楊宇輝，趙文強(qiáng)

作者單位：安徽省第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 合肥 230000

近年來，細(xì)胞治療作為新興的治療方式，被廣泛應(yīng)用于包括缺血性心臟病（Ischaemic heart disease，IHD）在內(nèi)的眾多疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的資料，IHD 是當(dāng)今世界上最主要的死亡原因［1］。而患有IHD的老年人口不斷增長(zhǎng)以及IHD并發(fā)癥如頑固性心絞痛、心衰等可使國(guó)家負(fù)擔(dān)的健康預(yù)算進(jìn)一步增加。使用成人間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)、治療受損心肌的研究已有臨床以及臨床前研究。其中，大多數(shù)臨床試驗(yàn)使用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stromal cells，MSCs）［2-4］。然而，也有部分臨床機(jī)構(gòu)使用脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose tissue-derived stromal cells，ASCs）進(jìn)行臨床試驗(yàn)［5-6］。據(jù)信，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞通過其旁分泌效應(yīng)刺激血管（血管生成）和心臟組織（心肌發(fā)生）的生長(zhǎng)［4］。因此，用于臨床治療的細(xì)胞數(shù)目與病人的治療效果有關(guān)聯(lián)性，同時(shí)，病人相關(guān)因素（病史、生活習(xí)慣等）在內(nèi)的多種因素可影響體外培養(yǎng)最終獲得的干細(xì)胞數(shù)量。有研究報(bào)道，IHD 引起的病人相關(guān)因素對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量的影響以及自體細(xì)胞的分離及擴(kuò)增潛力［4，7-8］。Mozid 等［7］發(fā)現(xiàn)，IHD 病人年齡增加與外周血CD34+細(xì)胞收獲率降低和骨髓CD34+細(xì)胞濃度降低有關(guān)。然而，F(xiàn)riis 等發(fā)現(xiàn)，來自年輕健康供體的骨髓MSCs 與患有嚴(yán)重慢性IHD 老年病人的骨髓MSCs增殖能力沒有差異［3］。

本研究旨在探討病人自身相關(guān)因素尤其是可能導(dǎo)致IHD 的危險(xiǎn)因素對(duì)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入自2017年6 月至2018年1 月安徽省第二人民醫(yī)院收治的冠心病病人60例，男36例，女24 例，年齡（66.5±6.3）歲，體質(zhì)量（27.4±2.1）kg/m2；60例病人中，糖尿病18例，高血壓病60例，心肌梗死史15例，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療史39例，曾吸煙或仍吸煙32 例，不吸煙28 例，射血分?jǐn)?shù)（56.1±10.8）%，收縮壓（143.74±10.97）mmHg，舒張壓（95.99±11.82）mmHg，總膽固醇（3.93±0.82）mmol/L，體外擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)（61.3±67.1）×106。所有病人均沒有嚴(yán)重的肝腎疾病、風(fēng)濕性疾病、惡性腫瘤等。病人或近親屬同意并簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)冠心病診斷依據(jù)和診斷原則參考CN-WS 2010年1月1日發(fā)布的冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)。即至少滿足以下其中一條即可診斷冠心?。海?）依1997年WHO發(fā)布的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)，即有典型的心絞痛及心肌梗死癥狀發(fā)作，卻無重度主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全、狹窄重度主動(dòng)脈炎，也無證據(jù)支持冠狀動(dòng)脈栓塞或心肌?。唬?）男性40歲、女性45歲以上病人，在休息時(shí)心電圖有明顯心肌缺血表現(xiàn)，或無其他誘因的心電圖運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)陽(yáng)性，并有以下三項(xiàng)中的兩項(xiàng)者：高膽固醇血癥、糖尿病、高血壓；（3）做冠狀動(dòng)脈造影檢查時(shí)顯示有多支或一支主要冠狀動(dòng)脈狹窄且狹窄程度超過50%的病人；（4）做過冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療手術(shù)的病人。

