鄭 義，張 健，曹永強(qiáng)，趙 笑，余志堅(jiān)，陳 超，楊貞耐,,

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué)，北京 100048；2.東君乳業(yè)（禹城）有限公司，山東 德州 253000）

β-D-半乳糖苷酶，俗稱乳糖酶，能夠催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖[1]；有些酶還具有良好的轉(zhuǎn)糖基活性，即能以乳糖為底物催化合成低聚糖[2]。β-D-半乳糖苷酶不僅可以用于降低乳中乳糖含量，生產(chǎn)低乳糖乳制品，并防止?jié)饪s乳制品結(jié)晶，還可以用于生產(chǎn)低聚半乳糖（galacto-oligosaccharide，GOS）[3]。GOS是在乳糖分子的半乳糖基側(cè)以β-1,4糖苷鍵的形式連接了1～7 個(gè)半乳糖基形成的混合雜聚糖[4]。作為一種新型功能性益生元，GOS具有促進(jìn)腸道雙歧桿菌增殖、改善礦物質(zhì)元吸收、改善脂質(zhì)代謝、預(yù)防和治療便秘等功能[5-7]。利用安全、高效的β-D-半乳糖苷酶，采用酶法合成GOS近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注[8]。

β-D-半乳糖苷酶可從植物、動(dòng)物和微生物（細(xì)菌、霉菌或酵母）中獲得[9]。不同來(lái)源β-D-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)差異很大[10]，其中，微生物源酵母產(chǎn)β-D-半乳糖苷酶活性較高。Chockchaisawasdee等[11]用乳酸克魯維酵母所產(chǎn)β-D-半乳糖苷酶處理乳糖，乳糖水解率高達(dá)92%；劇淑君[12]用馬克斯克魯維酵母β-D-半乳糖苷酶制備GOS，乳糖轉(zhuǎn)化率為30.1%。通常乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母等產(chǎn)生的β-D-半乳糖苷酶具有較強(qiáng)的水解活性[13]；米曲霉、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌等產(chǎn)生的β-D-半乳糖苷酶具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)糖基活性[14]。在安全性方面，通?？唆斁S酵母、黑曲霉等來(lái)源的酶比較安全[15]，來(lái)源于大腸桿菌的β-D-半乳糖苷酶易受到內(nèi)毒污染[12]。微生物源性β-D-半乳糖苷酶具有良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[1]；克魯維酵母的Maxilact系列是當(dāng)前主要的商品β-D-半乳糖 苷酶[16]。由于來(lái)源于酵母的β-D-半乳糖苷酶的最適pH值偏弱酸性，因更適于生產(chǎn)低乳糖乳制品及GOS，并應(yīng)用于預(yù)防乳糖不耐受癥及其他相關(guān)功能性食品的 研發(fā)[17]。但當(dāng)前仍然缺乏優(yōu)良的產(chǎn)β-D-半乳糖苷酶并具有良好的轉(zhuǎn)糖基活性的菌株。

藏靈菇是一種由乳酸菌、酵母、醋酸菌等微生物形成的共生體[18]。藏靈菇發(fā)酵產(chǎn)物具有β-D-半乳糖苷酶活性，能夠有效地水解乳糖，可用于治療乳糖不耐癥等多種代謝性疾病[19]。前期研究還發(fā)現(xiàn)藏靈菇能有效地將乳糖水解后轉(zhuǎn)化為低聚糖[20]。本研究擬從藏靈菇中分離高產(chǎn)β-D-半乳糖苷酶菌株，通過(guò)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化，制備高活性的β-D-半乳糖苷酶，并明確其酶學(xué)特性及產(chǎn)酶條件，制備GOS，為其實(shí)際應(yīng)用奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏靈菇取自西藏林芝牧戶發(fā)酵劑；鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl β-D-galactopyranoside，ONPG）、鄰硝基苯酚（o-nitrophenol，ONP）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、乳糖、葡萄糖、磷酸氫鈉、磷酸氫鈉、十水合磷酸氫鈉、水合磷酸氫鈉、氯化鈉、碳酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸銨、硫酸亞鐵、硫酸鐵（均為分析純），蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏（生化 試劑） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；酵母抽提物（生化 試劑） 英國(guó)Oxoid公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL203型電子天平 梅特利-托利多（上海）儀器有限公司；1-4/2-4 LSC型冷凍干燥機(jī) 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；CR21GIII型高速冷凍離心機(jī)、U-3900型紫外-可見分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；VORTEX-5型旋渦振蕩器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；BX53F型熒光顯微鏡 日本Olympus公司；MLS-3781L型自動(dòng)滅菌鍋 日本Panasonic公司；THZ-D型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒儀器科技有限公司；041BR101783型基礎(chǔ)電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；DDBJ-350型便攜式電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；MLS-3750型高壓蒸汽滅 菌器 日本三洋公司；HPLC-20A高效液相色儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的篩選、分離及鑒定

