馬耀增，張茂鋒，劉洪波，王鵬，王宏偉

作者單位：洛陽市第一人民醫(yī)院普外二科，河南 洛陽 471002

乳腺癌多發(fā)于女性，極少數(shù)的男性也有發(fā)生，其是起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，原發(fā)性的乳腺癌致死率不高，乳腺癌轉(zhuǎn)移是其致死的重要原因，乳腺癌轉(zhuǎn)移機制較為復(fù)雜，乳腺癌細胞從原發(fā)部位脫落以后，進入淋巴管或血管到達新的組織器官形成轉(zhuǎn)移灶，這一過程中乳腺癌細胞侵襲、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是關(guān)鍵［1-2］。Wnt 信號通路在腫瘤中過度激活，抑制其激活后可以降低腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和增殖能力［3］。性別決定區(qū)Y 框蛋白9（sex dtermining region Y-box 9，SOX9）是一種癌基因，在乳腺癌等多種腫瘤中高表達，沉默其表達可以抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力［4-5］。有研究顯示，SOX9 位于Wnt 信號通路的下游，Wnt 信號通路激活后可以上調(diào)SOX9 的表達，發(fā)揮促腫瘤作用［6］。目前對于SOX9在乳腺癌細胞侵襲、遷移中的作用尚不明確，本實驗自2017年3月至2018年3月以乳腺癌細胞MDA-MB-436為體外研究對象，探討SOX9 對乳腺癌細胞侵襲遷移能力的影響及Wnt 信號通路的調(diào)控作用，以期為明確乳腺癌轉(zhuǎn)移機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料乳腺癌細胞MDA-MB-436 購自上海酶研生物科技有限公司；Wnt信號通路抑制劑XAV939購自美國MedChemExpress；SOX9抗體、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體、c-myc抗體購自Santa Cruz Biotechnology；基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotease，MMP-2）抗體、上皮性鈣黏附素（E-cadherin）抗體、神經(jīng)性鈣黏附素（N-cadherin）抗體購自美國Cell signaling Technology；SOX9 siRNA 慢病毒由上海銳賽生物技術(shù)有限公司構(gòu)建包裝；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

MDA-MB-436 細胞培養(yǎng)條件為：37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱，飽和濕度。細胞密度為90%時，添加0.25%的胰蛋白酶將細胞消化后，接種在細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 Wnt 信號通路抑制劑對乳腺癌細胞增殖活性影響 MDA-MB-436 細胞濃度調(diào)整為每100 μL 的細胞懸浮液中含有3 000個細胞，種植到96孔板中，每個孔內(nèi)加入100 μL，孵育過夜以后，把上清液吸除，添加含有0、5、10、20、40 μmol/L的Wnt信號通路抑制劑XAV939 的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在實驗孔中加入20 μL的噻唑藍（MTT）結(jié)合4 h以后，將MTT 溶液吸除，加入二甲基亞砜（DMSO）將結(jié)晶溶解以后，選取570 nm，用酶標儀檢測OD 值。以0 μmol/L 作為對照，以不加細胞的孔作為空白孔，分析細胞抑制率，設(shè)置0 μmol/L作用組抑制率為0，分析其他濃度梯度抑制率變化。

1.3 抑制Wnt信號通路對乳腺癌細胞中SOX9、βcatenin、c-myc 蛋白表達影響MDA-MB-436 細胞用0、20 μmol/L的XAV939處理24 h以后，按照每個6 孔板中加入120 μL 的蛋白裂解液將細胞裂解以后，以14 000g離心約5 min后，吸取上清，把沉淀棄掉。取10 μL的蛋白用于二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測，其余樣品中加入5×上樣緩沖溶液，置于水浴中煮沸5 min。分別配制9%的分離膠及5%的濃縮膠，把預(yù)先準備好的蛋白加入到聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣孔內(nèi)，每個孔中加入20 μg蛋白，常規(guī)方法電泳以后，進行轉(zhuǎn)膜。PVDF膜靠近正極，凝膠靠近負極，0.25 A電流進行轉(zhuǎn)膜約180 min。以TBST（Tris-HCl 緩沖鹽溶液+Tween）洗滌以后，把聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜放在含有封閉液（5%牛血清白蛋白）的平皿中孵育2 h，再與SOX9、β-catenin、c-myc 抗體在4 ℃過夜孵育后，再放在二抗反應(yīng)液中孵育2 h。ECL 發(fā)光，顯影后，分析條帶的光密度值，以每組的GAPDH 作為參照。SOX9、β-catenin、c-myc抗體以1∶200、1∶400、1∶400稀釋，二抗以1∶5 000稀釋。

