韓 琴，徐新星，王儒昕，李 鑫，閆達(dá)中，吳 菁，劉 軍

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

引文格式：韓琴, 徐新星, 王儒昕, 等. 敲除ptsG基因及共表達(dá)透明顫菌血紅蛋白提高大腸桿菌SHMT產(chǎn)量[J]. 食品科學(xué), 2020, 41(2): 119-125. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181114-165. http://www.spkx.net.cn

HAN Qin, XU Xinxing, WANG Ruxin, et al. Knockout of ptsG and co-expression with Vitreoscilla hemoglobin enhance the production of serine hydroxymethyltransferase in Escherichia coli[J]. Food Science, 2020, 41(2): 119-125. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181114-165. http://www.spkx.net.cn

L-絲氨酸是一種具有重要價(jià)值的氨基酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)中[1]。L-絲氨酸每年約3 000 t市場(chǎng)量，如果生產(chǎn)成本降低，市場(chǎng)量會(huì)進(jìn)一步增 加[1-2]。L-絲氨酸生產(chǎn)方法主要有蛋白水解提取法[3]、化學(xué)合成法[4]、發(fā)酵法[5-6]、前體物細(xì)胞轉(zhuǎn)化法[7]或酶轉(zhuǎn)化法[8]。

蛋白水解提取法存在工藝復(fù)雜和分離精制困難等缺點(diǎn)。化學(xué)合成法存在污染重和D-絲氨酸與L-絲氨酸分離困難等缺點(diǎn)。發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸主要是利用大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌，它們合成L-絲氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，并且胞內(nèi)L-絲氨酸可用于合成甘氨酸、半胱氨酸和色氨酸，作為碳單位來(lái)源用于合成嘌呤、胸腺嘧啶核苷酸和磷脂分子。另外，在脫水酶或脫氨酶作用下，胞內(nèi)L-絲氨酸被降解，故L-絲氨酸在體內(nèi)很難得到積累[1]。前體物細(xì)胞轉(zhuǎn)化法存在轉(zhuǎn)化率偏低、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)以及成本高等缺陷[7]。酶轉(zhuǎn)化法是目前國(guó)際上普遍采用的方法，具有反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單、副反應(yīng)少和生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（serine hydroxymethyltransferase，SHMT）是用于絲氨酸酶法合成的酶，它由glyA編碼，以吡哆醛磷酸酯為輔酶，在四氫葉酸存在下催化甲醛、甘氨酸生成L-絲氨酸[8]。

SHMT的高效制備是酶法生產(chǎn)L-絲氨酸的基礎(chǔ)。菌體高密度培養(yǎng)可以提高單位發(fā)酵液產(chǎn)酶水平。然而，在大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，菌體生物量和外源蛋白表達(dá)量往往受到溶解氧不足的限制而難以達(dá)到較高的水平，提高細(xì)胞的氧利用效率能夠增加菌體生長(zhǎng)。血紅蛋白是生物體結(jié)合、運(yùn)輸氧分子的蛋白質(zhì)，廣泛存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)植物中[9]。透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）是一種專性好氧的革蘭氏性絲狀菌在低氧環(huán)境中產(chǎn)生的一種可溶性蛋白，具有較高的氧吸附和解離速率常數(shù)[10]。該蛋白已在多種宿主中成功表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)合成和提高代謝物產(chǎn)率[11]，表明在大腸桿菌中共表達(dá)目的蛋白和VHb是改善發(fā)酵過(guò)程溶氧限制、增加細(xì)胞生長(zhǎng)和外源蛋白產(chǎn)量的有效手段。已報(bào)道，在大腸桿菌中共表達(dá) α-淀粉酶和VHb，提高了α-淀粉酶的表達(dá)量[12-13]；Pablos等[14]在大腸桿菌菌株W3110中表達(dá)VHb后，微氧環(huán)境中菌體生物量提高了約33%，同時(shí)菌體比生長(zhǎng)速率提高了約30%。于慧敏等[15]將vgb基因插入產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯（poly-β-hydroxybutyrate，PHB）重組大腸桿菌VG1（pTU14）染色體中，發(fā)現(xiàn)vgb基因的引入可以同時(shí)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和PHB的積累，且溶氧水平越低，VHb表達(dá)量越大，這種促進(jìn)作用越明顯。鄭方亮等[16]通過(guò)敲除ATP合酶基因并進(jìn)一步插入vgb基因，使鈍齒棒桿菌T6-13谷氨酸產(chǎn)出累積量提高了36.91%。