1.3.1.1 培養(yǎng)基的制備

篩選培養(yǎng)基：乳糖10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母浸膏 10 g/L，NaCl 4 g/L，X-gal 0.035 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

活化培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏20 g/L，葡萄糖 40 g/L；裝液量1 mL/1.5 mL離心管，接種量2.0%（V/V）。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L；裝液量30%，接種量2.0%（V/V），溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.3.1.2 菌株初篩

將藏靈菇以10 g/100 mL接種于純牛乳中，在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，重復(fù)3 次。取第3次的發(fā)酵乳1 mL，加入9 mL無(wú)菌蒸餾水，均勻混和后進(jìn)行梯度稀釋。分別移取200 μL不同梯度濃度菌液均勻涂布于篩選培基上，置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～36 h。從篩選培養(yǎng)基上挑取帶有較深藍(lán)色水解圈的單菌落進(jìn)行平板劃線，重復(fù)劃線3 次，得到純菌。將菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)16 h，之后置于80 ℃甘油管冷凍保藏。

1.3.1.3 菌株復(fù)篩

將甘油管中菌體以2%接種量（V/V）接到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三瓶中，30 ℃、100 r/min條件下發(fā)酵36 h。離心（4 ℃，10 000 r/min，10 min）后，分別測(cè)定上清液和菌體沉淀物的水解酶活力，以確定所產(chǎn)酶為胞內(nèi)酶或胞外酶，并進(jìn)行高產(chǎn)酶菌株的篩選。

1.3.1.4 菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察

取發(fā)酵后的菌液，稀釋后進(jìn)行平板涂布，于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)36 h，觀察菌落形態(tài)。挑取一環(huán)甘油管保藏的菌種，進(jìn)行鏡檢觀察。

1.3.1.5 菌株的鑒定

用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒對(duì)純化后的菌株進(jìn)行DNA的提取。利用提取的總DNA對(duì)ITS保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段。采用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴(kuò)增序列，PCR體系：2h Mix 25 μL、引物各l μL、模板DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)影響馬克斯克魯維酵母菌ZX-5產(chǎn)β-D-半乳糖苷酶的主要因（培養(yǎng)基的碳源和氮源、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH值、搖瓶轉(zhuǎn)速）分別進(jìn)行單因試驗(yàn)。以酶活力為指標(biāo)，選用發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量2%，發(fā)酵36 h。將發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源（葡萄糖）分別以等量的乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖作為碳源進(jìn)行替換；將發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源（蛋白胨）分別以等量的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、硫酸銨作為氮源進(jìn)行替換；選取發(fā)酵溫度分別為20、25、30、35、40 ℃（其他發(fā)酵條件為pH 6.5，轉(zhuǎn)速 150 r/min）；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0（其他發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min）；選取發(fā)酵轉(zhuǎn)速分別為0、50、100、150、200 r/min（其他發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30 ℃，pH 6.5）。

1.3.3 β-D-半乳糖苷酶活力測(cè)定方法

1.3.3.1 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取13.92 mg的ONP（精確到0.001 g）溶于10 mL水中，配制成10 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL的上述溶液于1～6號(hào)試管中，分別添加2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL的水，定容到2.0 mL，配制成0、2、4、6、8、10 mmol/L的ONP標(biāo)準(zhǔn)液。用分光光度計(jì)測(cè)量產(chǎn)物在420 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.3.2 酶活力測(cè)定方法

以50 mmol/L pH 6.5的PBS為溶劑配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的ONPG溶液。取2 mL上述溶液于試管中，在35 ℃的環(huán)境下預(yù)熱10 min后，加入1 mL稀釋后的β-D-半乳糖苷酶液，于35 ℃反應(yīng)15 min，然后加入2.5 mL 0.15 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，靜置5 min，用分光光度計(jì)測(cè)量產(chǎn)物在420 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

