司闊林，徐捐捐，岳田利，袁亞宏，郭春鋒

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于自然界中[1]。GABA作為哺乳動(dòng)物大腦中的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[2]，具有降血壓[3]、抗癲癇[4]、抗抑郁[5]、鎮(zhèn)靜[6]、預(yù)防糖尿病[7]、預(yù)防肥胖[8]和促進(jìn)睡眠[9]等功能。由于其潛在的生物活性，富含GABA的功能性新食品的開(kāi)發(fā)受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。生產(chǎn)GABA的方法主要包括化學(xué)合成法和生物合成法[10]，由于化學(xué)合成法存在生產(chǎn)成本高、反應(yīng)不容易控制、副產(chǎn)物成分復(fù)雜且有害等缺點(diǎn)，因化學(xué)合成的GABA很難用于食品工業(yè)[11]，而生物合成法則具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、安全性高等優(yōu)點(diǎn)[12]，具有較大的生產(chǎn)食品級(jí)GABA的潛力。

多種微生物都可以合成GABA，包括細(xì)菌[13]、真菌[14]和酵母[15]，而乳酸菌作為安全的食品微生物，已廣泛用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)中，其GABA產(chǎn)生能力研究也最為廣泛[16]。外，部分乳酸菌菌株還具有免疫調(diào)節(jié)、抑制病原菌以及控制腸道菌群平衡等生物活性[17]。從日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品、韓國(guó)黑莓汁、朝鮮發(fā)酵泡菜、西班牙奶酪和意大利奶酪中分別分離出的副干酪乳桿菌NFRI 7415[18]、短乳桿菌GABA 100[19]、布氏乳桿菌MS[20]、乳酸乳球菌CECT 8184[21]和植物乳桿菌C48[22]均已被報(bào)道可產(chǎn)GABA。王興潔等[16]從四川泡菜中篩選出1 株產(chǎn)GABA的植物乳桿菌W1-9，以黃瓜汁為發(fā)酵培養(yǎng)基，其GABA產(chǎn)量可達(dá)到7.62 g/L；黃德娜等[23]從獨(dú)山鹽酸菜液中篩選出1 株產(chǎn)GABA的棉籽糖乳球菌Y-12，其GABA產(chǎn)量為4.06 g/L；Komatsuzaki等[18]從日本發(fā)酵水產(chǎn)品分離獲得了1 株產(chǎn)GABA的副干酪乳桿菌NFRI 7415，其在底物濃度為500 mmol/L時(shí)，GABA產(chǎn)量為302 mmol/L；Li Haixing等[24]從中國(guó)泡菜中分離獲得了1 株高產(chǎn)GABA的短乳桿菌NCL912，其在補(bǔ)料分批發(fā)酵之后，GABA產(chǎn)量高達(dá)102.78 g/L左右；Shan等[25]從內(nèi)蒙古發(fā)酵乳中分離獲得了1 株產(chǎn)GABA的副干酪乳桿菌NDC75017，其GABA產(chǎn)量最高可達(dá)314.56 mg/100 g。

泡菜和酸菜作為中國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜，其中含有多種乳酸菌，而關(guān)于中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜來(lái)源的布氏乳桿菌產(chǎn)GABA的特性還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在對(duì)前期從泡菜和酸菜中分離獲得的2 株布氏乳桿菌產(chǎn)GABA的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高其GABA產(chǎn)量，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高產(chǎn)GABA的功能性微生態(tài)制劑或富含GABA的發(fā)酵食品奠定理論基礎(chǔ)和提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

布氏乳桿菌S37和布氏乳桿菌J68篩選自中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜，經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，保藏于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院健康食品制造與安全控制實(shí)驗(yàn)室。

M R S 肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司；GABA標(biāo)準(zhǔn)品（99%）、L-谷氨酸鈉（L-monosodium glutamate，L-MSG）、丹磺酰氯 美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；甲醇、丙酮、葉酸、L-半胱氨酸、氯化錳（均為色級(jí)） 中國(guó)上海Aladdin公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自四川西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

1.3.2 布氏乳桿菌產(chǎn)GABA發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA產(chǎn)量和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

發(fā)酵溫度35 ℃，MRS肉湯培養(yǎng)基中L-MSG濃度400 mmol/L，初始pH 5.0，考察發(fā)酵時(shí)間（24、48 h和72 h）對(duì)GABA產(chǎn)量的影響。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC測(cè)定發(fā)酵液中的GABA含量，同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液在600 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD600nm），記錄細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.3.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)GABA產(chǎn)量和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