1.4 實驗分組和慢病毒感染MDA-MB-436 細胞分成4組，依次為對照組、XAV939、SOX9-si、SOX9-si＋XAV939，對照組、XAV939 用感染陰性對照慢病毒的MDA-MB-436 細胞，SOX9-si、SOX9-si＋XAV939用感染SOX9 siRNA 慢病毒的MDA-MB-436 細胞。XAV939、SOX9-si＋XAV939 在實驗開始0 h 時在細胞培養(yǎng)液中添加20 μmol/L 的XAV939。MDA-MB-436 細胞慢病毒感染步驟簡述如下：細胞密度為40%時，在細胞中加入慢病毒顆粒，調(diào)整慢病毒感染復(fù)數(shù)為20，感染12 h后，把細胞培養(yǎng)板取出，添加新鮮的培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d以后，用puromycin篩選穩(wěn)定感染的細胞株擴大培養(yǎng)。

1.5 干擾效果檢測用Realtime PCR 和蛋白質(zhì)印跡法檢測干擾效果，蛋白質(zhì)印跡法步驟同上。Realtime PCR 步驟如下：將對照組、SOX9-si 細胞用冰預(yù)冷的PBS 洗滌后，按照每個6 孔板中加入1mL 的TRIZOL 裂解液把細胞裂解以后，添加1/5體積的氯仿溶液混合離心后，吸取水相層的溶液，加入異丙醇后在室溫沉淀RNA，離心后，用75%的乙醇將RNA 洗滌，晾干后，添加無RNase 水溶解以后，進行cDNA 合成。用M-MLV 和oligo（dT）合成cDNA，步驟同試劑盒說明書。取cDNA，進行Realtime PCR，0.5 μmol/L 的正、反向引物各1 μL、12.5 μL的SYBR Premix TaqTM、1 μL 的cDNA 模板、25 μL 的ddH2O混合后，置于PCR 儀上，程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性30 s 后，進行PCR 反應(yīng)，PCR 共循環(huán)40 次，程序為95 ℃5 s，60 ℃20 s。GAPDH正向引物為5’-AATCCATCACCATCTTCCA-3’，反向引物5’-TGGACTCCACGACGTACTCA-3’。SOX9 正向引物為5’-CATCACCCAGGTCAGCAA-3’，反向引物5’-TGGAGGTTTATAGCTCGG-3’。

1.6 細胞遷移能力檢測細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。取慢病毒感染后的乳腺癌細胞接種到6孔板，接種密度為5×105個/孔，細胞鋪滿以后，槍頭垂直的在底部劃出細痕，添加PBS 將劃落的細胞洗滌，用不含血清的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，按照對照組、XAV939、SOX9-si、SOX9-si＋XAV939 分組處理，在0 h 和24 h 檢測劃痕寬度。細胞遷移率為細胞遷移的距離與劃痕初始寬度的百分比。

1.7 細胞侵襲能力檢測用Transwell 小室檢測細胞侵襲能力變化。取8 μm 的Transwell 小室，添加DMEM稀釋的Matrigel，放置于37 ℃孵育1 h。將對照組、XAV939、SOX9-si、SOX9-si＋XAV939 按照上述方法處理，懸浮于不含血清的培養(yǎng)液中，細胞密度為5×105個/mL，每個小室中加入200 μL的細胞懸浮液，侵襲時間設(shè)置為24 h。將培養(yǎng)板取出以后，用4%的多聚甲醛固定，蘇木素染色以后，在光學顯微鏡下觀察細胞數(shù)目，每組至少選取10個視野。