β-D-半乳糖苷酶活定義：在35 ℃條件下，1 min催化ONPG反應(yīng)生成1 μmol ONP的酶量定義為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活力單位。

1.3.4 粗酶液的制備

冷凍的菌株解凍后，接種到活化培養(yǎng)基中，接種量2%，35 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，重復(fù)3 代。后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量2%，150 r/min，30 ℃恒溫培養(yǎng)36 h。取30 mL充分搖勻后的菌液裝于離心管中，在4 ℃、10 000 r/min離心10 min，倒掉上清液。用pH 6.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2 次，離心后倒掉上清液，再加入30 mL PBS，充分振蕩后，使用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，得到粗酶液。

1.3.5 β-D-半乳糖苷酶的提純

1.3.5.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

在冰水浴中放置9 個(gè)分別裝有10 mL粗酶液的燒杯，在磁力攪拌條件下緩慢加入研磨過(guò)的(NH4)2SO4粉末，分別添加至不同飽和度（20%～90%），旋渦攪拌20 min，然后在4 ℃靜置30 min，離心（4 ℃，8 000 r/min，15 min），取上清液測(cè)定酶活力[21]。空白組只添加各飽和度的PBS。以上清液中水解酶活對(duì)(NH4)2SO4的飽和度作圖，得到硫酸銨分級(jí)沉淀的曲線，確定(NH4)2SO4分級(jí)沉淀的飽和度。

1.3.5.2 透析脫鹽處理

將硫酸銨分級(jí)沉淀后酶液裝入透析袋中，進(jìn)行透析操作。透析緩沖液為濃度50 mmol/L的PBS。在4 ℃的環(huán)境中透析，平均每4 h換一次透析液，透析1～2 d，用電導(dǎo)率儀測(cè)定緩沖液的電導(dǎo)率，直至電導(dǎo)率不變時(shí)脫鹽完成。

1.3.5.3 DEAE-Sepharose離子交換柱層析

DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱用濃度 50 mmol/L，pH 6.5的PBS沖洗平衡4 個(gè)柱體積后，將透析后得到的酶液溶解在PBS中，上10 mL。先用PBS洗脫，流速為1.0 mL/min，換用不同濃度的NaCl緩沖液進(jìn)行濃度梯度沖洗，濃度分別為0.3、0.5、0.9 mol/L。分別收集每一個(gè)的洗脫液，然后檢測(cè)酶活性。經(jīng)透析、冷凍干燥得到純化酶。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.6.1 酶反應(yīng)的最適溫度

取6 支試管，分別加入2 mL ONPG溶液，再添加1 mL稀釋后的純化酶液，分別置于25、30、35、40、45、50 ℃的水浴鍋中反應(yīng)15 min，測(cè)定其相對(duì)酶活力。

1.3.6.2 酶反應(yīng)的最適pH值和pH值穩(wěn)定性

取6 支試管分別加入稀釋后的純化酶液1 mL，用pH值分別為4、5、6、7、8、9的PBS配制ONPG溶液，測(cè)定其相對(duì)酶活。

1.3.6.3 金屬離子對(duì)酶活的影響

用50 mmol/L pH值為6.5的PBS制備濃度為10 mmol/L 的含有不同金屬離子化合物（CuCl2、CaCl2、MgCl2、MnSO4、FeCl3、ZnCl2、FeCl2）的溶液，然后以溶液配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的ONPG溶液，測(cè)定含不同金屬離子溶液中β-D-半乳糖苷酶的相對(duì)酶活變化。

1.3.7 β-D-半乳糖苷酶產(chǎn)低聚糖的特性

將3.0 g乳糖溶于4.5 mL pH 6.0的PBS中（乳糖終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%），置于35 ℃保溫30 min。取一定量來(lái)源于菌株ZX-5所產(chǎn)的β-D-半乳糖苷酶溶于5 mL緩沖液中，輕搖混合均勻，從中取0.5 mL酶液加入乳糖溶液，制成5.0 mL的終反應(yīng)體系，酶的終濃度為1.0 U/mL。在35 ℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，分別于0、4、8、12、20、30、40、50 h從中取100 μL，迅速置于沸水浴10 min終止酶反應(yīng)。冷卻后稀釋10 倍，再過(guò)0.45 μm的濾膜除去雜質(zhì)，采用高效液相色法測(cè)定其中各種產(chǎn)物的產(chǎn)量。每個(gè)品、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用3 次平行實(shí)驗(yàn)取平均值，采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-D-半乳糖苷酶菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株初篩

