范潔，詹三華，袁孔現(xiàn)

作者單位：銅陵市人民醫(yī)院藥學部，安徽 銅陵 244000

阿司匹林和氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療已成為目前急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）和經(jīng)皮冠狀動脈介入術（percutaneous coronary intervention，PCI）的標準化治療方案。然而，各種遺傳以及臨床的因素會導致氯吡格雷療效出現(xiàn)個體差異［1］。其中以氯吡格雷抵抗研究較多，而對出現(xiàn)出血、胃腸道損害等不良反應的研究較少。不良反應的產(chǎn)生亦是病人依從性降低，進而導致心血管事件發(fā)生的重要影響因素。

氯吡格雷為前體藥物，口服后吸收快速但不完全，吸收率＞50%。氯吡格雷吸收后廣泛經(jīng)肝臟代謝，其中約85%經(jīng)酯酶水解為非抗血小板活性的羧酸氯吡格雷（SR26334），約15%進行硫醇化的代謝活化［2］。代謝活化過程主要由CYP2C19 基因編碼的肝細胞色素（CYP）450 和對氧磷酶1（PON1）等介導，活化后的代謝產(chǎn)物與血小板膜上的P2Y12受體結合，會有效阻斷二磷酸腺苷（ADP）與其結合，最終抑制血小板活化和聚集［3-4］。若參與編碼此過程有關蛋白的基因發(fā)生遺傳變異，可能會引起活性藥物濃度差異，進而會影響到藥物療效。

CYP2C19 基因作為影響氯吡格雷代謝最重要的基因，其遺傳變異已引起人們的極大重視。CYP2C19*2突變型是CYP2C19第5外顯子在第681位的突變導致的5’端40 bp 堿基缺失，從而改變了mRNA 的閱讀框架并產(chǎn)出無功能的CYP2C19*2酶［5］；CYP2C19*3突變型是第4外顯子在第636位的突變造成終止密碼子提前，產(chǎn)生出了代謝功能極低的CYP2C19*3 酶［5］。我國人群中CYP2C19*2、CYP2C19*3 分布的頻率分別約為24%～25%、2%～3%［6］，也是亞洲人群中最常見的突變位點［7］。除此之外，對氧磷酶1（PON1）作為參與氯吡格雷第二步生物轉化中的代謝的一種限速酶，其基因啟動子區(qū)域功能性位點突變（126C＞G）亦會影響PON1 基因表達水平，從而改變PON1 酶活性［8］，可能也是影響氯吡格雷血藥濃度及治療效果的關鍵因素。為此，本文以PCI術后行阿司匹林和氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療病人為研究對象，對不同基因型與氯吡格雷及非抗血小板活性代謝產(chǎn)物羧酸氯吡格雷（SR26334）血藥濃度之間的關系進行探討，試圖進一步理解以上相關基因多態(tài)性與氯吡格雷藥物抗血小板聚集效果之間的聯(lián)系，以便為該類病人合理用藥方案提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 納入對象選取2017年12月至2018年5月在銅陵市人民醫(yī)院接受冠脈造影檢查和PCI術治療的住院病人51例，診斷為冠心病（CHD）或急性心肌梗死，年齡范圍為44～91歲。接受氯吡格雷+阿司匹林的雙聯(lián)抗血小板治療（圍手術期間均給予阿司匹林100 mg/d+氯吡格雷負荷劑量75 mg/d）。病人或其近親屬對本研究知情同意，簽署了知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 觀察指標及隨訪納入符合條件的病人，詳細記錄病人臨床基本特征（如性別、年齡、吸煙史、飲酒史），疾病史（如高血壓病史、糖尿病病史等），合并用藥以及PCI相關信息（如病變血管數(shù)等）。通過再入院記錄、門診以及電話隨訪病人術后出血事件。隨訪半年內所發(fā)生的出血事件。根據(jù)其嚴重程度分為輕度出血（包括皮膚、鼻腔、牙齦等出血）、中度出血（消化道出血）、重度出血（顱內出血等）。心血管事件（MACE）包括支架植入后心絞痛、支架內再狹窄、再發(fā)心梗等。

1.3 試劑氯吡格雷化學對照品（Clopidogrel，European Pharmacopoeia Reference Standard，ID：001C8D）、羧酸氯吡格雷化學對照品（Clopidogrel Carboxylic Acid，Vaughan Ontario L4K 4C7 Canada，Lot：1427-057A5）、艾司唑侖化學對照品（Estazolam，國家麻醉品實驗室，1218-9802）。甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚均為色譜純（美國TEDIA 公司），KH2PO4和H3PO4為分析純試劑，水為經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾注射用水?？瞻籽獫{由本院血庫提供的健康獻血者血漿。

