李 桐，吳思琪，曹 鑫，宋靜頤，張紅星，謝遠(yuǎn)紅，金君華

（食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206）

丙烯酰胺具有多種生理毒性，可在淀粉類(lèi)食物經(jīng)高溫烹調(diào)時(shí)產(chǎn)生，目前被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為2A類(lèi)致癌物[1]。丙烯酰胺可快速到達(dá)腸道，刺激腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基，降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性并破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄，使細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，最終可致腸上皮細(xì)胞凋亡或死亡，造成腸黏膜功能障礙[2]。

有報(bào)道顯示乳酸菌作為腸道益生菌，可直接在腸道發(fā)揮抗氧化作用，通過(guò)維持腸道氧化還原平衡狀態(tài)來(lái)維持腸道健康[3]，但是乳酸菌的不同菌種或不同菌株間的特性存在顯著差異。Amanatidou等[4]對(duì)19 株乳酸菌進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果顯示多數(shù)乳酸菌的無(wú)細(xì)胞提取液對(duì)羥自由基有不同程度的清除能力，表明不同乳酸菌間的功能活性存在顯著性差異。在單個(gè)菌株研究方面，Ahotupa等[5]的報(bào)道顯示鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillis rhamnosus GG，LGG）具有較強(qiáng)的清除超氧離子自由基的能力。Eun等[6]研究證實(shí)短乳桿菌也具有較強(qiáng)超氧離子自由基清除能力。因，篩選出抗氧化活性高且耐受能力強(qiáng)的菌株對(duì)于擴(kuò)大具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生菌菌庫(kù)、增強(qiáng)發(fā)酵食品的功能性具有重要的意義。

目前國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道表明對(duì)丙烯酰胺導(dǎo)致的腸道上皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用的活性物質(zhì)主要是具有抗氧化活性的天然化合物，而乳酸菌是否具有該保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。廣西巴馬長(zhǎng)壽村的居民平均壽命超過(guò)85 歲，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵米粉是他們每日必食的食物。因，本研究對(duì)發(fā)酵米粉中的乳酸菌進(jìn)行分離后通過(guò)體外抗氧化模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，檢測(cè)菌株清除1,1-苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的抗氧化能力，探討DPPH自由基清除能力強(qiáng)的菌株——植物乳桿菌GBE17、唾液乳桿菌GBE29對(duì)丙烯酰胺所致腸上皮Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其腸道迫環(huán)境耐受能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期獲得對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用的潛在益生菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：植物乳桿菌GBE17、唾液乳桿菌GBE29 （表1）；參考菌株：鼠李糖乳酸桿菌（L G G，ATCC53103）由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院提供；人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2 武漢普諾賽生命科技有限公司。

表 1 不同來(lái)源的乳酸菌Table 1 Lactobacillus strains isolated from different sources

細(xì)菌基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；MEM細(xì)胞培養(yǎng)液、0.25%胰酶（含0.02% EDTA）、胎牛血清 美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板 美國(guó)Corning公司；青鏈霉混合液（100×）、甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國(guó)Solarbio公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 美國(guó)HyClone公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazol tetrazolium bromide，MTT）、非變性細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限 公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒 南京建成生物工程研究所。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 菌液準(zhǔn)備

將菌株以2%的接種量接種于MRS肉湯中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，并傳至3 代備用。將活化好的菌液，6 000h g、4 ℃離心10 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾所得濾液即為發(fā)酵上清液；菌體沉淀用無(wú)菌PBS（pH 7.4）洗滌3 次，重懸于PBS中，調(diào)整細(xì)菌的濃度約為1h 109CFU/mL，并用細(xì)胞破碎儀冰浴超聲進(jìn)行破碎，400 W間歇4 s，破碎5 min后，12 000h g離心10 min，收集上清液即為無(wú)細(xì)胞提取物[2]。

1.3.2 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[7]所述方法，略有改進(jìn)，其中空白調(diào)零，蒸餾水-乙醇（1∶1，V/V）。反應(yīng)時(shí)，2 mL待測(cè)液中加入0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，室溫下避光反應(yīng)30 min。 3 500h g離心10 min，取上清液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.3 16S rDNA序列分析

將篩選出抗氧化性強(qiáng)的菌株進(jìn)一步做16S rDNA序列分析。采用細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取試驗(yàn)菌株基因組D N A。以試驗(yàn)菌株D N A 為模板，根據(jù)細(xì)菌的16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物。上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]，引物和擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和測(cè)序。將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，從GenBank中選擇近緣菌株的16S rDNA基因序列，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞以MEM完全培養(yǎng)液（含20%胎牛血清和1%青鏈霉雙抗溶液）于37 ℃、5% CO2的飽和濕度環(huán)境中靜置培養(yǎng)，每2 d換液一次。

