(guān)系。堆積發(fā)酵過程的環(huán)境因子中，水分、酸度、淀粉含量對微生物群落結(jié)構(gòu)影響較大，產(chǎn)生了重要的調(diào)控作用，其中Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus與淀粉含量顯著正相關(guān)，與水分、酸度顯著負(fù)相關(guān)；Caulobacter、Sphingomonas與淀粉含量顯著負(fù)相關(guān)，與水分含量顯著正相關(guān)，Sphingomonas還與酒醅酸度顯著正相關(guān)。本研究為推進(jìn)醬香型白酒機(jī)械化釀造發(fā)展提供了基礎(chǔ)理論和學(xué)科依據(jù)。