饒石磊，楊崢，王旸，齊書然，張凱

作者單位：南陽市中心醫(yī)院放療科，河南 南陽 473000

肺癌在全球是普遍高發(fā)的惡性腫瘤，大約31%與癌癥相關(guān)的死亡是由肺癌造成的［1］。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國已成為肺癌發(fā)病率增長最快的國家之一，且發(fā)病年齡也呈年輕化趨勢［2］。大多數(shù)肺癌患者就診時(shí)已到腫瘤中晚期，已不能進(jìn)行手術(shù)，因此放療就成為常用的主要治療手段［3］。放療是利用放射線殺傷腫瘤的一種局部治療方法［4］，臨床上最常用的放射線是x 線、γ 射線及β 射線［5］，用不同劑量的γ射線照射肺癌細(xì)胞株A549、H460以及H1299，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制其凋亡［6］。但放療會(huì)使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐受性，降低放療敏感性，多種因素都可影響放療敏感性，如放療劑量、藥物、基因表達(dá)等［7］，照射前使用吉非替尼能增強(qiáng)x 線照射對肺腺癌細(xì)胞H358 的放射敏感性［8］。癌細(xì)胞具有分化障礙的特性，誘導(dǎo)癌細(xì)胞向正常細(xì)胞或近似正常細(xì)胞分化可降低癌細(xì)胞惡性程度，更有利于腫瘤的治療［9］，維甲酸（retinoic acid，RA）可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向成熟分化，恢復(fù)細(xì)胞正?；蚪咏５谋硇秃凸δ?，進(jìn)而抑制其增殖，誘導(dǎo)其凋亡［10］，但不同劑量照射對肺癌細(xì)胞分化的影響目前并不明確。本研究自2018年3月至2019年3月通過使用不同劑量的γ射線照射人肺癌細(xì)胞株A549，探討其對A549分化、增殖、凋亡以及放療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑人肺癌細(xì)胞株A549（貨號(hào)：EY-X0574），購自上海一研生物科技有限公司；吡格列酮，購自美國Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基（貨號(hào)：31800）、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（貨號(hào)：P1200-50T）購于Solarbio 公司；胎牛血清FBS（貨號(hào)：10099-141）、胰蛋白酶（貨號(hào)：15050057）、青鏈霉素（貨號(hào)：10378016），購自美國Gibco 公司；兔源GAPDH 抗體（貨號(hào)：ab181602）、MUC-1 抗體（貨號(hào)：ab45167）、SPC1 抗體（貨號(hào)：ab174794）、SPC2 抗體（貨號(hào)：ab186121）、羊抗兔二抗（貨號(hào)：ab150077），購自美國Abcam公司；AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（貨號(hào)：V13242），購自美國CellSingaling Technology 公司；結(jié)晶紫染液（貨號(hào)：IC0600-1），購自上海恒斐生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠（貨號(hào)：356234），上海代軒生物科技有限公司；蛋白裂解液（貨號(hào)：P0013K）、CKK-8試劑盒（貨號(hào)：C0037）、伊紅染色液（貨號(hào)：C0109）、BCA 試劑盒（貨號(hào)：P0011）等，購自上海碧云天公司。

1.2 儀器137Cs γ射線照射源（Autocell40），由加拿大原子能有限公司提供；酶標(biāo)儀（Elx800），由美國Bio-Rad 公司提供；顯微鏡（Olympus CKX41），由德國Leica 公司提供；流式細(xì)胞儀（CytoFLEX），由美國貝克曼庫爾特公司提供；雙人單面超凈工作臺(tái)、C02培養(yǎng)箱，由Thermo 公司提供；電泳儀、制冰機(jī)、恒溫水浴鍋，由北京六一儀器廠提供；96 孔板、25 cm2培養(yǎng)瓶、60 mm培養(yǎng)皿，由上海碧云天公司提供等。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 取購買的人肺癌細(xì)胞A549快速解凍復(fù)蘇，接種于含有5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）的25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長到80%以上時(shí)，胰酶消化后以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。傳代的細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、2 Gy 組、4 Gy 組、6 Gy組、8 Gy組、10 Gy組，參照文獻(xiàn)的方法［11］，以不同劑量的γ射線照射細(xì)胞，照射為一次性照射，劑量率為1 Gy/min，照射完成后，收集各組細(xì)胞備用。