1.3.5 Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型的建立

參照文獻(xiàn)[8]，采用MTT法確定構(gòu)建氧化損傷模型所需丙烯酰胺濃度，具體操作如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2用胰蛋白酶消化成單層細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以2h 104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96 孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。PBS清洗3 次，向每孔加入1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L的丙烯酰胺100 μL，處理24 h。吸取培養(yǎng)液，PBS清洗3 次后，每孔加入20 μL終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)MTT，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃低速振蕩10 min，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔OD值，并計(jì)IC50，確定丙烯酰胺的最佳誘導(dǎo)濃度。細(xì)胞存活率計(jì)公式如下：

1.3.6 試驗(yàn)細(xì)胞分組

待細(xì)胞貼壁鋪滿板底80%以上，胰酶消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增殖活躍的細(xì)胞隨機(jī)分組。試驗(yàn)細(xì)胞分組如表2、3所示。治療組中，除空白對(duì)照外，各處理組均用含9.8 mmol/L丙烯酰胺的MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基作用24 h，棄上清液，PBS清洗細(xì)胞3 次，孵育4 h。干預(yù)組中，各處理組先用丙烯酰胺與細(xì)胞預(yù)處理4 h后，3 500h g離心10 min收集上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后所得的濾液孵育細(xì)胞24 h。

表 2 治療組細(xì)胞分組處理方式Table 2 Experimental grouping for therapeutic effect evaluation

表 3 干預(yù)組細(xì)胞分組處理方式Table 3 Experimental grouping for preventive effect evaluation

1.3.7 乳酸菌對(duì)氧化損傷的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

參照文獻(xiàn)[9]，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞用胰酶消化收集，制成105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于12 孔板，常規(guī)培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后按表2模型的方法分組處理后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，比較空白對(duì)照組、氧化損傷組、干預(yù)組及上清組細(xì)胞形態(tài)的不同。

1.3.8 測(cè)定指標(biāo)

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液。每孔用無(wú)菌PBS迅速洗滌3 次，均加入150 μL非變性細(xì)胞裂解液，充分混勻，冰浴30 min。12 000h g離心5 min，收集上清液即為細(xì)胞裂解液。細(xì)胞培養(yǎng)上清液與細(xì)胞裂解液按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定SOD、CAT、GSH和LDH活性，以及胞內(nèi)總蛋白含量。

調(diào)pH值：用0.1 mol/L鹽酸溶液將MRS肉湯的pH值調(diào)為3.0、2.5，以pH 6.5的MRS肉湯作為對(duì)照組。

調(diào)膽鹽濃度：將配制好的MRS肉湯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%、0.1%加入膽鹽。

平板計(jì)數(shù)：將活化好的植物乳桿菌GBE17和唾液乳桿菌GBE29三代菌液在4 ℃、5 000h g離心10 min，菌體分別用pH值為3.0、2.5及膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、0.1%的MRS肉湯洗滌1 次后，重懸于對(duì)應(yīng)pH值和膽鹽濃度的等體積MRS肉湯中，37 ℃培養(yǎng)。取培養(yǎng)時(shí)間為0、1、2、3、4 h進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)x取合適的梯度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用f s表示，組間均數(shù)比較采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因方差分析并用LSD法進(jìn)行多重比較，采用GraphPad Prism 6與MEGA 6.0作圖。差異顯著，P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的DPPH自由基清除能力

由表4可知，不同試驗(yàn)菌株的DPPH自由基清除能力之間具有差異，同一株菌不同組分的清除能力也具有顯著區(qū)別，發(fā)酵上清液的抗氧化能力均比無(wú)細(xì)胞提取物強(qiáng)，表明本研究試驗(yàn)菌株中具有DPPH自由基清除能力的活性物質(zhì)主要為胞外代謝產(chǎn)物，分布在發(fā)酵上清液中，這與黃玉軍等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。為了排除培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，本研究也對(duì)MRS培養(yǎng)基的DPPH自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，表明其不具有顯著的抗氧化性，這與劉天祎等[11]實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)清除率影響很小的結(jié)果一致。