1.8 細胞中MMP-2和EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin 表達水平檢測將對照組、XAV939、SOX9-si、SOX9-si＋XAV939 按照上述方法處理，培養(yǎng)24 h以后，用蛋白質(zhì)印跡法方法測定細胞內(nèi)MMP-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平變化，步驟同上。

1.9 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 軟件分析，采用±s表示，兩組數(shù)據(jù)用獨立樣本t檢驗；多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Wnt 信號通路抑制劑XAV939 對乳腺癌細胞增殖影響乳腺癌細胞經(jīng)過5、10、20、40 μmol/L 的XAV939 處理以后，乳腺癌細胞抑制率依次升高，XAV939 能夠下調(diào)乳腺癌細胞的增殖活性。20 μmol/L 的XAV939 處理后細胞抑制率接近50%，選用20 μmol/L的XAV939作后續(xù)研究。見表1。

表1 不同濃度的XAV939對乳腺癌細胞增殖影響/（%，）

表1 不同濃度的XAV939對乳腺癌細胞增殖影響/（%，）

2.2 Wnt 信號通路抑制劑對乳腺癌細胞中SOX9表達影響乳腺癌細胞經(jīng)過20 μmol/L 的XAV939處理后，細胞中的SOX9蛋白水平降低，同時細胞中Wnt信號通路關(guān)鍵因子β-catenin、c-myc蛋白水平也降低。XAV939 具有下調(diào)乳腺癌細胞中SOX9 表達水平的作用。見圖1，表2。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法測定XAV939處理后細胞中SOX9蛋白及β-catenin、c-myc蛋白水平

表2 XAV939處理后細胞中SOX9蛋白及β-catenin、c-myc蛋白水平變化/

表2 XAV939處理后細胞中SOX9蛋白及β-catenin、c-myc蛋白水平變化/

2.3 慢病毒感染后對乳腺癌細胞中SOX9 表達影響乳腺癌細胞感染SOX9 siRNA 慢病毒后，細胞中的SOX9蛋白水平和mRNA 水平均降低。構(gòu)建了下調(diào)SOX9的乳腺癌細胞株。見圖2，表3。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法測定慢病毒感染后細胞中SOX9蛋白水平

表3 慢病毒感染后細胞中SOX9蛋白和mRNA水平/

表3 慢病毒感染后細胞中SOX9蛋白和mRNA水平/

2.4 下調(diào)SOX9 對XAV939 處理后的乳腺癌細胞侵襲和遷移能力影響XAV939處理后的乳腺癌細胞侵襲數(shù)目和遷移率均明顯降低，下調(diào)SOX9 后的乳腺癌細胞的侵襲數(shù)目和遷移率也降低。XAV939處理下調(diào)SOX9 后的乳腺癌細胞，細胞的侵襲數(shù)目和遷移率降低更多。下調(diào)SOX9 協(xié)同XAV939 抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移。見表4。

表4 下調(diào)SOX9和XAV939后細胞侵襲和遷移能力變化/

表4 下調(diào)SOX9和XAV939后細胞侵襲和遷移能力變化/

注：與對照組比較，aP＜0.05；與SOX9-si、XAV939比較，bP＜0.05

2.5 下調(diào)SOX9對XAV939處理后的乳腺癌細胞細胞中MMP-2、E-cadherin、N-cadherin 表達影響XAV939處理后的乳腺癌細胞中MMP-2表達水平降低，E-cadherin 表達水平升高，N-cadherin 表達水平降低。下調(diào)SOX9后的乳腺癌細胞中MMP-2、N-cadherin水平也降低，E-cadherin水平升高。XAV939處理下調(diào)SOX9 后的乳腺癌細胞，細胞中MMP-2 蛋白水平降低更多，E-cadherin 蛋白水平升高更多，Ncadherin 蛋白水平也下降更多。下調(diào)SOX9 協(xié)同XAV939 抑制乳腺癌細胞EMT 和合成基質(zhì)降解酶MMP-2。見圖3，表5。

