董松武，張靜

作者單位：亳州市人民醫(yī)院，a心血管內(nèi)科，b檢驗(yàn)科，安徽 亳州 236800

心血管疾病的發(fā)病率和病死率逐年上升，嚴(yán)重危害人類的生命健康。急性心肌梗死（acute myocardial infraction，AMI）是由于血栓或冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的急性改變引發(fā)冠狀血流供應(yīng)嚴(yán)重受損，導(dǎo)致心肌的缺血損傷。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的長度約為22 個(gè)核苷酸的以序列特異性方式轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的非編碼單鏈RNA分子［1］，在生物體的生長、發(fā)育、分化和凋亡等方面起著重要調(diào)控作用。近年來研究表明miRNA在心臟重塑、血管細(xì)胞收縮、心肌收縮以及脂質(zhì)代謝等心血管疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［2-3］。miR-21 是一種位于17q23.2 染色體FRA17B脆性區(qū)域具有自主轉(zhuǎn)錄單位的miRNA［4］，其在新生內(nèi)膜細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，是血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖和凋亡的重要調(diào)節(jié)者［5］，miR-21 在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)也出現(xiàn)顯著異常。本研究采用特異的莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR 檢測AMI 病人和健康對照者外周血血漿中miR-21 的表達(dá)量，分析和探討其在AMI 發(fā)生發(fā)展過程中的作用和診療中的臨床應(yīng)用價(jià)值，采用ROC 曲線評價(jià)miRNA-21、肌鈣蛋白在AMI 病人中的診斷效率，采用Pearson 相關(guān)性分析AMI 病人血漿中miR-21 表達(dá)和肌鈣蛋白的相關(guān)性，為臨床提供新的診斷視角和指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年8 月至2017年8 月亳州市人民醫(yī)院住院AMI病人40例，其中男22例，女18例，年齡范圍為36～61歲，年齡（45.1±11.2）歲，同期本院體檢健康者作為健康對照40 例，其中男20例，女20 例，年齡范圍為28～58 歲，年齡（42.8±10.5）歲，兩組研究對象年齡、性別比例相匹配。病人或其近親屬知情同意。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

AMI 的入選標(biāo)準(zhǔn)：參照2012年［6］歐洲頒布全球心肌梗死定義：心臟標(biāo)志物水平超過正常參考值上限，同時(shí)伴有下述心肌缺血證據(jù)之一：心肌缺血癥狀；ECG 提示新發(fā)缺血性改變（新發(fā)ST-T 改變或新發(fā)左束支傳導(dǎo)阻滯）；ECG 提示新發(fā)病理性Q 波形成；影像學(xué)證據(jù)提示新發(fā)局部室壁運(yùn)動(dòng)異?；虼婊钚募G失；冠脈造影或尸檢發(fā)現(xiàn)冠脈內(nèi)存在新鮮血栓。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有瓣膜性心臟病、急慢性感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、周圍血管性疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、糖尿病、全身免疫性疾病、慢性阻塞性肺疾病、心律失常等疾病。

1.2 主要試劑和儀器miRCute miRNA 提取分離試劑盒（天根，離心柱型，生產(chǎn)批號O4208），RealMasterMix Probe 試劑盒（天根，生產(chǎn)批號O4215），5×Reverse Tanscriptase M-MLV buffer（大連寶生物，生產(chǎn)批號AHG0090A），dNTP Mixture（10 mmol/L）（大連寶生物，生產(chǎn)批號AI21491A），Reverse Transcriptase M-MLV（200 U/μL，大連寶生物，生產(chǎn)批號BL1501D），20×RNAsafe（天根，生產(chǎn)批號n3205），Rnase Free ddH20（天根，生產(chǎn)批號O4214），Gene Amp PCR System 9700擴(kuò)增儀（ABI），Light Cycler real time PCR擴(kuò)增儀（Roche）。