菌株發(fā)酵上清液清除率測(cè)定結(jié)果顯示：植物乳桿菌GBE17（89.44%）、唾液乳桿菌GBE29（79.24%）＞植物乳桿菌N1大（36.53%）；而在破碎細(xì)胞的抗氧化能力上，植物乳桿菌GBE17（82.54%）＞植物乳桿菌N1大（30.34%）＞唾液乳桿菌GBE29（17.15%）。由推斷，發(fā)酵上清液與破碎細(xì)胞的抗氧化能力者之間不存在直接相關(guān)性，在同一菌屬下的不同菌株在抗氧化的能力上也存在顯著性的差異，乳酸菌抗氧化能力的強(qiáng)弱與其所在菌屬無(wú)相關(guān)性。

本研究中植物乳桿菌GBE17（89.44%）和唾液乳桿菌GBE29（79.24%）的DPPH自由基清除能力均顯著高于其他18 株菌。劉少敏[12]研究利用相同的檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌ATCC53103發(fā)酵上清液中的DPPH自由基清除率為53.21%，可見(jiàn)本試驗(yàn)菌株具有較好的清除DPPH自由基能力。

表 4 試驗(yàn)菌株DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果Table 4 DPPH radical scavenging activity of Lactobacillus %

2.2 16S rDNA序列分析

菌株GBE17和GBE29擴(kuò)增后得到1 600 bp左右的DNA序列。將結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖1、2。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，菌株GBE17與L. plantarum strain KAI9（KM485570.1），GBE29與 L. salivarius strain L5（KP317678.1）有最接近的親緣關(guān)系，相似度達(dá)到99%。

圖 1 基于16S rDNA序列的GBE17系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree of strain GBE17 based on 16S rDNA sequence

圖 2 基于16S rDNA序列的GBE29系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of strain GBE29 based on 16S rDNA sequence

2.3 模擬腸道的耐受性評(píng)價(jià)

由圖3可知，3 株菌在pH 6.5的條件下，經(jīng)過(guò)4 h的培養(yǎng)，菌落數(shù)均有顯著增加，存活數(shù)均高于109CFU/mL，可見(jiàn)該pH值條件適合乳酸菌的生長(zhǎng)。在低pH值和高膽鹽濃度的培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)4 h，3 株菌的存活數(shù)均高于107CFU/mL，可見(jiàn)試驗(yàn)菌株仍能夠耐受一定的液酸度和膽鹽濃度，在腸道內(nèi)存活并定植，發(fā)揮良好的益生功能。

圖 3 試驗(yàn)菌株對(duì)不同pH值和膽鹽的耐受性Fig. 3 Acid and bile salt tolerance of Lactobacillus

2.4 植物乳桿菌GBE17和唾液乳桿菌GBE29對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

2.4.1 丙烯酰胺濃度對(duì)Caco-2存活率的影響

采用濃度為0.0（空白對(duì)照組）、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L丙烯酰胺處理Caco-2細(xì)胞24 h，構(gòu)建氧化損傷細(xì)胞模型，結(jié)果如圖4所示。

圖 4 丙烯酰胺對(duì)Caco-2的氧化損傷Fig. 4 Acrylamide induced oxidative damage in Caco-2 cells

由圖4可知，1.25 mmol/L丙烯酰胺處理24 h可刺激細(xì)胞的增殖，這與陸惠萍[17]和沈洋[18]的研究結(jié)果一致，可能與低濃度的丙烯酰胺刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)通路有關(guān)。2.5、5.0、10.0 mmol/L及20.0 mmol/L的丙烯酰胺均可對(duì)Caco-2細(xì)胞造成不同程度的損傷，表現(xiàn)在Caco-2存活率降低，且存活率與丙烯酰胺呈劑量相關(guān)性變化。經(jīng)計(jì)可得，丙烯酰胺對(duì)Caco-2細(xì)胞的半致死劑量約為9.80 mmol/L，因本實(shí)驗(yàn)選取9.80 mmol/L丙烯酰胺作為最佳誘導(dǎo)濃度，構(gòu)建Caco-2氧化損傷模型，時(shí)細(xì)胞存活率為50%。

2.4.2 試驗(yàn)菌株對(duì)氧化損傷的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

圖 5 分組處理后Caco-2細(xì)胞形態(tài)圖（×400）Fig. 5 Morphology of Caco-2 cells subjected to different treatments (× 400)