發(fā)酵時(shí)間72 h，MRS肉湯培養(yǎng)基中L-MSG濃度400 mmol/L，初始pH 5.0，考察發(fā)酵溫度（25、30、35 ℃和40 ℃）對(duì)GABA產(chǎn)量的影響。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC測(cè)定發(fā)酵液中的GABA含量，同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液OD600nm，記錄細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.3.2.3 L-MSG濃度對(duì)GABA產(chǎn)量、L-MSG轉(zhuǎn)化率和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

發(fā)酵時(shí)間72 h，發(fā)酵溫度35 ℃，初始pH 5.0，考察底物濃度（50、100、200、400 mmol/L和600 mmol/L）對(duì)GABA產(chǎn)量的影響。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC測(cè)定發(fā)酵液中的GABA含量，同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液OD600nm，記錄細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。L-MSG轉(zhuǎn)化率的計(jì)公式如下：

式中：A為發(fā)酵液中GABA最終濃度；B為發(fā)酵液中L-MSG初始添加濃度。

1.3.2.4 初始pH值對(duì)GABA產(chǎn)量和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

發(fā)酵時(shí)間72 h，發(fā)酵溫度35 ℃，MRS肉湯培養(yǎng)基中L-MSG濃度400 mmol/L，考察初始pH值（4.5、5.0、5.5和6.0）對(duì)GABA產(chǎn)量的影響。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC測(cè)定發(fā)酵液中的GABA含量，同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液OD600nm，記錄細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.3.3 影響GABA產(chǎn)量的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在布氏乳桿菌產(chǎn)GABA最優(yōu)發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)2 株布氏乳桿菌產(chǎn)GABA影響的單因試驗(yàn)結(jié)果，篩選出影響合成GABA的主要因，即葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳添加量，并確定了其合適的水平范圍。以GABA產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳添加量為考察因，進(jìn)行3因3水平 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，因與水平見(jiàn)表1。

表 1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables use for Box-Behnken design

1.3.4 GABA含量測(cè)定

參照Liu Sijin等[26]HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中GABA含量。首先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行前處理，發(fā)酵液于8 000h g離心10 min，取上清液，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取50 μL品，與0.5 mL 20 g/L碳酸氫鈉溶液和0.5 mL 5 g/L丹磺酰氯丙酮溶液混合，渦旋混勻30 s，60 ℃避光溫育30 min，然后向反應(yīng)混合物中加入100 μL氨水以除去過(guò)量的衍生試劑，最后添加甲醇將體積調(diào)至2 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，取20 μL品進(jìn)行HPLC分析。空白對(duì)照為不接菌的含有50 mmol/L L-MSG的MRS肉湯培養(yǎng)基。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)表示為f s。利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用一維方差分析統(tǒng)計(jì)組間的顯著性差異，組間多重比較采用Tukey法，P＜0.05，差異顯著。使用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)并進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析

圖 1 GABA標(biāo)準(zhǔn)品（A）和發(fā)酵液樣品（B）的HPLC分析圖譜Fig. 1 HPLC chromatograms of GABA standard (A) and fermentation broth sample (B)

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA產(chǎn)量和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖 2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA產(chǎn)量（A）和細(xì)胞生長(zhǎng)（B）的影響Fig. 2 Effect of fermentation time on GABA yield (A) and cell growth (B)

由圖2A可知，在24～72 h內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，2 株布氏乳桿菌的GABA產(chǎn)量均逐漸增加。發(fā)酵時(shí)間在前48 h內(nèi)，GABA產(chǎn)量增加迅速，在48～72 h之間產(chǎn)量增加緩慢，但增長(zhǎng)仍顯著（P＜0.05）。由圖2B可知，布氏乳桿菌J68在發(fā)酵48 h后依然顯著增長(zhǎng)，而布氏乳桿菌S37在發(fā)酵第48小時(shí)已經(jīng)進(jìn)入了穩(wěn)定生長(zhǎng)期，但依然可以將培養(yǎng)基中剩余的L-MSG緩慢轉(zhuǎn)化為GABA。由可知，布氏乳桿菌產(chǎn)GABA可能并不是嚴(yán)格依賴于細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且選擇72 h作為后續(xù)產(chǎn)GABA的發(fā)酵時(shí)間。