大腸桿菌在高密度發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)生乙酸等代謝副產(chǎn)物。乙酸累積是抑制菌體生長(zhǎng)和外源蛋白產(chǎn)量的另一重要因，乙酸產(chǎn)生是由于菌體對(duì)葡萄糖的攝取速率與細(xì)胞的碳代謝速率不平衡所致[17]。大腸桿菌對(duì)葡萄糖的攝取主要通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）完成，PTS包括EI、HPr以及EIIs，前兩者為胞質(zhì)可溶型蛋白，分別由ptsH基因和ptsI基因編碼，后者多為蛋白復(fù)合體，對(duì)碳水化合物具有特異性，包括EIIMan、EIIFru、EIIBgl、EIIAGlc和EIICBGlc等[18]，其中由ptsG基因編碼的酶EIICBGlc在葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要作用[19]。EIICBGlc蛋白介導(dǎo)的高效葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)，易導(dǎo)致胞內(nèi)三羧酸循環(huán)和糖酵解不平衡，從而生成大量乙酸，不利于菌體高密度生長(zhǎng)[20]。韓武洋等[21]敲除了谷氨酸棒桿菌ATCC13032編碼葡萄糖PTS系統(tǒng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ptsG、ptsH-ptsI和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因abc、abc2和iolt1，表明ptsG、ptsH-ptsI、abc、abc2和iolt1所編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并且葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)除PTS外還存在其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。ptsG基因缺陷菌株能使胞內(nèi)三羧酸循環(huán)和糖酵解趨于平衡，乙酸產(chǎn)量減少。因，利用代謝工程技術(shù)，構(gòu)建ptsG基因敲除菌株，能夠降低葡萄糖攝取速率及乙酸累積，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，增加外源蛋白的表達(dá)量。

鑒于VHb與ptsG基因的生物學(xué)效應(yīng)，本研究將敲除大腸桿菌ptsG基因，在缺失ptsG基因菌株中共表達(dá)SHMT和VHb，以期提高工程菌株產(chǎn)SHMT的能力，實(shí)現(xiàn)工程菌株高效生產(chǎn)SHMT，為酶法制備L-絲氨酸提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

透明顫菌（Vitreoscilla）、Escherichia coli DH5α、E. coli BL21（DE3）、質(zhì)粒pKD13（氯霉抗性）、質(zhì)粒pCP20（氨芐霉、氯霉抗性）、質(zhì)粒pKD46（氨芐霉抗性）由本實(shí)驗(yàn)室保存；pET-28a載體 德國(guó)Novagen公司。

1.1.2 試劑、試劑盒與引物

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、PyrobestTMDNA Polymerase、DNA Marker、蛋白Marker 日本TaKaRa公司；細(xì)菌基因組快速提取試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖小⒕酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物回收試劑盒、GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、L-阿拉伯糖、氯霉、氨芐青霉、卡那霉上海捷瑞生物工程有限公司；Tris base、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺 美國(guó)Fluka公司；蛋白胨、酵母粉 英國(guó)Oxoid公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

引物由上海捷瑞生物工程公司合成，具體序列見(jiàn)表1。

表 1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primer sequences used in this research

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L； LBG培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L， 葡萄糖25 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

GBox-HR-E-M凝膠成像系統(tǒng) 英國(guó)Syngene公司；TProfessional PCR儀 德國(guó)Biometra公司；5417R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、Electroporator 2010電轉(zhuǎn)化儀 德國(guó)Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀、DYCZ系列垂直式電 泳槽 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 ptsG基因敲除菌株的構(gòu)建

利用Red同源重組技術(shù)敲除大腸桿菌BL21（DE3）的ptsG基因[22]。以pKD13為模板，Pcmr上和Pcmr下擴(kuò)增氯霉抗性基因。以大腸桿菌BL21（DE3）基因組為模板，以PptsGA上與PptsGA下擴(kuò)增ptsG基因上游同源臂，以PptsGB上與PptsGB下擴(kuò)增ptsG基因下游同源臂。利用重疊PCR連接上述三片段，回收兩端具有ptsG基因的氯霉抗性基因片段，用于敲除大腸桿菌ptsG基因。