由圖5可見(jiàn)，正常的Caco-2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石狀，無(wú)接觸抑制，密度均勻。經(jīng)9.80 mmol/L丙烯酰胺作用24 h后，部分細(xì)胞漂浮，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓或橢圓形，折光率增強(qiáng)，細(xì)胞成團(tuán)或簇狀分布[17]，表明細(xì)胞受到嚴(yán)重不可逆的損傷。植物乳桿菌GBE17上清組和干預(yù)組對(duì)Caco-2細(xì)胞造成的損傷程度較模型組明顯減小，細(xì)胞形態(tài)更為正常，大部分細(xì)胞貼壁，皺縮程度減輕，密度均勻。由可知，植物乳桿菌GBE17上清組和干預(yù)組均可保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，減輕丙烯酰胺所致Caco-2細(xì)胞的氧化損傷。

值得注意的是，形態(tài)學(xué)方法無(wú)法觀察到乳酸菌上清組與干預(yù)組以及各菌株之間的顯著差異，且乳酸菌完整菌體組因乳酸菌菌體的干擾，無(wú)法觀察到Caco-2細(xì)胞，因具有一定的局限性。為了進(jìn)一步探究不同乳酸菌及其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)Caco-2細(xì)胞抗氧化損傷的干預(yù)及保護(hù)作用，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解液中的抗氧化物酶和抗氧化物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

2.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液及細(xì)胞裂解液的抗氧化活性

細(xì)胞在凋亡或者壞死過(guò)程中細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞，致使胞漿內(nèi)的LDH釋放到培養(yǎng)液中，胞外LDH水平在一定程度上能反映出細(xì)胞受損程度，因而常作為判斷細(xì)胞氧化損傷程度的重要參數(shù)[16]?？寡趸烙到y(tǒng)中的SOD可清除超氧離子自由基，使之發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧化活性較低的H2O2和H2O，是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激最主要的作用。CAT是防止氧化酶氧化失活的一種重要酶類(lèi)，也可同其他氧化酶將H2O2還原成H2O，減少機(jī)體的損傷。GSH是一種低分子自由基清除劑，是谷胱甘肽過(guò)氧化酶（glutathione peroxidase，GPX）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）2 種酶的底物，為這2 種酶分解氫過(guò)氧化物所必需[19]。通過(guò)以上指標(biāo)的測(cè)定，可以很好地反映出對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

針對(duì)胞外上清液中LDH測(cè)定結(jié)果（表5）顯示，氧化損傷組中Caco-2上清液LDH活性（12.22 U/L）顯著高于空白對(duì)照組（1.11 U/L），表明9.80 mmol/L的丙烯酰胺對(duì)Caco-2細(xì)胞造成了損傷，破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)LDH釋放到上清液中，模型建立成功；VC陽(yáng)性對(duì)照組、乳酸菌治療組（除去GBE29上清組）及干預(yù)組均顯著低于氧化損傷組，表明乳酸菌可以保護(hù)丙烯酰胺所致的Caco-2細(xì)胞氧化損傷。

表 5 細(xì)胞上清液的抗氧化活性Table 5 Antioxidant capability of cell culture supernatants

針對(duì)Caco-2胞外上清液的SOD、CAT測(cè)定結(jié)果 （表5）顯示，乳酸菌治療組活細(xì)胞組＞乳酸菌干預(yù)組＞ 乳酸菌治療組上清組，這些處理組的SOD、CAT活性不僅顯著高于模型損傷組（0.55、0.05 U/mL），還顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（1.04、0.14 U/mL）及空白處理組（1.88、3.03 U/mL）。其中，乳酸菌治療組中GBE17及GBE29活細(xì)胞的SOD活性分別高達(dá)9.62 U/mL和8.77 U/mL， CAT活性分別高達(dá)4.14 U/mL和4.67 U/mL。對(duì)于同一株菌而言，乳酸菌治療組中，各菌株活細(xì)胞的SOD、CAT水平顯著高于各對(duì)應(yīng)菌株的上清液組，可能因?yàn)榛罴?xì)胞結(jié)構(gòu)完整，其胞內(nèi)包含了一整套抗氧化酶系統(tǒng)，其抗氧化作用高于胞外分泌物。對(duì)于不同菌株而言，SOD水平的高低不能反映CAT水平的高低，如乳酸菌干預(yù)組中，GBE17的SOD水平顯著低于GBE29，但CAT水平卻高于GBE29。因細(xì)胞內(nèi)自身的抗氧化酶系統(tǒng)的內(nèi)源性調(diào)節(jié)是個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程[18]，不同的抗氧化酶發(fā)揮其抗氧化作用的方式和清除能力也不同，所以者水平的高低之間無(wú)必然聯(lián)系。