圖 1 從藏靈菇中分離得到具有藍(lán)色水解圈的菌落Fig. 1 Bacterial colonies with blue hydrolysis circles isolated from Tibet kefir

X-gal可以在β-D-半乳糖苷酶的催化下生成藍(lán)色產(chǎn)物，是β-D-半乳糖苷酶的顯色底物，且藍(lán)色越深， β-D-半乳糖苷酶的活力越高[19]。如圖1所示，使用以乳糖為唯一碳源、添加X-gal的篩選培養(yǎng)基平板，從藏靈菇中分離得到大量的呈現(xiàn)藍(lán)色水解圈的菌落。選擇水解圈較大、顏色較深的菌落用于產(chǎn)β-D-半乳糖苷酶菌株的復(fù)篩。

2.1.2 菌種復(fù)篩

挑取上述所得呈現(xiàn)藍(lán)色水解圈較大的菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)發(fā)酵液離心所得菌體進(jìn)行破壁處理，進(jìn)一步離心，經(jīng)酶活測(cè)定，酶活力主要集中在上清液中，即所產(chǎn)β-D-半乳糖苷酶為胞內(nèi)酶。挑選酶活力最高的菌落，命名為ZX-5。

2.1.3 菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察

圖 2 ZX-5菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察Fig. 2 Colony morphology and microscopic graph of ZX-5

將ZX-5在培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)后，對(duì)其所形成的菌落進(jìn)行觀察，如圖2a所示，菌落為乳白色，大而厚，濕潤(rùn)，表面光滑不透明，黏稠。鏡檢觀察的結(jié)果如圖2b所示，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)，初步確定該菌株為酵母。

2.1.4 菌株的鑒定

圖 3 菌株ZX-5 ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on ITS sequences of ZX-5

ITS序列分析具有技術(shù)簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于真菌菌株的鑒定，是一種重要分子標(biāo)記[22]。以引物ITS1、ITS4擴(kuò)增序列，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為726 bp。通過(guò)BLAST搜索相關(guān)序列，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)其序列與 K. marxianus CCT7735（CP009307.1）相似度為100%；選取與ZX-5 ITS序列相似度高的15 株菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。根據(jù)序列分析結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，可以確定ZX-5為馬克斯克魯維酵母。

2.2 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 產(chǎn)β-D-半乳糖苷酶的單因試驗(yàn)

2.3.1 碳源、氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖 4 碳源（a）、氮源（b）對(duì)菌株ZX-5發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig. 4 Effects of carbon (a) and nitrogen (b) sources on β-D-galactosidase activity of ZX-5

碳源、氮源是酵母產(chǎn)酶所需的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量來(lái)源[23]。如圖4所示，不同碳源、氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶活性存在著顯著性的差異。以半乳糖、葡萄糖、果糖為碳源的水解酶活力比以乳糖和蔗糖的高，其中以半乳糖為碳源時(shí)菌株所產(chǎn)酶活力最高，這可能與半乳糖、葡萄糖和果糖作為單糖易于被菌體直接吸收利用有關(guān)；以胰蛋白胨為氮源的水解酶活力最高，以硫酸銨為氮源的水解酶活力最低，其原因可能是蛋白胨類有機(jī)氮源降解后形成的小分子肽類物質(zhì)易于被微生物直接利用[23]，而使用無(wú)機(jī)氮源時(shí)，氮源利用率低，菌體生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)生的水解酶活力偏低。

2.3.2 發(fā)酵溫度、初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

如圖5a所示，溫度能影響細(xì)胞內(nèi)相關(guān)生物酶的催化效率，從而間接影響菌體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率[24]。培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，馬克斯克魯維酵母產(chǎn)β-D-半乳糖苷酶的水解酶活力達(dá)到最大值；低于30 ℃時(shí)，酶活力與溫度呈正相關(guān)，即菌株產(chǎn)酶隨著培養(yǎng)溫度的升高而增加；高于30 ℃時(shí)，隨著溫度升高可能會(huì)對(duì)酵母代謝產(chǎn)生不利的影響，從而使菌株產(chǎn)酶呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。該菌的最適發(fā)酵溫度與文獻(xiàn)報(bào)道的K. marxianus Z-5較為相似[25]。由，選擇30 ℃為適宜的發(fā)酵溫度。