1.3 引物和探針由上海閃晶生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。

1.4 血漿總RNA 提取采集研究對象外周血漿1 mL，用天根miRCute miRNA提取分離試劑盒按試劑說明書提取miRNA，用紫外分光光度儀檢測總RNA溶液吸光度（A）值，A260/A280 比值在1.9～2.1 者于-80℃保存?zhèn)溆糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反應(yīng)體系及循環(huán)條件：5×Reverse Tanscriptase M-MLV buffer 8 μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）各2 μL，RT 引物（5 pmol/μL）2 μL，Reverse Transcriptase M-MLV（200 u/μL）1μL，20×RNAsafe 2 μL，Total RNA 4 μL，Rnase Free ddH 20 15 μL，混勻后于PCR 儀上16 ℃30 min，42 ℃40 min，85 ℃5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 熒光定量PCR 反應(yīng)體系及循環(huán)條件：2.5×realMasterMix 8 μL，正、反向引物（5 pmol/μL）各1 μL，20×Probe Ehancer solution 1 μL，探針（5 pmol/μL）1 μL，模板1 μL，ddH20 7 μL，混勻后于PCR 儀上94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃20 s，60 ℃30 s，68 ℃1 min，共43個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每個(gè)反應(yīng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)管中熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)為Ct值，以小核RNA U6作內(nèi)參，采用2-△△Ct相對定量法分析AMI病人血漿中miR-21 基因表達(dá)相對于健康對照血漿中基因表達(dá)的變化倍數(shù)F（2-△△Ct），△△Ct＝AMI（CtmiR21-CtU6）-NC（CtmiR21-CtU6）。F（NC）＝1（△△Ct＝0）。

采用SPSS 17.0軟件。KS檢驗(yàn)作數(shù)據(jù)正態(tài)分布分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；評價(jià)診斷效率采用ROC曲線分析，Pearson相關(guān)性分析miR-21 和肌鈣蛋白濃度的相關(guān)性，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 miR-21 qRT-PCR引物及探針序列

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳擴(kuò)增片段經(jīng)20%聚丙烯酰胺凝膠電泳，可見清晰、明亮的電泳條帶，與理論大小一致（56 pb），見圖1。

圖1 miR-21和U6擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線將U6反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和miR-21反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物倍比稀釋后，行PCR 擴(kuò)增建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增效率分別為94.98%，92.71%，兩組擴(kuò)增效率接近，故可以使用2-△△Ct相對定量法進(jìn)行分析，見圖2和圖3。

圖2 miR-21和U6的標(biāo)準(zhǔn)曲線：A為miR-21；B為U6

2.3 miR-21的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線見圖3。

圖3 心肌梗死組和健康對照組miR-21的擴(kuò)增曲線：A1-A4 為心肌梗死組，B1-B7為健康對照組

2.4 miR-21 在心肌梗死和健康對照血漿中的表達(dá)以U6 為內(nèi)參，用real-time PCR 分析miR-21 的表達(dá)。結(jié)果顯示miR-21 在心肌梗死組中的相對表達(dá)量均值（2-△△Ct）為2.51，與健康對照組的表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝10.20，P＜0.05），見圖4。

2.5 miRNA-21、肌鈣蛋白對AMI病人的診斷效能分析（ROC分析）在急性心肌梗死病人miR-21的AUC 為0.88，肌鈣蛋白的AUC 為0.98，與肌鈣蛋白的診斷效率接近，相關(guān)性分析表明，miR-21 水平和肌鈣蛋白濃度成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.48（P＜0.05），miR-21和肌鈣蛋白在心肌梗死及健康對照組血漿中的ROC曲線分析見圖5和圖6。

圖4 miR-21在心肌梗死及健康對照組血漿中的表達(dá)