1.3.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 1.3.1 中收集的細(xì)胞以培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，參照文獻(xiàn)的方法［12］，將細(xì)胞以500 個(gè)/皿的密度接種在60 mm 培養(yǎng)皿中，并在37 ℃、5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換一次培養(yǎng)基，7 d 后棄去培養(yǎng)基，PBS 漂洗2 次，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS漂洗2次，用0.2%結(jié)晶紫染液染色15 min，PBS 漂洗2 次，對細(xì)胞集落數(shù)計(jì)數(shù)，計(jì)算各組細(xì)胞的相對細(xì)胞克隆形成，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。公式為：相對細(xì)胞克隆形成＝照射組細(xì)胞集落數(shù)/對照組細(xì)胞集落數(shù)。

1.3.3 CKK-8 實(shí)驗(yàn)及放療敏感性檢測 1.3.1 中收集的各組細(xì)胞以培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以約5×105個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后加入CKK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀中振蕩混勻后在450 nm 波長下檢測各孔吸光度（optical density，OD），計(jì)算各組細(xì)胞生長抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。公式為：細(xì)胞生長抑制率（%）＝（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD 值）×100%，參照文獻(xiàn)，放療敏感性可用單位戈瑞（Gy）所造成的生長抑制率來表示［8］。

1.3.4 細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn) 1.3.1 中收集的各組細(xì)胞以培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，取約含有1×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液到離心管中，以1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，取細(xì)胞沉淀加入1 mL PBS 漂洗2 次，加入200 μL 的Binding Buffer 及10 μLArmexinV-FITC 輕輕震蕩混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，加入300 μL 的Binding Buffer及5 μL PI輕輕震蕩混勻，室溫下再避光反應(yīng)15 min，然后是以流式細(xì)胞儀檢測，采用Muticycle AV軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.5 免疫印跡（western blot，WB）實(shí)驗(yàn) 1.3.1 中收集的各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液后提取總蛋白，以BCA試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)結(jié)果調(diào)整各組蛋白弄得使之相同，以SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒根據(jù)說明書配方配制適宜濃度的SDS-PAGE 膠，取20 μg蛋白在電泳儀中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移目的蛋白至硝酸纖維膜上，加入5%的脫脂奶粉，室溫下封閉2 h，分別加入適宜濃度的兔源GAPDH、MUC-1、SPC1、SPC2 一抗，4 ℃條件下孵育過夜，TBST 洗膜后加入適宜濃度的羊抗兔二抗，4 ℃條件下孵育2 h，以化學(xué)發(fā)光試劑顯色，采用Image Lab軟件分析蛋白條帶得出蛋白的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn) 1.3.1 中收集的各組細(xì)胞以無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，參照文獻(xiàn)［13］，以5×105/mL 的密度接種在Matrigel 基質(zhì)膠包被過的Transwell 上室，下室加入細(xì)胞培養(yǎng)基（含有10%FBS），在37 ℃、5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，去除培養(yǎng)液，以PBS漂洗2次，加入4%的多聚甲醛，室溫固定20 min，然后小心擦去基質(zhì)膠及上室內(nèi)細(xì)胞，加入0.5%的伊紅染色，置于顯微鏡下觀察并拍照，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)目，檢測細(xì)胞侵襲能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀測資料主要是計(jì)量數(shù)據(jù)，采用表示，以t檢驗(yàn)比較兩組間差異，以方差分析比較多組差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量的照射對肺癌細(xì)胞克隆形成的影響對照組、2 Gy組、4 Gy組、6 Gy組、8 Gy組、10 Gy組不同劑量照射分別對肺癌細(xì)胞相對克隆形成100%、（68.93±12.32）%、（41.59±0.01）%、（28.01±8.22）%、（22.20±6.21）%、（13.81±2.18）%，與對照組相比，照射組細(xì)胞相對細(xì)胞克隆形成降低且呈計(jì)量依賴性（F＝230.731，P＝0.000），見圖1。