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)GABA產(chǎn)量和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)布氏乳桿菌GABA產(chǎn)量和細(xì)胞生物量有較大影響。由圖3可知，2 株布氏乳桿菌的GABA產(chǎn)量和菌體量的變化趨勢(shì)基本一致，即在25～35 ℃之間，隨著溫度的升高而增加，并且在35 ℃達(dá)到最高值，隨后隨著溫度的升高而降低。對(duì)于S37，在不同的發(fā)酵溫度（30、35、40 ℃）下，GABA產(chǎn)量未發(fā)現(xiàn)顯著差異，且菌體量有著較小的差異，并且發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)，GABA產(chǎn)量達(dá)到最高。對(duì)于J68，盡管菌體量在30 ℃和35 ℃之間沒(méi)有顯著差別，且超過(guò)35 ℃時(shí)菌體量開(kāi)始緩慢下降，而其GABA產(chǎn)量在35 ℃略高于40 ℃，明顯高于30 ℃。這些結(jié)果表明，GABA產(chǎn)量在一定情況下取決于菌株的生物量，后續(xù)選擇35 ℃作為最適發(fā)酵溫度。這與之前的研究結(jié)果基本一致，李海星[27]優(yōu)化從中國(guó)泡菜分離的短乳桿菌NCL912發(fā)酵條件之后的最適溫度為32 ℃，Lu Xiaoxue等[28]優(yōu)化從中國(guó)傳統(tǒng)卷心菜泡菜分離的乳酸乳球菌發(fā)酵條件發(fā)現(xiàn)最適溫度是34 ℃，而且Dhakal等[29]也報(bào)道稱乳酸菌生長(zhǎng)細(xì)胞產(chǎn)GABA的最適發(fā)酵溫度在30～40 ℃之間。

圖 3 發(fā)酵溫度對(duì)GABA產(chǎn)量（A）和細(xì)胞生長(zhǎng)（B）的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on GABA yield (A) and cell growth (B)

2.2.3 L-MSG濃度對(duì)GABA產(chǎn)量、L-MSG轉(zhuǎn)化率和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

在一些乳酸菌中，L-谷氨酸或其鈉鹽可在谷氨酸脫羧酶（EC 4.1.1.15）作用下發(fā)生不可逆的脫羧反應(yīng)從而合成GABA[30]。由圖4A可知，L-MSG濃度在50～400 mmol/L時(shí)，2 株布氏乳桿菌的GABA產(chǎn)量逐漸增加，底物濃度為400 mmol/L時(shí)，GABA產(chǎn)量達(dá)到最高，分別為233.9 mmol/L 和159.3 mmol/L，對(duì)應(yīng)的L-MSG轉(zhuǎn)化率分別為58.5%和39.8%，當(dāng)L-MSG濃度在400～600 mmol/L時(shí)，GABA產(chǎn)量及L-MSG轉(zhuǎn)化率均顯著降低。由圖4B可知，隨著L-MSG濃度的增加，對(duì)應(yīng)的L-MSG轉(zhuǎn)化率會(huì)持續(xù)降低。由圖4C可知，當(dāng)L-MSG濃度超過(guò)100 mmol/L時(shí)，菌體量開(kāi)始減少。因GABA產(chǎn)量的降低可能是由于高濃度的L-MSG抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)和谷氨酸脫羧酶活性[18]。上述結(jié)果表明，將底物高效轉(zhuǎn)化為GABA不僅需要高菌體量，還需要適當(dāng)?shù)某跏糒-MSG濃度，所以綜合考慮，布氏乳桿菌產(chǎn)GABA的最佳L-MSG濃度為400 mmol/L。

圖 4 L-MSG濃度對(duì)GABA產(chǎn)量（A）、L-MSG轉(zhuǎn)化率（B）和 細(xì)胞生長(zhǎng)（C）的影響Fig. 4 Effect of L-MSG concentration on GABA yield (A), L-MSG conversion rate (B) and cell growth (C)

2.2.4 初始pH值對(duì)GABA產(chǎn)量和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

微生物生物合成 GABA受到嚴(yán)格的pH值調(diào)控，而且在發(fā)酵過(guò)程中具有顯著作用[28-29]，保持乳酸菌谷氨酸脫羧酶活性的最佳pH值在4.5～6.0之間[31-32]。由圖5可知，初始pH值對(duì)GABA產(chǎn)量和細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著影響。當(dāng)pH值低于或高于5.0時(shí)，GABA產(chǎn)量和細(xì)胞生物量均迅速下降，即布氏乳桿菌產(chǎn)GABA的最佳初始pH值為5.0，這與先前關(guān)于乳酸菌生長(zhǎng)細(xì)胞生產(chǎn)GABA的最佳初始pH值的報(bào)道一致[18,20,24]。然而由于在通過(guò)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白攝取底物后，細(xì)胞質(zhì)脫羧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子的消耗以及細(xì)胞外谷氨酸交換到GABA[29]等更為堿性的底物，發(fā)酵液的pH值會(huì)隨著發(fā)酵先下降后略有增加[33]。因，通過(guò)控制發(fā)酵過(guò)程中pH值，GABA生產(chǎn)效率將會(huì)更大提高。

圖 5 初始pH值對(duì)GABA產(chǎn)量（A）和細(xì)胞生長(zhǎng)（B）的影響Fig. 5 Effect of initial pH on GABA yield (A) and cell growth (B)