圖5 miR-21在心肌梗死及健康對照組血漿中的ROC曲線分析

圖6 肌鈣蛋白在心肌梗死及健康對照組血漿中的ROC曲線分析

3 討論

近年來，隨著冠心病的發(fā)病率和死亡率的日趨升高，miRNA 介導(dǎo)心臟發(fā)育、心肌肥厚、心率失常及心衰等多種心血管疾病病理生理調(diào)控機(jī)制的研究已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，多項(xiàng)研究表明，可在人體多種體液包括血清、血漿、尿液、唾液中檢測到異常表達(dá)的循環(huán)miRNA，有研究人員提出特定的miRNA 有望成為心肌梗死及其他疾病的標(biāo)志物［7-8］。Van Roojj 等［9］研究發(fā)現(xiàn)在大鼠和人類心肌梗死后可檢測到miR-21、miR-214、miR-223 表達(dá)上調(diào)，同時(shí)miR-149及miR-29家族表達(dá)下調(diào)。Dong［10］通過結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈建立心肌梗死模型，6 h后檢測心肌細(xì)胞miRNA 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-21 在梗死區(qū)表達(dá)降低，而在臨界區(qū)表達(dá)明顯升高。Dong 近一步通過腺病毒載體于急性心肌梗死3 天前轉(zhuǎn)染miR-21 到大鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)相對于單純急性心肌梗死組24 h 的心肌梗死面積減少29%。表明miR-21 在急性心肌梗死早期保護(hù)缺血心肌細(xì)胞損傷方面起到關(guān)鍵作用，其機(jī)制可能與調(diào)控程序性細(xì)胞死亡分子（PDCD）-4 及激活蛋白（AP-1）有關(guān)，體內(nèi)試驗(yàn)研究證實(shí)miR-21 過表達(dá)可明顯減低心肌細(xì)胞凋亡率。

本研究采用2-△△Ct相對定量法分析40 例AMI病人血漿中miR-21相對于40例健康對照血漿中表達(dá)量，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組血漿miR-21 表達(dá)水平明顯增高，與健康對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AMI 病人血漿中miR-21 與肌鈣蛋白成正相關(guān)（r＝0.48，P＜0.05），其AUC 為0.88，與楊壽娟等［11］研究結(jié)果一致，認(rèn)為miR-21 是潛在的診斷學(xué)標(biāo)志物，對缺血灌注損傷的心肌具有保護(hù)作用。心肌梗死病人miR-21 表達(dá)增高可能是機(jī)體的保護(hù)機(jī)制，同時(shí)為miR-21 成為藥物治療靶點(diǎn)對缺血心肌進(jìn)行臨床治療提供了一個(gè)新的思路。Roy 等［12］在心肌缺血/再灌注的模型中，發(fā)現(xiàn)miR-21 作用于PTEN，引起基質(zhì)金屬蛋白酶2 的增加，參與心肌梗死后心肌肥厚、心肌纖維化進(jìn)程；miR-21 與miR-26能用過PTEN/AKT 信號通路從而抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，有望成為改善AMI后心肌重構(gòu)的潛在靶點(diǎn)［13-14］；馬超［15］等通過觀察低能激光照射（LLLI）對大鼠心肌梗死模型梗死區(qū)及其邊緣組織中miR-21表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)LLLI 處理梗死心肌能有效上調(diào)梗死及邊緣區(qū)域miR-21 的表達(dá)，miR-21 有較好的心肌保護(hù)作用。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-21 參與了心肌梗死后的心臟重塑過程。目前所有的探索miRNAs 對AMI 模型都是通過動(dòng)物實(shí)現(xiàn)的，尚未有人體試驗(yàn)的研究報(bào)道，有待研究人員深入探討。同時(shí)miR-21 不是一個(gè)高度特異性的檢測指標(biāo)，有研究表明miRNA 對食管癌［16］的診斷有一定價(jià)值，在HCC 病人［17］、乳腺癌［18］病人、慢性心力衰竭［19］、胃癌［20］病人血清中表達(dá)水平均增高。不同的miRNA分子也可在心肌梗死病人血清中同時(shí)表達(dá)異常，肖蕾等人［21］通過meta 分析表明miRNA-499 在早期急性心肌梗死病人血清中升高，可作為早期診斷的分子生物學(xué)標(biāo)志。

綜合本研究的試驗(yàn)結(jié)果，雖然目前對miRNA的研究已經(jīng)取得了一些成果，但仍有很多問題需要進(jìn)一步深入探究和進(jìn)行臨床驗(yàn)證，miRNA在不同疾病有特定的表達(dá)譜，我們應(yīng)尋求針對不同疾病的特定的表達(dá)譜提高診斷的敏感性和特異性，miRNA距離臨床應(yīng)用還有很多未解決的問題，亟需廣大研究人員深入探索。