1.4 儀器高效液相色譜儀，日本島津生產(chǎn)，型號SPD-20AV。電動離心機，常州醫(yī)科諾儀器有限公司，型號800D。超低溫冰箱，日本三洋電機生物醫(yī)學有限公司生產(chǎn)，型號MDF-382E。電熱恒溫水浴鍋，上海躍進醫(yī)療儀器廠，型號XMTD-204。焦磷酸測序儀，凱杰公司生產(chǎn)，型號PyroMark*Q24 MDx。

1.5 實驗方法

1.5.1 氯吡格雷及SR26334血藥濃度測定 病人服藥3 d后，在第4天服藥30 min后，靜脈采血2 mL入EDTA抗凝真空采血管，4 000 r/min離心10 min得血漿樣本，經(jīng)甲基叔丁基醚萃取、N2吹干后，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法（色譜柱：KromasilTM 100A C18（150 mm LD×4.6 mm ID，5μm），流動相：10 mmol/L KH2PO4溶液（含0.25% H3PO4）-乙腈（50∶50），流速：1.0 mL/min，檢測波長：220 nm，柱溫：40 ℃），并以艾司唑侖為內標測定氯吡格雷及SR26334的血漿藥物濃度。

1.5.2 基因檢測 按照核酸提取純化試劑盒（長沙三濟生物科技有限公司）說明書步驟提取基因組DNA，采用焦磷酸測序技術檢測CYP2C19*2（681G＞A）、CYP2C19*3（636G＞A）、PON1（126C＞G）三個位點。根據(jù)CYP2C19基因突變而引起酶代謝活性的不同，把攜有野生型基因（*1/*1）歸為快代謝型（EM），突變雜合型（*1/*2、*1/*3）為中間代謝型（IM），突變純合型（*2/*2、*2/*3、*3/*3）為弱代謝型（PM）。

1.6 統(tǒng)計學方法計量資料以表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差（ANOVA-Bonferroni）分析。遺傳平衡采用Hardy-Weinberg平衡定律分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗。采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HPLC 色譜圖分別取標準溶液、空白血漿、空白血漿+標準品、樣品血漿經(jīng)預處理后進樣檢測，發(fā)現(xiàn)SR26334 保留時間為1.8 min（峰1）、內標化合物艾司唑侖保留時間為4.2 min（峰3）、氯吡格雷保留時間為7.4 min（峰2），基本無雜質峰干擾。色譜圖中SR26334、艾司唑侖、氯吡格雷能得到基線分離且與各化學對照品保留時間一致，在此實驗條件下所測得結果可以反映血藥濃度，見圖1。

2.2 CYP2C19、PON1 基因型及頻率分布CYP2C19*2（681G＞A）、CYP2C19*3（636G＞A）、PON1（126C＞G）等位基因、基因型頻率分布（表1）。達到Hardy-Weinberg遺傳平衡（P＞0.05），具有群體代表性。

表1 CYP2C19和PON1基因型及等位基因的頻率分布

圖1 氯吡格雷和SR26334 HPLC色譜圖：A為標準品色譜，B為空白血漿色譜，C為空白血漿+標準品色譜，D為樣本血漿色譜

2.3 氯吡格雷CYP2C19基因分型與體內血藥濃度之間的關系氯吡格雷活性硫醇代謝物存在4種異構體，其中有活性的為H4。H4極不穩(wěn)定，在空氣中易氧化，衍生化后的MP-H4穩(wěn)定性大大提高［9］。但體內MP-H4血藥濃度極低，且半衰期只有0.5 h［10］，必須要使用HPLC-MS/MS 法，對檢測技術要求很高。而相同條件下，體內SR26334 血藥濃度是活性代謝產(chǎn)物的千倍，常規(guī)RP-HPLC 法即可檢測SR26334。病人第4 天服藥30 min 后靜脈采血，測定氯吡格雷、SR26334血藥濃度。CYP2C19基因分型對血藥濃度的影響（表2）及各基因型之間血藥濃度的比較（圖2）：CYP2C19基因分型與SR26334相關性較好，快代謝型、中代謝型與弱代謝型SR26334 血藥濃度相比較，有明顯增加趨勢?？齑x型與弱代謝型SR26334血藥濃度之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 CYP2C19基因分型對血藥濃度的影響

圖2 CYP2C19不同基因型之間血藥濃度的比較

2.4 氯吡格雷PON1（126C＞G）基因型與體內血藥濃度之間的關系PON1（126C＞G）CC 比CG，CC 比GG，CG 比GG 基因型組Bonferroni 矯正后均P＞0.05。但PON1（126C＞G）野生型（CC 型）與突變型（CG+GG 型）病人SR26334 血藥濃度：（1.45±0.63）μg/mL 比（1.09±0.32）μg/mL，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.047），見圖3。