1.3 骨髓穿刺與培養(yǎng)采用密度梯度離心法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［9］。使用局部麻醉的方法從病人髂前上棘抽取3～6 mL 骨髓液，其中，骨髓穿刺液的稀釋使用等量鹽酸鹽緩沖鹽水（PBS）加入含有Percoll 分離液的離心管中以2 000 r/min 離心2 min，收集單個(gè)核細(xì)胞層。這些細(xì)胞在PBS 中洗滌2 次，離心后重新收集。完全培養(yǎng)基（使用Dulbecco 的改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM））、10%醫(yī)藥級(jí)低糖胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素用于MSC 的培養(yǎng)［3，10］。在37 ℃、5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，2 d 后進(jìn)行換液（半量），之后每3 天換液1次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，這些細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增過程約4～6 周，由于供體機(jī)體條件的不同，骨髓MSCs 的擴(kuò)增潛力也不同，因此擴(kuò)增的持續(xù)時(shí)間也不同。待達(dá)到80%～90%細(xì)胞融合率以上時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化，并傳代2次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD45、CD34、CD105、CD73、CD13和CD90的表達(dá)［11-12］，最終，所得細(xì)胞在NucleoCounter上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件包內(nèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，連續(xù)型變量以，表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。分類變量以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 線性回歸分析細(xì)胞總計(jì)數(shù)與各因素的關(guān)聯(lián)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 性別、病史、吸煙對(duì)骨髓MSCs 體外擴(kuò)增后所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量的影響如圖1所示，本研究發(fā)現(xiàn)，從未吸煙病人骨髓MSCs體外擴(kuò)增所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量多于吸煙病人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.491，P＝0.015 6）；男性、無糖尿病史、無梗死病史、無PCI 治療史、病人的骨髓MSCs 體外擴(kuò)增所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量多于女性、有糖尿病史、有梗死病史、有PCI 治療史的病人，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 性別、病史、吸煙對(duì)骨髓MSCs體外擴(kuò)增后所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量的影響

2.2 年齡、BMI、射血分?jǐn)?shù)、膽固醇、血壓對(duì)骨髓MSCs體外擴(kuò)增后所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量的影響本研究發(fā)現(xiàn)，年齡與骨髓MSCs 體外擴(kuò)增后所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)目呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.502，P＜0.000 1）；BMI、射血分?jǐn)?shù)、膽固醇、收縮壓、舒張壓與骨髓MSCs 體外擴(kuò)增所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)目無明顯相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。見圖2。

圖2 年齡、BMI、射血分?jǐn)?shù)、膽固醇、血壓對(duì)骨髓MSCs體外擴(kuò)增后所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量的影響

3 討論

本研究納入了60例冠心病病人，探索病人相關(guān)因素對(duì)骨髓MSCs體外擴(kuò)增所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量是否有影響。

我們發(fā)現(xiàn)年齡和骨髓MSCs 體外擴(kuò)增所達(dá)到的數(shù)量之間存在關(guān)聯(lián)。這與Mozid 等［7］的研究結(jié)果相同，他們?cè)?01例IHD、擴(kuò)張型心肌病或AMI病人中發(fā)現(xiàn)年齡與外周血和骨髓中的CD34+細(xì)胞之間存在顯著的相反關(guān)系。其原因可能是由于研究的細(xì)胞類型與目前的干細(xì)胞不相同。然而，F(xiàn)riis 等［3］以前的研究表明，在16例年輕健康供體的骨髓來源的MSCs的增值能力和已知患有嚴(yán)重慢性IHD的15例老年病人的增殖能力的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Neef等［8］研究表明，糖尿病病人骨髓MSCs體外擴(kuò)增后的集落形成單位數(shù)量高于無糖尿病病人。但本研究無法證實(shí)糖尿病病人和無糖尿病病人之間存在相同的差異。