按1%接種量，將過(guò)夜培養(yǎng)攜帶pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）菌液接種至50 mL加有氨芐青霉（60 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600nm為0.5～0.6，加入0.1 g/100 mL L-阿拉伯糖誘導(dǎo)2 h。將菌液冰浴，離心收集菌體。用10%甘油清洗菌體3 次后懸于500 μL甘油中，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將兩端具有同源臂的氯霉抗性基因片段電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞（電轉(zhuǎn)條件：電壓1.8 kV/cm、1 mm電擊杯）。加入1 mL預(yù)冷的LB培養(yǎng)基，在37 ℃、100 r/min培養(yǎng)2 h。涂布于含有氯霉（25 μg/mL）的LB平板，篩選重組子，利用PCR鑒定，并測(cè)序確證。

1.3.2 表達(dá)載體及工程菌株的構(gòu)建

以大腸桿菌BL21（DE3）基因組為模板，用PSHMT上和PSHMT下擴(kuò)增出glyA基因；以透明顫菌基因組為模板，用PVHb上和PVHb下擴(kuò)增出vgb基因。用NcoI和BamHI雙酶切純化后的PCR產(chǎn)物，依次用T4 DNA Ligase連接到用NcoI和BamHI雙酶切的質(zhì)粒pET-28a上，得到重組質(zhì)粒pET-glyA和pET-vgb。

利用BglII和HindIII雙酶切質(zhì)粒pET-vgb，回收含T7啟動(dòng)子和vgb基因的DNA片段。用BamHI和HindIII雙酶切質(zhì)粒pET-glyA，用T4 DNA Ligase將它與含vgb基因和T7啟動(dòng)子的DNA片段連接，得到共表達(dá)SHMT和VHb重組質(zhì)粒pET-SV。

將質(zhì)粒pET-28a、重組質(zhì)粒pET-glyA及pET-SV轉(zhuǎn)化宿主菌，得到對(duì)照菌株BL21（DE3）/pET-28a，單表達(dá)SHMT工程菌株BL21（DE3）/pET-glyA、BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA及共表達(dá)SHMT和VHb工程菌株 BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV。

1.3.3 菌株生長(zhǎng)測(cè)定

挑取單表達(dá)SHMT工程菌株及共表達(dá)SHMT和VHb工程菌株單菌落，分別接種于LB培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)10 h后，轉(zhuǎn)接于LB和LBG培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，定時(shí)取測(cè)定菌密度。

1.3.4 工程菌誘導(dǎo)表達(dá)SHMT

1.3.5 SHMT表達(dá)水平及酶活力測(cè)定

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 ptsG基因敲除

以PptsGA上和PptsGB下為引物，以對(duì)照菌株和從氯霉平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子基因組作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為2 400 bp和2 030 bp，分別與對(duì)照菌株和ptsG基因缺失的氯霉抗性轉(zhuǎn)化子預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，且后者與進(jìn)行ptsG基因缺失的兩同源臂及氯霉抗性基因三片段拼接產(chǎn)物大小一致（圖1），表明用于ptsG基因缺失片段已整合進(jìn)大腸桿菌BL21（DE3）基因組，并替換掉其基因組中兩同源臂之間的序列。

圖 1 PCR鑒定ptsG基因缺失菌株BL21（DE3）ΔptsGFig. 1 Identification of the ptsG-deleted strain BL21(DE3)ΔptsG by PCR

2.2 重組載體與工程菌株的構(gòu)建

質(zhì)粒pET-glyA和pET-vgb構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2。用NcoI和BamHI雙酶切鑒定構(gòu)建的重組載體pET-glyA和pET-vgb。酶切pET-glyA產(chǎn)生兩條帶，其中大片段與pET-28a單酶切質(zhì)粒大小一致，小片段約為1 250 bp，與含有T7啟動(dòng)子和glyA基因的DNA片段大小相符（圖3）。酶切重組 pET-vgb質(zhì)粒產(chǎn)生兩條片段，大片段與pET-28a質(zhì)粒大小一致，小片段與vgb基因大小一致（圖4）。序列測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)，重組載體pET-glyA和pET-vgb構(gòu)建成功。

