馮 杰，馮 娜，劉艷芳，唐慶九，周 帥，劉 方，張勁松，楊 焱

（農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403）

竹蓀又名竹笙、竹參，在真菌分類學(xué)上隸屬于真菌界（Eumycotina）、擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、腹菌綱（Gasteromycetes）、鬼筆目（Phallales）、鬼筆科（Phallaceae）、竹蓀屬（Dictyophora）[1-2]。竹蓀具有一定的防腐作用，具有較高的營養(yǎng)保健價值，被人們譽為“真菌皇后”，是一種集營養(yǎng)、保健、理療于一身的綠色食品。竹蓀子實體中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生、微量元等，具有抗腫瘤、抗菌、抗血栓、降血脂、增強人體免疫力等生物活性。

竹蓀多糖是竹蓀中的主要生物活性成分之一，目前關(guān)于竹蓀多糖結(jié)構(gòu)的研究，多數(shù)還都只是停留在竹蓀多糖組成上，對其分子結(jié)構(gòu)及構(gòu)象的研究報道較少，有研究者做過竹蓀多糖鏈的一級結(jié)構(gòu)研究[3]。趙凱等[4]研究了竹蓀多糖提取物，得到的竹蓀多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)主要是β-甘露糖；而連賓等[5]從竹蓀中提取的多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)為半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖雜多糖。王家堂等[6]所用的方法則與上述有所不同，其采用衍生化后通過氣相分析、紅外圖分析和核磁共振分析方法證明出：竹蓀多糖以葡萄糖為主，并同時含有半乳糖和甘露糖，為均一的多糖組分，分子構(gòu)型為β型，且竹蓀多糖也是以β-(1,3)-D-葡聚糖為主鏈，帶有(1,6)葡萄糖支鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

竹蓀子實體人工栽培周期長且容易污染雜菌，受病蟲害侵蝕，耗費人力多、場地大，栽培環(huán)境受海拔與溫度影響十分明顯，生產(chǎn)規(guī)模受到一定限制[7-8]。 而深層發(fā)酵技術(shù)是較為先進的技術(shù)，其特點是發(fā)酵周期短、勞動生產(chǎn)率高、勞動強度低、占地面積少等[9]。采用深層發(fā)酵技術(shù)直接生產(chǎn)竹蓀營養(yǎng)菌絲體，可以克服上述不足，不僅可將獲得的菌絲體作為液體菌種或食品添加劑，還可從中提取生理活性物質(zhì)，這為竹蓀生產(chǎn)及深加工開創(chuàng)了新路[10-11]。

目前國內(nèi)外關(guān)于深層發(fā)酵竹蓀菌絲體及發(fā)酵液多糖的研究報道較少，較多為對其抗氧化性能與抗菌性的檢測，或是對其氨基酸含量的分析與自由基清除能力的檢驗[12-13]。國內(nèi)外也有少量研究者對竹蓀的深層發(fā)酵進行研究，但其主要側(cè)重點是如何獲取更高的生物量[14-15]。只有少部分研究者關(guān)注竹蓀的功效成分多糖，但往往都僅局限于小試的搖瓶實驗，屬于基礎(chǔ)研究階段，并且其生物量和活性產(chǎn)物多糖得率比較低，生產(chǎn)成本高，其工藝需進一步提升，若要達到規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)竹蓀多糖還需進行大量的研究[16-17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

供試菌株Dictyophora indusiata ZS03，由中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心上海食用菌分中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面和平板培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基）購自美國BD公司，按照39 g溶于1 000 mL蒸餾水的比例配制，121 ℃滅菌20 min 后備用。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉1.5 g/L，磷酸氫鉀2 g/L，硫酸鎂2 g/L，121 ℃條件下滅菌30 min后備用。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉1.5 g/L，磷酸氫鉀2 g/L，硫酸鎂2 g/L，121 ℃條件下滅菌30 min后備用。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-2102雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；BIOTECH-5BGZ-50JS 5 L和50 L發(fā) 酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

菌株活化：將配制好的平板培養(yǎng)基于121 ℃條件下滅菌20 min后倒入9 cm平板冷卻備用。在無菌條件下挑取冷凍管保藏菌種于平板培養(yǎng)基中，在26 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后備用。