圖5b顯示了不同初始pH值的培養(yǎng)基對(duì)菌株ZX-5產(chǎn)酶的影響。在較低或者較高pH值環(huán)境下發(fā)酵，菌株的水解酶活力普遍較低；而在偏中性的pH值環(huán)境，菌株水解酶活力相對(duì)較高。當(dāng)pH值小于6.5時(shí)，菌株產(chǎn)水解酶活力與pH值呈正相關(guān)，在pH 6.5時(shí)酶活力達(dá)到最大值；當(dāng)pH值大于6.5時(shí)，菌株產(chǎn)水解酶活力與pH值呈負(fù)相關(guān)。由，選擇培養(yǎng)基初始pH 6.5進(jìn)一步研究。

圖 5 發(fā)酵溫度（a）、培養(yǎng)基初始pH值（b）、搖床轉(zhuǎn)速（c） 對(duì)菌株ZX-5發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig. 5 Effects of temperature (a), initial medium pH (b) and shaking speed (c) on β-D-galactosidase activity of ZX-5

發(fā)酵產(chǎn)酶效率很大程度上受培養(yǎng)基中溶解氧速度的影響。當(dāng)培養(yǎng)基中氧含量過(guò)低時(shí)，培養(yǎng)基稠度較高；培養(yǎng)基中氧含量過(guò)高時(shí)，產(chǎn)物的積累效率會(huì)大大降低[26]。由圖5c可以看出，轉(zhuǎn)速在0～100 r/min范圍內(nèi)，β-D-半乳糖苷酶的水解酶活力隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到100 r/min時(shí)，水解酶活力達(dá)到值。而后隨轉(zhuǎn)速增加，水解酶活力呈下降趨勢(shì)。由，選擇100 r/min為適宜的搖床轉(zhuǎn)速。

2.4 β-D-半乳糖苷酶的提純

2.4.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

由圖6可知，當(dāng)粗酶液中添加的硫酸銨的飽和度在0%～50%范圍時(shí)，上清液中酶活力變化不大；隨著硫酸銨的飽和度逐漸增大，尤其當(dāng)飽和度達(dá)60%以上時(shí)，上清液中殘余酶活大幅度下降；當(dāng)飽和度達(dá)到80%時(shí)，上清液中酶活力已很低，這表明大部分的酶已經(jīng)沉淀下來(lái)。因，在用硫酸銨分級(jí)沉淀提取酶時(shí)，可以先在硫酸銨飽和度30%時(shí)沉淀去除一部分雜質(zhì)蛋白，然后繼續(xù)添加硫酸銨，使飽和度達(dá)到80%，收集所得的沉淀于50 mmol/L PBS中保存。

圖 6 硫酸銨沉淀上清液中β-D-半乳糖苷酶活力變化曲線Fig. 6 Enzymatic activity of β-D-galactosidase in supernatants after precipitation with various degrees of (NH4)2SO4 saturation

2.4.2 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析

圖 7 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換色譜分離純化β-D-半乳糖苷酶Fig. 7 Purification of β-D-galactosidase on DEAE-Sepharose Fast Flow

2.4.3 溫度對(duì)β-D-半乳糖苷酶活性的影響

溫度的高低對(duì)酶的催化活性和酶的穩(wěn)定性具有明顯影響[27]。由圖8a可知，當(dāng)溫度低于35 ℃時(shí)，水解酶活力與溫度呈正相關(guān)，35 ℃時(shí)，酶活力達(dá)到最大值。繼續(xù)升高溫度，酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。如圖8b所示，在20～40 ℃范圍內(nèi)處理酶液30 min后，酶活力仍保留在80%以上，可見菌株ZX-5的β-D-半乳糖苷酶在低于40 ℃時(shí)穩(wěn)定性較好；當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)處理30 min后，β-D-半乳糖苷酶的殘余酶活力約為40%，酶活力損失比較大；當(dāng)溫度60 ℃時(shí)處理30 min，殘余酶活力不足20%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳酸克魯維酵母產(chǎn)酶在溫度超過(guò)35 ℃后失活較快，60 ℃保溫15 min，酶即失活90%[28]。這也與本實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)論相接近。