3 討論

SOX9 是目前為止研究最為廣泛的SOX 蛋白家族成員之一，其在人類早期的胚胎發(fā)育中具有重要作用，其突變、重復(fù)后可以引起性別反轉(zhuǎn)、CD 綜合征，后續(xù)的研究表明，SOX9 在心臟、骨骼肌等的發(fā)育中也具有調(diào)控作用，其表達水平異常參與腫瘤的發(fā)生，在乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)SOX9 高表達，并且其參與腫瘤細胞的分化、生長、侵襲等過程［7-12］。本研究表明，下調(diào)SOX9 后的乳腺癌細胞的侵襲遷移能力降低，提示SOX9在乳腺癌轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮促進作用。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測下調(diào)SOX9及XAV939對細胞中MMP-2、Ecadherin、N-cadherin蛋白表達影響

表5 下調(diào)SOX9和XAV939處理后細胞中MMP-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平變化/

表5 下調(diào)SOX9和XAV939處理后細胞中MMP-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平變化/

Wnt 信號通路參與癌癥的發(fā)生過程，其在腫瘤組織中過度激活，對于腫瘤細胞的生長、侵襲等生物學特性均有調(diào)控作用［13-14］。Wnt信號通路是一個進化極為保守的、與胚胎發(fā)育有關(guān)的信號通路，調(diào)控著細胞的極化、增殖等多種生物學過程，β-catenin是經(jīng)典Wnt 信號通路的關(guān)鍵因子，其在沒有Wnt 信號時與細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)磷酸酶等形成復(fù)合物，該復(fù)合物被磷酸化后可以被蛋白酶直接降解，在受到Wnt 信號刺激以后，β-catenin 形成的復(fù)合物不能被磷酸化導(dǎo)致β-catenin降解受阻，引起β-catenin在細胞質(zhì)內(nèi)積累，細胞質(zhì)內(nèi)過量的β-catenin可以進入細胞核，引起下游靶基因的表達，從而發(fā)揮調(diào)控細胞多種生物學特性的作用［15-20］。本實驗表明，Wnt 信號通路抑制劑可以降低乳腺癌細胞的增殖活性，下調(diào)乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力，提示W(wǎng)nt 信號通路抑制劑XAV939具有抗腫瘤作用。

目前關(guān)于Wnt 信號通路與SOX9 的調(diào)控作用研究尚不明確，在皮膚鱗癌中的研究表明，下調(diào)βcatenin表達后的皮膚鱗癌細胞中SOX9表達水平降低，細胞的增殖能力下降，并且過表達SOX9可以部分恢復(fù)下調(diào)β-catenin對細胞增殖的影響，在軟骨細胞中的研究也證實，β-catenin 可以通過調(diào)控SOX9的表達影響關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)能力，在結(jié)腸癌中的研究表明，滅活A(yù)PC 可以激活小鼠中Wnt 信號通路，誘導(dǎo)SOX9的表達，促進結(jié)腸腺瘤性上皮細胞的增殖，以上這些研究結(jié)果表明，SOX9可能受到Wnt信號通路的正調(diào)控作用［21-25］。本實驗的結(jié)果顯示，Wnt 信號通路抑制劑可以下調(diào)乳腺癌細胞中SOX9 的表達，并且下調(diào)SOX9 表達后的乳腺癌細胞經(jīng)Wnt 信號通路作用后，細胞的侵襲和遷移能力降低更多，這可能提示W(wǎng)nt 信號通路可以通過調(diào)控SOX9的表達影響乳腺癌細胞的侵襲和遷移。

綜上，下調(diào)SOX9可以降低乳腺癌細胞侵襲、遷移及EMT 能力，SOX9 參與介導(dǎo)Wnt 信號通路調(diào)控乳腺癌細胞侵襲遷移過程，Wnt 信號通路能夠正調(diào)控乳腺癌細胞中SOX9 的表達，這為以后研究乳腺癌發(fā)病機制及Wnt信號通路、SOX9之間的具體調(diào)控位點奠定了基礎(chǔ)。本實驗沒有研究上調(diào)SOX9對抑制Wnt 信號通路的逆轉(zhuǎn)作用，沒有在多株細胞中進行驗證，在后續(xù)實驗中會對上述部分進行深入探討。