種子液培養(yǎng)：將平板活化后的菌株取3 塊約0.2 cm2大小的菌塊接種于裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三瓶中，在搖床上于26 ℃、150 r/min培養(yǎng)7 d得種子液。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：將制備好的液體菌種分別轉(zhuǎn)接至5、30 L和50 L發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液量為總體積的70%，接種量10%（V/V），攪拌轉(zhuǎn)速100 r/min，培養(yǎng)溫度26 ℃，通氣比1.0 L/（Lg min），培養(yǎng)至144 h 結(jié)束發(fā)酵。

1.3.2 指標(biāo)測定

菌絲體干質(zhì)量的測定：取發(fā)酵液50 mL，15 000h g離心20 min后棄上清液，沉淀的菌絲體用去離子水洗滌 3 次，收集菌絲體后放在60 ℃的烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，精確稱質(zhì)量[18]，以g/L計。每組實驗設(shè)定3 個平行，測定平均值。

總糖的測定：將烘干后的竹蓀菌絲體研磨成粉末，稱取100 mg加入100 mL蒸餾水，沸水浴提取3 h。冷卻后定容至100 mL，將溶液15 000h g離心15 min后取上清液備用[10]。取稀釋一定倍數(shù)的上清液品1 mL到試管中（設(shè)3 個重復(fù)），加入5%苯酚（重蒸苯酚）0.5 mL，混勻，再加入2.5 mL濃硫酸，振蕩，沸水浴中加熱15 min后在冷水下迅速冷卻，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計出總糖含量[11]，總糖含量以占干菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)計（%）。

還原糖的測定：將總糖測定時制備的上清液稀釋一定倍數(shù)，取稀釋后的品液2 mL到試管中（設(shè)3 個重復(fù)），加入3 mL 3,5-硝基水楊酸試劑，混勻，沸水浴中加熱5 min，流動水冷卻后用蒸餾水定容至25 mL，搖勻后用酶標(biāo)儀在520 nm波長處檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計出還原糖含量[20]，還原糖含量以占干菌絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)計（%）。

1.3.3 工藝優(yōu)化

1.3.3.1 竹蓀多糖發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源和氮源種類的篩選

碳源的篩選：在供試基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別添加 30 g/L葡萄糖、30 g/L蔗糖和30 g/L麥芽糖為碳源?；A(chǔ)培養(yǎng)基選用酵母粉1.5 g/L、磷酸氫鉀2 g/L、硫酸鎂2 g/L，研究不同碳源對竹蓀胞內(nèi)多糖發(fā)酵的影響。各實驗設(shè)3 個重復(fù)。

氮源的篩選：在供試基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別添加1.5 g/L酵母粉、1.5 g/L玉米粉和1.5 g/L黃豆粉為氮源?；A(chǔ)培養(yǎng)基選用葡萄糖30 g/L、磷酸氫鉀2 g/L、硫酸鎂2 g/L，研究不同氮源對竹蓀胞內(nèi)多糖發(fā)酵的影響。各實驗設(shè)3 個重復(fù)。

根據(jù)上述培養(yǎng)基中碳源和氮源種類篩選結(jié)果，選擇最佳碳源中的葡萄糖和氮源中的酵母粉用量2 個因，分別考察每種因在4 個水平下的竹蓀胞內(nèi)多糖得率，因與水平設(shè)計如表1所示。

表 1 竹蓀多糖培養(yǎng)基中碳源和氮源單因素篩選Table 1 Levels of carbon and nitrogen sources used in one-factor-at-a-time design

1.3.3.3 Box-Behnken法優(yōu)化竹蓀多糖發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計

表 2 Box-Behnken法優(yōu)化竹蓀多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的因素與水平Table 2 Codes and levels of independent variables used in Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)與圖像處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2013軟件進行處理，應(yīng)用Origin 8.5軟件進行繪圖，應(yīng)用DPS v7.05軟件進行顯著性分析，利用Design Expert V8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹蓀多糖發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源和氮源種類的篩選