2.3 重要營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)化

表 2 葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳添加量對(duì)菌株GABA產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of addition of folic acid, L-cysteine and manganese chloride on GABA yield

在確定最優(yōu)的發(fā)酵條件之后，通過(guò)篩選確定了葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳為促進(jìn)菌株GABA產(chǎn)生的關(guān)鍵化學(xué)添加物。將其按照不同水平添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在確定的最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。如表2所示，葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳在適當(dāng)質(zhì)量濃度范圍下均能顯著提高菌株GABA產(chǎn)量。當(dāng)葉酸添加量低于10 mg/L 時(shí)，GABA產(chǎn)量隨添加量增加而升高，當(dāng)添加量超過(guò)10 mg/L時(shí)，GABA產(chǎn)量開(kāi)始下降；當(dāng)L-半胱氨酸添加量低于1.4 g/L時(shí)，菌株的GABA產(chǎn)量隨添加量增加而升高，當(dāng)添加量超過(guò)1.4 g/L時(shí)，GABA產(chǎn)量保持穩(wěn)定不變；當(dāng)氯化錳添加量低于0.6 g/L時(shí)，菌株GABA產(chǎn)量隨添加量增加而升高，當(dāng)添加量超過(guò)0.6 g/L時(shí)，GABA產(chǎn)量開(kāi)始下降。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.2.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表 3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experiment results

2.3.2.2 模型的建立與方差分析

利用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表3中數(shù)據(jù)分別進(jìn)行回歸擬合分析，結(jié)果如表4、5所示。兩個(gè)模型的P值均小于0.000 1，失擬項(xiàng)P值均大于0.05，表明回歸模型極顯著。預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間有很好的相關(guān)性，R2值分別為0.990 5和0.992 8。由F值可知，各因?qū)闟37產(chǎn)GABA的影響大小為：氯化錳添加量（C）＞葉酸添加 量（A）＞L-半胱氨酸添加量（B）；而對(duì)菌株J68產(chǎn)GABA的影響大小為：氯化錳添加量（C）＞L-半胱氨酸添加量（B）＞葉酸添加量（A）。經(jīng)回歸擬合，分別得到2 株菌Y1和Y2的次多元回歸方程：

表 4 菌株S37 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model for GABA yield of strain S37

表 5 菌株J68 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析Table 5 Analysis of variance of quadratic polynomial model for GABA yield of strain J68

利用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行極值求取分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)于菌株S37，葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳的最優(yōu)添加量分別為8.37 mg/L、0.94 g/L和 0.60 g/L，對(duì)于菌株J68，葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳最優(yōu)添加量分別為10.16 mg/L、0.97 g/L和0.60 g/L。模型預(yù)測(cè)的最高產(chǎn)量分別為323.3 mmol/L和261.4 mmol/L。在最佳水平下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌株S37和J68的實(shí)際GABA產(chǎn)量分別為312.6 mmol/L和251.2 mmol/L，對(duì)應(yīng)的L-MSG轉(zhuǎn)化率分別為78.2%和62.8%，與預(yù)測(cè)值基本一致，表明響應(yīng)面試驗(yàn)建立的模型具有較高的準(zhǔn)確度。與未添加上述物質(zhì)的對(duì)照培養(yǎng)基相比，2 株菌的GABA產(chǎn)量分別提高了34%和58%。盡管在發(fā)酵過(guò)程中未使用發(fā)酵罐控制發(fā)酵系統(tǒng)的pH值，也未采用分批補(bǔ)料發(fā)酵模式，但2 株菌的GABA產(chǎn)量也高于大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的乳酸菌的GABA產(chǎn)量。由于優(yōu)化后布氏乳桿菌S37的GABA產(chǎn)量顯著高于氏乳桿菌J68，因布氏乳桿菌S37更具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

本研究以中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜來(lái)源的2 株布氏乳桿菌為研究對(duì)象，研究不同發(fā)酵條件對(duì)布氏乳桿菌GABA產(chǎn)量和菌株生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明2 株菌S37和J68具有相似的變化趨勢(shì)，且其產(chǎn)GABA的最優(yōu)發(fā)酵條件一致：發(fā)酵時(shí)間72 h、發(fā)酵溫度35 ℃、底物L(fēng)-MSG濃度 400 mmol/L、初始pH 5.0。培養(yǎng)基中添加葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳能顯著提高2 株菌的GABA產(chǎn)量，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其添加量后，其GABA產(chǎn)量分別為 312.6 mmol/L和251.2 mmol/L，對(duì)應(yīng)的L-MSG轉(zhuǎn)化率分別為78.2%和62.8%。布氏乳桿菌S37具有更高的GABA產(chǎn)量，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的潛力。