2.5 SR26334 峰濃度與終點事件相關性分析本實驗共收集到符合條件的病人51 例。隨訪期間27例病人術后良好，為正常組，15 例病人出現(xiàn)了心血管事件（MACE），分為MACE 組，其中心源性死亡1例，支架內再狹窄7 例，心絞痛再發(fā)7 例。9 例在隨訪期間出現(xiàn)了出血事件，成為出血組。分別測定51例病人穩(wěn)態(tài)下的血藥峰濃度。

圖3 PON1（126C＞G）不同基因型之間血藥濃度的比較

測定結果：正常組（n＝25）血藥濃度為（1.51±0.48）μg/mL，MACE 組（n＝15）血藥濃度為（1.06±0.65）μg/mL，出血組（n＝9）血藥濃度為（1.85±0.32）μg/mL。正常組比MACE組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），正常組比出血組P＞0.05（均經(jīng)Bonferroni 校正）。見圖4。

圖4 三組之間SR26334血藥濃度比較的箱式圖

2.6 根據(jù)基因型進行分組時MACE及出血事件的發(fā)生率 各基因型組MACE及出血事件的發(fā)生率見表3，4。經(jīng)統(tǒng)計比較，各基因型組MACE 及出血事件的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 CYP2C19基因型與終點事件相關性分析

表4 PON1基因型與終點事件相關性分析/例（%）

3 討論

氯吡格雷作為血小板P2Y12 受體的拮抗劑，需要人體中經(jīng)過肝臟代謝轉化為活性代謝產(chǎn)物以發(fā)揮其藥理作用［11］。由于其代謝途徑復雜，包括病人體重、年齡，代謝途徑中關鍵酶的基因多態(tài)性，以及聯(lián)合用藥等因素可能影響該藥的抗血小板作用［12］。目前對可能影響氯吡格雷體內代謝的CYP2C19*2、CYP2C19*3和PON1等基因研究較多。2010年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）在氯吡格雷的藥物說明書中增加了“黑框警告”，提醒醫(yī)生對病人進行CYP2C19*2 和*3 等位基因的檢測［13］。但是對于這兩項結果的實際臨床意義以及就此作出治療方案的調整尚未明確。服用氯吡格雷后，SR26334 在血液循環(huán)中具有較高濃度，SR26334 半衰期約為7～8 h［14］，使得采用常規(guī)液相色譜-紫外檢測器聯(lián)用檢測SR26334成為可能，增加了該檢測方法的可推廣性。此外，有研究表明，血漿SR26334最大濃度及AUC與服用劑量成線性關系［15］，可為血漿SR26334 濃度檢測的必要性提供支持。本研究通過考察CYP2C19*2、CYP2C19*3 和PON1 基因多態(tài)性對SR26334 血藥濃度影響，以及對終點事件的影響，以便為臨床個體化用藥方案設計提供更多的方法與有效數(shù)據(jù)支持。

研究報道，CYP2C19*2和*3突變?yōu)楣δ苋笔У任换?，使CYP2C19 酶活性降低，氯吡格雷代謝減弱，甚至導致氯吡格雷抵抗［16］。人對氧磷脂酶1（PON1）是一種鈣依賴性的芳香酯水解酶，可以代謝氯吡格雷、阿司匹林等物質［17］。納入本研究的51例病人，接受了氯吡格雷+阿司匹林的雙聯(lián)抗血小板治療（口服氯吡格雷負荷劑量300 mg+維持劑量75 mg/d）。進行了CYP2C19*3 和PON1 基因檢測以及測定了氯吡格雷及非抗血小板活性代謝產(chǎn)物SR26334 血藥濃度。結果顯示，CYP2C19 快代謝型與弱代謝型SR26334血藥濃度之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），PON1（126C＞G）野生型（CC型）與突變型（CG+GG 型）病人SR26334 峰濃度間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。從而提示，在病人未接受氯吡格雷基因分型前，SR26334 血藥濃度對于氯吡格雷抗血小板治療方案的調整以及藥物療效的評價具有一定的指導意義。SR26334血藥峰濃度與心血管事件的發(fā)生差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但與出血事件的發(fā)生差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能出血事件的發(fā)生與聯(lián)用其他藥物（如華法林、他汀類）、非抗血小板活性代謝產(chǎn)物SR26334 的藥理作用、以及伴隨疾?。ㄈ绺哐獕?、糖尿病）等，都有可能導致術后氯吡格雷所致出血，還需進一步研究考察。本研究結果顯示CYP2C19 基因型與終點事件的發(fā)生無明顯相關（P＞0.05），可能與參與氯吡格雷代謝途徑的基因較多有關，包括藥物吸收、代謝在內等多種復雜因素的影響。