圖 1 發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源和氮源種類對竹蓀菌絲體和胞內(nèi)多糖發(fā)酵的影響Fig. 1 Effects of carbon and nitrogen sources on mycelial biomass and polysaccharide production by D. indusiata

由圖1可以看出，碳源種類對竹蓀菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵菌絲體和胞內(nèi)多糖得率有明顯影響，其影響由高到低依次為葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，差異極顯 著（P＜0.01）。實驗結(jié)果表明葡萄糖是最適合菌絲體生長產(chǎn)生胞內(nèi)多糖的碳源。在不同種類的氮源實驗中，竹蓀菌絲體干質(zhì)量由高到低的氮源依次為酵母粉、黃豆粉和玉米粉（P＜0.01），竹蓀胞內(nèi)多糖得率由高到低的氮源依次為酵母粉、玉米粉和黃豆粉（P＜0.01）。實驗結(jié)果表明酵母粉是最適合菌絲體生長產(chǎn)生胞內(nèi)多糖的氮源。

2.2 竹蓀多糖發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源和氮源用量的單因優(yōu)化

圖 2 發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖（A）和酵母粉（B）用量對竹蓀菌絲體和 胞內(nèi)多糖發(fā)酵的影響Fig. 2 Effects of glucose (A) and yeast power (B) concentration on mycelial biomass and polysaccharide of D. indusiata

如圖2A所示，葡萄糖用量由15 g/L增加到60 g/L時，竹蓀菌絲體干質(zhì)量和胞內(nèi)多糖得率有大幅度提升。葡萄糖用量為30 g/L時，竹蓀菌絲體干質(zhì)量和胞內(nèi)多糖得率最高，分別為9.72 g/L和0.89 g/L，葡萄糖用量繼續(xù)增加時，其菌絲體干質(zhì)量和胞內(nèi)多糖得率反而有小幅度減少。分析原因可能是過高的葡萄糖用量會抑制竹蓀菌絲體的生長，進而影響胞內(nèi)多糖的合成，因，合適的葡萄糖用量對竹蓀胞內(nèi)多糖的合成影響較大。從單因試驗結(jié)果可知，30 g/L是竹蓀菌絲體液體發(fā)酵胞內(nèi)多糖最佳葡萄糖用量。

如圖2B所示，當(dāng)酵母粉用量為4.5 g/L時，竹蓀菌絲體干質(zhì)量和胞內(nèi)多糖得率最高，分別為9.95 g/L和 0.88 g/L。當(dāng)酵母粉用量增加至6.0 g/L時，其多糖得率開始降低。這可能是由于高用量的酵母粉對菌絲體的生長產(chǎn)生了抑制作用。根據(jù)單因試驗結(jié)果，4.5 g/L是竹蓀菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵胞內(nèi)多糖最佳酵母粉用量。

2.3 Box-Behnken法優(yōu)化竹蓀多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基組成

2.3.1 模型建立和顯著性檢驗

表 3 Box-Behnken法優(yōu)化竹蓀多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基組成Table 3 Box-Behnken design with experimental results

利用Design Expert V8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行次多元回歸擬合，得到竹蓀菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵胞內(nèi)多糖得率（Y）對編碼自變量之間的次多項回歸方程為：

方差分析檢驗多項式方程對試驗數(shù)據(jù)擬合的顯著性，如表4所示。次方程模型的F值為12.59，表明該模型顯著，可以有效擬合試驗數(shù)據(jù)，該模型F值由于噪音因影響發(fā)生的P值小于0.01。從表4可以看出，X1、X3、X4、X1X4、X3X4、X12、X22、X32和X42是顯著項。整個模型的擬合度R2為0.926 4，表明該次方程模型可以解釋和預(yù)測92.64%的變量響應(yīng)，在本研究中可以很好地擬合試驗數(shù)據(jù)。

表 4 Box-Behnken法優(yōu)化竹蓀多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基組成方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model

2.3.2 驗證實驗

2.3.2.1 搖瓶驗證實驗

表 5 Box-Behnken法優(yōu)化竹蓀多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基組成搖瓶 實驗驗證結(jié)果Table 5 Results of confirmation using shake flask experiments