圖1 不同劑量的照射對肺癌細(xì)胞克隆形成的影響：A為對照組，B為2 Gy組，C為4 Gy組，D為6 Gy組，E為8 Gy組，F(xiàn)為10 Gy組

2.2 不同劑量的照射對肺癌細(xì)胞增殖及放療敏感性的影響與對照組相比，照射組細(xì)胞生長抑制率增高且呈計(jì)量依賴性（P＜0.05），照射組細(xì)胞的放療敏感性呈下降趨勢，且6 Gy 組、8 Gy 組、10 Gy 組與2Gy組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 不同劑量的照射對肺癌細(xì)胞凋亡的影響對照組、2 Gy組、4 Gy組、6 Gy組、8 Gy組、10 Gy組照射對肺癌細(xì)胞凋亡率分別為（12.61±2.38）%、（30.62±3.45）%、（58.67±5.01）%、（71.81±8.03）%、（81.80±10.26）%、（94.41±12.17）%，與對照組相比，照射組細(xì)胞凋亡率增高且呈計(jì)量依賴性（F＝152.671，P＜0.001），見圖2。

表1 各組細(xì)胞的生長抑制率及放療敏感性（%，，n＝3）

表1 各組細(xì)胞的生長抑制率及放療敏感性（%，，n＝3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與2 Gy組比較，bP＜0.05

圖2 不同劑量的照射對肺癌細(xì)胞凋亡的影響：A為對照組；B為2Gy組；C為4Gy組；D為6Gy組；E為8Gy組；F為10Gy組

2.4 不同劑量的照射對肺癌細(xì)胞分化的影響與對照組相比，照射組細(xì)胞MUC-1 蛋白表達(dá)降低，SPC1、SPC2 蛋白表達(dá)增高且呈計(jì)量依賴性（P＜0.05），見圖3，表2。

圖3 不同劑量的照射對肺癌細(xì)胞MUC-1、SPC1、SPC2蛋白表達(dá)的影響：A為對照組；B為2 Gy組；C為4 Gy組；D為6 Gy組；E為8 Gy組；F為10 Gy組

2.5 不同劑量的照射對肺癌細(xì)胞侵襲力的影響對照組、2Gy組、4 Gy組、6 Gy組、8 Gy組、10 Gy組浸出細(xì)胞數(shù)目分別為（402.87±53.31）、（300.12±38.43）、（189.64±29.86）、（121.21±22.32）、（71.04±18.29）、（20.31±4.03）個(gè)，與對照組相比，照射組細(xì)胞侵出細(xì)胞數(shù)目降低且呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖4。

圖4 不同劑量的照射對肺癌細(xì)胞侵襲力的影響（×200）：A為對照組；B為2 Gy組；C為4 Gy組；D為6 Gy組；E為8 Gy組；F為10 Gy組

3 討論

肺癌預(yù)后差、病死率高，我國每年約有60 萬人因此死亡，嚴(yán)重威脅人民的身心健康和生活質(zhì)量［14］。按病理類型，肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，可能由吸煙、長期遭受空氣污染和職業(yè)中接觸致癌物等引起［15］。放療是臨床中肺癌治療的重要手段之一，研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的X射線照射膀胱癌細(xì)胞，對其增殖、凋亡的影響不同，劑量越大，其抑制增殖、促凋亡的作用越強(qiáng)［16］。放療會(huì)引起腫瘤細(xì)胞的輻射耐受性，隨著治療的進(jìn)程，其放療敏感度會(huì)降低，而加大放療劑量極易引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)及并發(fā)癥［17］，因此尋找合適劑量的放射劑量對肺癌的治療具有重要意義。本文研究結(jié)果顯示，與對照組比較，照射組細(xì)胞相對細(xì)胞克隆形成降低，生長抑制率、凋亡率表達(dá)增高且呈計(jì)量依賴性；照射組細(xì)胞的放療敏感性呈下降趨勢，且6 Gy組、8 Gy 組、10 Gy 組與2 Gy 組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4 Gy 組與2 Gy組相比也呈下降趨勢，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無意義，表明γ 射線照射可以抑制A549 細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，且隨著照射劑量的加大效果增強(qiáng)，但A549 細(xì)胞的放療敏感性隨著照射劑量的加大呈下降趨勢，當(dāng)劑量達(dá)到6 Gy、8 Gy、10 Gy時(shí)放療敏感性隨照射劑量加大逐漸降低，揭示加大照射劑量，更有利于抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，但其放療敏感性會(huì)降低，繼續(xù)增加劑量，可能對肺癌的療效增加不多，還可能更易引起不良反應(yīng)及后遺癥。