從構(gòu)建的共表達(dá)重組載體pET-SV的菌株中提取質(zhì)粒，以PVHb上和PVHb下為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖5，擴(kuò)增片段與預(yù)期大小458 bp一致。序列測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)，共表達(dá)SHMT和VHb的重組載體pET-SV構(gòu)建成功。

圖 2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 2 Construction of recombinant plasmids

圖 3 酶切鑒定重組質(zhì)粒pET-glyAFig. 3 Identification of recombinant plasmid pET-glyA by enzymedigestion

圖 4 酶切鑒定重組質(zhì)粒pET-vgbFig. 4 Identification of recombinant plasmid pET-vgb by enzyme digestion

圖 5 PCR擴(kuò)增vgb基因Fig. 5 PCR amplification products of vgb gene

將質(zhì)粒pET-28a、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）及BL21（DE3）ΔptsG，得到對(duì)照菌株BL21（DE3）/pET-28a、單表達(dá)SHMT工程菌株BL21（DE3）/pET-glyA、BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA及共表達(dá)SHMT和VHb工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV。

2.3 重組菌株生長(zhǎng)曲線

圖 6 BL21（DE3）/pET-glyA、BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA和 BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig. 6 Growth curve of BL21(DE3)/pET-glyA, BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA and BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV in LB medium

將BL21（DE3）/pET-glyA、BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA和BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV 3 種菌株，分別在LB和LBG培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，每隔2 h取測(cè)OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。從圖6可知，在沒(méi)有葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，BL21（DE3）/pET-glyA和BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA兩種菌株生長(zhǎng)情況相差不大，但BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV菌株在穩(wěn)定期的OD600nm值比BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.3%，比BL21（DE3）/pETglyA提高了25.5%，表明vgb基因的引入可以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，提高菌體生長(zhǎng)密度。

在含有葡萄糖的L B G 培養(yǎng)基中， 穩(wěn)定期 BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA菌株OD600nm比BL21（DE3）/ pET-gly提高了19.4%，BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV菌株OD600nm值比BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.5%（圖7），表明ptsG基因缺失可以增加菌株在含葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)VHb能進(jìn)一步提高菌株生長(zhǎng)量。

圖 7 BL21（DE3）/pET-glyA、BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA和 BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV在LBG培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig. 7 Growth curve of BL21(DE3)/pET-glyA, BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA and BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV in LBG medium

2.4 工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活力分析

圖 8 工程菌表達(dá)SHMT和VHb的SDS-PAGE分析Fig. 8 SDS-PAGE analysis of protein expression in recombinant strains

對(duì)誘導(dǎo)后的菌體全細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見(jiàn)圖8。工程菌株BL21（DE3）/pET-glyA和BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA在分子質(zhì)量47 kDa處有蛋白表達(dá)條帶，大小與SHMT相符。工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pETvgb在分子質(zhì)量15.7 kDa處有蛋白表達(dá)條帶，大小與VHb一致。工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV在分子質(zhì)量47 kDa和15.7 kDa處均有蛋白表達(dá)條帶，產(chǎn)物大小分別與SHMT和VHb一致。上述結(jié)果表明，SHMT和VHb在攜帶它們相應(yīng)編碼基因glyA和vgb的工程菌株中均得到表達(dá)。

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，測(cè)定菌株產(chǎn)SHMT活力，對(duì)照菌株BL21（DE3）/pET-28a、工程菌株BL21（DE3）/pET-glyA、 BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA和共表達(dá)工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV的SHMT活力分別為30.6、195.8、235.6 U/mL和293.8 U/mL。相比對(duì)照菌株，兩種單表達(dá)基因工程菌株SHMT活力分別提高了6.4 倍和 7.7 倍；共表達(dá)基因工程菌株的SHMT活力提高了9.6 倍。因，ptsG基因的敲除能夠增加工程菌株在含葡萄糖培養(yǎng)基中SHMT的表達(dá)量，共表達(dá)VHb能進(jìn)一步提高菌株SHMT產(chǎn)量。