2.3.2.2 發(fā)酵罐驗證實驗

為更好地將上述響應(yīng)面的優(yōu)化結(jié)果應(yīng)用于實際生產(chǎn)，對響應(yīng)面模型得出的最佳條件結(jié)合發(fā)酵罐的最佳控制條件（本研究團隊前期研究基礎(chǔ)）分別在5、30 L和50 L規(guī)模發(fā)酵罐中進行逐步擴大實驗。由圖3A可知，在5 L發(fā)酵罐上，竹蓀菌絲體在0～48 h增加較少，之后進入對數(shù)期，大幅度增加，在第144小時達到最大值16.11 g/L；胞內(nèi)多糖在穩(wěn)定期合成較少，進入對數(shù)期后穩(wěn)定增多，在第144小時達到最大值1.43 g/L。由圖3B可知，在30 L發(fā)酵罐上，竹蓀菌絲體在0～24 h增加較少，之后進入對數(shù)期，大幅度增加，在第144小時達到最大值12.10 g/L；胞內(nèi)多糖在穩(wěn)定期合成較少，進入對數(shù)期后穩(wěn)定增多，在第144小時達到最大值1.28 g/L。由圖3C可知，在50 L發(fā)酵罐上，竹蓀菌絲體在0～24 h增加較少，之后進入對數(shù)期，大幅度增加，在第144小時達到最大值13.69 g/L；胞內(nèi)多糖在穩(wěn)定期合成較少，進入對數(shù)期后穩(wěn)定增多，在第144小時達到最大值1.26 g/L。綜合圖3分析可知，在不同發(fā)酵規(guī)模下，竹蓀菌絲體的生長較為一致，隨著菌絲體生長進入對數(shù)期后，胞內(nèi)多糖的合成也進入快速增長階段，當(dāng)菌絲體生長進入穩(wěn)定期后，胞內(nèi)多糖的合成也基本達到最大值。在發(fā)酵罐控制條件一致時，不同發(fā)酵規(guī)模下的竹蓀菌絲體生長基本一致，胞內(nèi)多糖的含量也很穩(wěn)定，因，本研究獲得的發(fā)酵條件可以考慮進一步繼續(xù)放大以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

圖 3 在5 L（A）、30 L（B）和50 L（C）發(fā)酵罐中優(yōu)化培養(yǎng)基條件下竹蓀多糖發(fā)酵過程曲線Fig. 3 Time-course curves of mycelial biomass and polysaccharide production by D. indusiata using the optimized medium in 5 L (A), 30 L (B) and 50 L (C) fermentors

2.4 不同發(fā)酵規(guī)模下竹蓀多糖的發(fā)酵參數(shù)比較

為更好地比較不同發(fā)酵規(guī)模下竹蓀胞內(nèi)多糖的發(fā)酵結(jié)果，將實驗數(shù)據(jù)進一步整理，得到5、30 L和50 L發(fā)酵罐條件下竹蓀菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵過程參數(shù)，如表6所示。結(jié)合Box-Behnken法優(yōu)化結(jié)果，竹蓀菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵過程參數(shù)比對照組有顯著提高。5、30 L和50 L發(fā)酵罐驗證實驗中的菌絲體干質(zhì)量、菌絲體對葡萄糖得率、胞內(nèi)多糖得率、胞內(nèi)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、胞內(nèi)多糖生產(chǎn)強度和胞內(nèi)多糖對葡萄糖得率均優(yōu)于對照組結(jié)果，且在不同規(guī)模下的發(fā)酵結(jié)果也很穩(wěn)定，沒有較大的波動，可見優(yōu)化后的培養(yǎng)條件有助于提高竹蓀菌絲體中的胞內(nèi)多糖，且隨著發(fā)酵規(guī)模的逐步擴大結(jié)果也很穩(wěn)定。

表 6 在不同規(guī)模發(fā)酵罐中優(yōu)化培養(yǎng)基條件下竹蓀多糖發(fā)酵參數(shù)比較Table 6 Comparison of fermentation parameters for production of D. indusiata polysaccharides using the optimized medium in 5-, 30- and 50-L fermentors

3 討 論