近年來，干細(xì)胞治療正作為一種治療選擇被廣泛研究應(yīng)用［13-15］。有報(bào)道指出，干細(xì)胞心肌內(nèi)注射治療心臟病的效果取決于注射的細(xì)胞量，因?yàn)楣谛牟∨c其他非冠心病病人骨髓MSCs 的生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型并無差別，因此體外擴(kuò)增所得到的細(xì)胞數(shù)目是此治療方式的基礎(chǔ)。大多數(shù)正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)使用燒瓶進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，但趨勢(shì)已趨向于使用同種異體細(xì)胞和使用生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。在過去的幾年中，已經(jīng)開發(fā)了更多的技能和更好的工具來培養(yǎng)、收集細(xì)胞，同時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)條件和傳代方法也已經(jīng)得到改善［16-18］。因此，合適的干細(xì)胞供體成為研究的重點(diǎn)。冠心病是由于全身系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的以心臟為突出表現(xiàn)的心臟病［19］，因此冠心病病人的相關(guān)因素可能能影響骨髓MSCs體外擴(kuò)增所達(dá)到數(shù)量，并以此預(yù)測(cè)未患冠心病的供體的骨髓MSCs體外擴(kuò)增的能力。

關(guān)于年齡對(duì)骨髓MSCs 體外擴(kuò)增的影響，我們的結(jié)果與有關(guān)祖細(xì)胞體外擴(kuò)增數(shù)目的報(bào)道一致［20］，均顯示較大的年齡與較少的體外培養(yǎng)數(shù)目相關(guān)。這可能是由于隨著年齡增加，參與細(xì)胞生存、衰老、增殖調(diào)控的microRNAs 的表達(dá)也發(fā)生改變。Liu等［21］發(fā)現(xiàn)，miR-17-92 簇可以調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖及存活，同時(shí)，隨年齡增加其表達(dá)下調(diào)最為明顯。此外，有學(xué)者［22］發(fā)現(xiàn)，18 歲年輕人骨髓間間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代至第12 代時(shí)出現(xiàn)衰老征象，同時(shí)，這種傳代衰老一方面可能與體內(nèi)微環(huán)境和體外培養(yǎng)條件的差異有關(guān)，另一方面與端?？s短所致體細(xì)胞的有限增殖有關(guān)。他還指出，與取自老年人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，年輕人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中具有更高的群體倍增水平。

吸煙可從形態(tài)學(xué)、增殖凋亡、Ca+、尼古丁型乙酰膽堿受體表達(dá)變化等方面影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性及功能。例如，被吸入人體的尼古丁可通過影響NO 調(diào)控細(xì)胞增殖或凋亡，后者已被證實(shí)在高濃度的情況下可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，低濃度延緩細(xì)胞凋亡［23］。不僅如此，尼古丁還可以造成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs 線粒體DNA 損傷，促進(jìn)ROS 產(chǎn)生。高濃度的ROS攻擊線粒體膜，線粒體膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，造成后者通透性改變，釋放凋亡誘導(dǎo)因子，形成ROS-線粒體DNA損傷的惡性循環(huán)，使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過程［24］。

我們的研究暫時(shí)限于骨髓MSCs，而外國(guó)學(xué)者發(fā)表的研究同時(shí)納入了脂肪源性干細(xì)胞，因此，僅分析了一種特定類型細(xì)胞的擴(kuò)增或分化潛能可能存在一定的偏倚，同時(shí)本研究的樣本量較少，如已戒煙和現(xiàn)在吸煙分別為11 和21 例，這兩組間雖然MSCs培養(yǎng)所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為59.7×106和60.4×106；t＝1.342，P＝0.118），但由于較小的樣本量限制了進(jìn)一步探究戒煙時(shí)長(zhǎng)可能對(duì)病人體外MSCs培養(yǎng)擴(kuò)增結(jié)果的影響。

綜上所述，本研究表明病人相關(guān)因素可能影響MSCs 培養(yǎng)擴(kuò)增后的結(jié)果。BMI 與培養(yǎng)擴(kuò)增后的自體ASC 的數(shù)量以及所有病人的MSCs 和ASCs 聯(lián)合使用存在著顯著的相關(guān)性。此外，高血壓病人的ASCs 數(shù)量和所有病人的MSCs 和ASCs 的數(shù)量均達(dá)到了較高的水平。此外，性別，高血壓和左心室射血分?jǐn)?shù)可能影響體外培養(yǎng)擴(kuò)增后獲得的骨髓MSCs 的數(shù)量。