3 討 論

本研究利用Red同源重組技術(shù)敲除大腸桿菌ptsG基因。由于ptsG基因編碼的酶EIICBGlc主要在大腸桿菌葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用[18-19]，故在沒(méi)有葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，ptsG基因缺失菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA和菌株BL21（DE3）/pET-glyA生長(zhǎng)情況差別不明顯。在含有葡萄糖的LBG培養(yǎng)基中，敲除了ptsG基因的菌株對(duì)葡萄糖吸收速率降低，細(xì)胞代謝產(chǎn)物乙酸產(chǎn)生少，減少了乙酸對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，同時(shí)由于菌株仍然能夠利用PTS途徑中的EIIMan等運(yùn)輸體轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖[20,25]，并利用磷酸烯醇式丙酮酸提供磷酸基團(tuán)對(duì)葡萄糖磷酸化，故ptsG基因缺失工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA比工程菌株BL21（DE3）/pET-glyA在穩(wěn)定期OD600nm提高了19.4%，并且菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA產(chǎn)SHMT活力比菌株BL21（DE3）/pET-glyA提高了20.3%。

菌體生物量和外源蛋白表達(dá)量往往受到發(fā)酵液溶解氧水平的影響。VHb能加快大腸桿菌胞內(nèi)三羧酸循環(huán)進(jìn)程，提高菌體對(duì)乙酰輔酶A的消耗速度，進(jìn)而在一方面能夠促進(jìn)菌體生物量的增加，另一方面可以抑制乙酸等代謝副產(chǎn)物的生成[26]。本研究表明，在不含葡萄糖或含葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，共表達(dá)VHb均能夠提高菌株的生物量。在沒(méi)有葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，共表達(dá)VHb工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV在穩(wěn)定期的OD600nm值比菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA提高了21.3%；在含有葡萄糖的LBG培養(yǎng)基中，菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV 的OD600nm值比菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA提高了21.5%，并且產(chǎn)SHMT活力比菌株BL21（DE3） ΔptsG/pET-glyA提高了24.7%。

為實(shí)現(xiàn)重組蛋白高效生產(chǎn)，高細(xì)胞密度培養(yǎng)技術(shù)至關(guān)重要，得到高密度菌體是提高重組蛋白的前提。在厭氧或供氧不足條件下，大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸，另外，當(dāng)大腸桿菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基含葡萄糖過(guò)多，即使在溶氧充足情況下，也可以產(chǎn)生乙酸[27]。高濃度乙酸會(huì)降低菌體生長(zhǎng)速率和生物量，從而導(dǎo)致外源蛋白產(chǎn)量降低。目前，在發(fā)酵工藝上主要通過(guò)控制葡萄糖補(bǔ)料速率，減少大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中乙酸的生成[28-29]。這種方法能限制大腸桿菌發(fā)酵中乙酸積累，但發(fā)酵工藝復(fù)雜。本研究構(gòu)建的ptsG缺失菌株，由于葡萄糖的吸收速率降低，可以避免使用復(fù)雜的發(fā)酵控制工藝，使菌體產(chǎn)乙酸得到控制，在生產(chǎn)中具有優(yōu)勢(shì)。溶氧不足也常會(huì)成為大腸桿菌高密度發(fā)酵的限制因，雖然在發(fā)酵過(guò)程中可以通過(guò)增加通氣量、加大攪拌速率提高發(fā)酵液溶氧水平，但在菌體發(fā)酵密度達(dá)到一定量時(shí)，這些手段的效果會(huì)降低。VHb具有高的氧吸附和解離速率常數(shù)[10]，可以增加菌株氧利用效率，減少菌株乙酸生成，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，縮短發(fā)酵周期，因，構(gòu)建的共表達(dá)VHb工程菌株可提高大腸桿菌對(duì)氧的利用和對(duì)低溶氧環(huán)境的耐受能力，在SHMT高密度發(fā)酵產(chǎn)生中將會(huì)更加有利。

本研究構(gòu)建的ptsG基因缺失工程菌株及共表達(dá)VHb工程菌株在發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)特性及SHMT表達(dá)水平有待進(jìn)一步分析，期望能夠簡(jiǎn)化發(fā)酵工藝操作，提高SHMT生產(chǎn)水平，降低L-絲氨酸生產(chǎn)成本。