針對(duì)Caco-2胞外上清液的非酶抗氧化物質(zhì)GSH測(cè)定結(jié)果（表5）顯示，乳酸菌治療組中GBE17和GBE29的活細(xì)胞組顯著高于氧化損傷組（1.35、1.14 μmol/L）。 上清組中，GBE29的GSH水平雖然小于氧化損傷組，但差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。乳酸菌干預(yù)組中GBE17和GBE29的GSH水平（2.54、2.23 μmol/L）顯著高于氧化損傷組（1.35 μmol/L）。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，在乳酸菌治療組中，GBE17上清組的SOD、CAT和GSH水平高于GBE29，LDH水平低于GBE29，這與GBE17的體外DPPH自由基清除率高于GBE29相吻合，提示體外DPPH自由基清除率可能反映體內(nèi)的抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)水平，關(guān)于其具體的關(guān)系需要進(jìn)一步地探討。

為了檢測(cè)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)和酶活的變化，對(duì)各處理組中細(xì)胞裂解液進(jìn)行測(cè)定。針對(duì)細(xì)胞裂解液中的SOD測(cè)定結(jié)果（表6）顯示，GBE17和GBE29治療組及預(yù)防組均顯著高于氧化損傷組。針對(duì)CAT測(cè)定結(jié)果顯示，雖然GBE17、GBE29完整菌體組和GBE29上清組的水平低于氧化損傷組，但差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞受到氧化損傷時(shí)，GBE17和GBE29能夠通過(guò)提高胞內(nèi)抗氧化酶SOD活性，減輕丙烯酰胺造成的細(xì)胞氧化損傷。

表 6 細(xì)胞裂解液的抗氧化活性Table 6 Antioxidant capability of cell lysates

針對(duì)非酶抗氧化物質(zhì)GSH測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GBE17、GBE29完整菌體組和GBE29上清組均顯著低于氧化損傷組（P＜0.05）。已有研究表明，當(dāng)受到酸、冷迫時(shí)，細(xì)胞通過(guò)消耗少量的GSH抵御迫[20-21]，因推斷當(dāng)細(xì)胞受到氧化迫時(shí)，GSH同以“自殺式”消耗方式發(fā)揮其在迫條件下的保護(hù)作用，關(guān)于GSH在氧化迫條件下發(fā)揮其作用方式的具體機(jī)制還需更深入地研究[15,22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，因菌株具有菌種特異性，其抗氧化物質(zhì)存在的部位不同、清除自由基的活性成分不同[24-25]，對(duì)于丙烯酰胺誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷的治療與預(yù)防效果也大不相同，因不能判斷何種方式對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果最佳。

綜上所述，當(dāng)細(xì)胞受到丙烯酰胺誘導(dǎo)的氧化損傷時(shí)，GBE17的治療組與干預(yù)組和GBE29的干預(yù)組均可降低LDH的釋放，提高細(xì)胞內(nèi)外抗氧化酶SOD、CAT活性?？赡芡ㄟ^(guò)消耗部分非酶抗氧化物質(zhì)GSH保護(hù)氧化損傷的細(xì)胞，體外DPPH自由基清除率結(jié)果可能反映出體內(nèi)的抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)水平。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)測(cè)定不同乳酸菌的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液及細(xì)胞內(nèi)容物的DPPH自由基清除率，篩選出2 株抗氧化能力強(qiáng)的菌株，為植物乳桿菌GBE17和唾液乳桿菌GBE29，其自由基清除能力遠(yuǎn)高于ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株。細(xì)胞形態(tài)觀察及細(xì)胞內(nèi)外的抗氧化物活性測(cè)定結(jié)果表明，丙烯酰胺可以導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞的氧化損傷，GBE17的治療組與干預(yù)組和GBE29的干預(yù)組均可降低LDH的釋放，提高細(xì)胞內(nèi)外抗氧化酶SOD、CAT活性。同時(shí)兩株乳桿菌在pH 3.0和膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的環(huán)境下處理4 h，存活數(shù)均高于107CFU/mL，綜上所述，植物乳桿菌GBE17和唾液乳桿菌GBE29對(duì)丙烯酰胺引起的細(xì)胞氧化損傷具有明顯的抑制作用，能夠改善丙烯酰胺導(dǎo)致的腸道損傷。本研究結(jié)果為預(yù)防和緩解丙烯酰胺致毒提供了新的思路和方法，同時(shí)為開(kāi)發(fā)功能性乳酸菌提供一定的科學(xué)依據(jù)。