圖 8 溫度對(duì)β-D-半乳糖苷酶活性（a）及熱穩(wěn)定性（b）的影響Fig. 8 Effect of temperatures on β-D-galactosidase activity (a) and thermal stability (b)

2.4.4 pH值對(duì)β-D-半乳糖苷酶活性的影響

圖 9 pH值對(duì)β-D-半乳糖苷酶活性的影響Fig. 9 Effect of pH value on β-D-galactosidase activity

pH值能影響酶的分子構(gòu)象、酶和底物的解離狀態(tài)以及酶活力的穩(wěn)定性[29]。如圖9所示，馬克斯克魯維酵母ZX-5產(chǎn)的β-D-半乳糖苷酶的最適pH值為6.0。該酶在pH 5.0～7.0的范圍內(nèi)，其相對(duì)酶活力在90%以上，酶活性比較穩(wěn)定，而在較強(qiáng)酸性（pH 4.0）或者堿性（pH 9.0）環(huán)境中，其酶活力損失很大。該酶與已報(bào)道菌株LW106的β-D-半乳糖苷酶最適pH值較為相似[30]，而與Katrolia等[31]研究的基因重組菌株的酶最適pH 5.5有所差別。

2.4.5 金屬離子對(duì)β-D-半乳糖苷酶活性的影響

金屬離子能夠影響酶活性，可以激活或抑制酶的活性位點(diǎn)[32]。由圖10可知，金屬離子Ca2、Mg2、Fe2能輕微抑制β-D-半乳糖苷酶水解活性，而Cu2、Fe3、 Zn2對(duì)酶活性的抑制作用較大，其中Cu2對(duì)酶活性抑制作用最大，可使酶活力下降至20%左右；Mn2對(duì)酶活性具有一定的激活作用。據(jù)報(bào)道，某些金屬離子如Cu2能與酶分子中游離的羧基結(jié)合，生成不溶性的鹽類物質(zhì)，改變酶的結(jié)構(gòu)，從而抑制其催化活性；而Mn2能激活酶的活性位點(diǎn)，對(duì)酶的最佳活性構(gòu)象起到穩(wěn)定作用，金屬離子構(gòu)成輔酶，促進(jìn)酶的催化活性[12]。

圖 10 金屬離子對(duì)β-D-半乳糖苷酶活性的影響Fig. 10 Effect of various metal ions on β-D-galactosidase activity

2.5 β-D-半乳糖苷酶作用下低聚糖的生物合成

圖 11 乳糖水解率和低聚糖產(chǎn)率變化曲線Fig. 11 Lactose hydrolysis rate and oligosaccharide production rate with the microbial β-D-galactosidase

基于酶法利用乳糖合成低聚糖被認(rèn)為是大量生產(chǎn)低聚糖的唯一有效方法[2]。如圖11所示，在35 ℃、乳糖質(zhì)量濃度60 g/100 mL、酶濃度1.0 U/mL條件下酶促反應(yīng)過(guò)程中乳糖水解及低聚糖合成的情況。在乳糖作為唯一底物的情況下，酶催化反應(yīng)形成的低聚糖主要為低聚半乳三糖和低聚半乳四糖，同時(shí)還有部分葡萄糖和半乳糖生成。隨著酶反應(yīng)的進(jìn)行，乳糖不斷被水解。到40 h左右，總低聚糖質(zhì)量濃度為208.19 g/L，產(chǎn)率達(dá)到34.70%。后低聚糖的產(chǎn)率下降，這可能是在反應(yīng)液中乳糖質(zhì)量濃度降低的情況下，其中部分低聚糖被β-D-半乳糖苷酶分解的結(jié)果。反應(yīng)至50 h時(shí)的乳糖水解率達(dá)到68.34%。邢肖肖等[33]用乳酸克魯維酵母β-D-半乳糖苷酶合成GOS，產(chǎn)率為18.9%；Kim等[34]采用部分純化的黑曲霉β-D-半乳糖苷酶合成GOS，產(chǎn)率為20%；Splechtna等[35]利用長(zhǎng)雙歧桿菌產(chǎn)生的β-D-半乳糖苷酶合成GOS，產(chǎn)率為32.5%。因，ZX-5菌株β-D-半乳糖苷酶的GOS產(chǎn)率與已報(bào)道的相比較好，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論