表2 各組細(xì)胞MUC-1、SPC1、SPC2蛋白相對表達(dá)/（，n＝3）

表2 各組細(xì)胞MUC-1、SPC1、SPC2蛋白相對表達(dá)/（，n＝3）

注：與對照組比較，aP＜0.05

研究表明，癌細(xì)胞具有分化潛能，但其常出現(xiàn)分化缺失、分化阻斷和分化異常，進(jìn)而使其具有不死性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，使其向正常細(xì)胞或近似正常細(xì)胞分化，可以降低其惡性程度，癌細(xì)胞惡性程度越高，其增殖能力、侵襲遷移能力越強(qiáng)［18］。粘蛋白1（Mucin-1，MUC-1）是一種肺組織分化標(biāo)志物，在許多腫瘤組織細(xì)胞中都有表達(dá)，可作為肺癌細(xì)胞的分化標(biāo)志，抑癌基因p16可協(xié)同維A酸下調(diào)A549細(xì)胞MUC1 的表達(dá)，誘導(dǎo)其分化，進(jìn)而抑制其惡性增殖［19］，A549細(xì)胞是1972年Giard D J通過肺癌組織移植培養(yǎng)建系的肺癌細(xì)胞系，源自一位58歲的白人男性，屬于腺癌人類肺泡基底上皮細(xì)胞，肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C（surfactant protein C，SPC）是肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞特異性蛋白標(biāo)志物，包括SPC 1及SPC2，采用低氘水長期培養(yǎng)A549 細(xì)胞，可顯著上調(diào)SPC 1、SPC2的表達(dá)，提高細(xì)胞分化程度使其向正常肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制其增殖能力［20］。放療可以殺傷肺癌細(xì)胞，但其對肺癌細(xì)胞的殺傷作用是否和分化有關(guān)，目前還不清楚，本文研究結(jié)果顯示，與對照組比較，照射組細(xì)胞相對MUC-1蛋白表達(dá)、侵襲能力降低，SPC1蛋白表達(dá)、SPC2蛋白表達(dá)增高且呈計(jì)量依賴性，表明γ 射線照射可以上調(diào)SPC1、SPC2 蛋白表達(dá)，下調(diào)MUC-1蛋白表達(dá)，提高A549細(xì)胞分化程度，誘導(dǎo)其向正常肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，降低其侵襲能力及惡性程度，且隨著照射劑量的加大效果增強(qiáng)，揭示采用γ射線對肺癌進(jìn)行放療，可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞分化，提高其分化成熟度，抑制其侵襲、增殖能力，進(jìn)而使其惡性程度降低，另外相比正常細(xì)胞，癌細(xì)胞對射線更為敏感，促進(jìn)肺癌細(xì)胞分化可能是隨照射劑量加大，放療敏感性逐漸降低的原因之一。

綜上所述，γ 射線照射可以誘導(dǎo)A549 細(xì)胞分化，抑制其增殖、侵襲能力，促進(jìn)其凋亡，且隨著照射劑量的加大，上述各種作用效果增強(qiáng)，但A549 細(xì)胞的放療敏感性隨著照射劑量的加大呈下降趨勢，其機(jī)制可能與促進(jìn)肺癌細(xì)胞向正常肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)，本文為臨床放療的劑量選擇提供了一定的參考，但本研究未探討放療對正常細(xì)胞的影響，并且放療的作用機(jī)制也未做明確研究，還存在不足，需要后續(xù)的進(jìn)一步研究。