賈長河，謝毅，袁媛，劉博偉，任穎

作者單位：河南省人民醫(yī)院，a消化科，b胃腸外科，c病理科，河南 鄭州 450003

微管相關(guān)蛋白樣激酶1（Doublecortin-like kinase 1，DCLK1）是一種微管相關(guān)蛋白（microtuble-associated proteins，MAPs），主要表達(dá)在腫瘤干細(xì)胞，被認(rèn)為是胃腸道腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物［1］，以往的研究顯示，DCLK1 高表達(dá)與結(jié)腸癌［2］、膀胱癌［3］和肺癌［4］等癌癥的發(fā)生與轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究通過免疫組化的方法檢測(cè)比較胃癌組織和癌旁正常組織中DCLK1的表達(dá)，分析DCLK1表達(dá)對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2006年5 月至2011年7 月在河南省人民醫(yī)院胃腸外科行胃癌根治術(shù)的267例胃癌病人的臨床資料，其中男170 例，女97 例；年齡（54±13）歲；中高分化腺癌129 例，低分化腺癌138例；T1～T2 期144 例，T3～T4 期123 例；神經(jīng)侵犯153例，無神經(jīng)侵犯114 例；脈管侵犯139 例，無脈管侵犯128 例；淋巴轉(zhuǎn)移206 例，無淋巴轉(zhuǎn)移61 例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期111 例，Ⅲ～Ⅳ期156 例。排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例。同時(shí)選取癌旁正常組織標(biāo)本138例作為對(duì)照。病人或其近親屬對(duì)本研究知情同意，簽署了知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 組織來源及試劑267例胃癌標(biāo)本及138例癌旁正常組織學(xué)標(biāo)本來自河南省人民醫(yī)院病理科保存的石蠟包埋組織標(biāo)本，切片均經(jīng)HE 染色復(fù)讀確認(rèn)，術(shù)前未接受放化療。DCLK1 單克隆抗體（美國Abcam 公司，貨號(hào)：ab109029）。免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色液均購自武漢proteintech公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)DCLK1 的表達(dá) 按免疫組織化學(xué)法的試劑盒說明書嚴(yán)格操作，一抗DCLK1單克隆抗體工作濃度為1∶100，每批染色均設(shè)立陰性對(duì)照（PBS液代替一抗）和陽性對(duì)照。所有切片采用盲法由兩名高年資病理科醫(yī)生進(jìn)行獨(dú)立判定。在光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞出現(xiàn)棕褐色染色，免疫組化結(jié)果采用細(xì)胞染色陽性率和著色強(qiáng)弱雙評(píng)分半定量法進(jìn)行評(píng)價(jià)，在顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染色陽性的細(xì)胞比例，按照細(xì)胞染色陽性率對(duì)其評(píng)分為1～4 分，分別代表染色陽性率≤25%，26%～50%，51%～75%，76%～100%。著色強(qiáng)弱范圍評(píng)分為0～3分，分別代表無著色，淡黃色，棕黃色，棕褐色。細(xì)胞染色陽性率與著色強(qiáng)弱的乘積分組：＞4 分為高表達(dá)組，≤4分為低表達(dá)組。

1.3.2 臨床資料收集 首先在病理科查找2006年5月至2011年7月期間病理確診為胃癌的病人資料，包括性別、年齡、病理分型、有無淋巴轉(zhuǎn)移、有無脈管侵犯和臨床分期等。

1.3.3 隨訪 通過復(fù)診、電話、微信和郵件等方式進(jìn)行隨訪，記錄每例病人的生存狀況，術(shù)后是否復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)時(shí)間，復(fù)發(fā)是指局部區(qū)域復(fù)發(fā)或/和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，根據(jù)病理活檢或2個(gè)以上影像學(xué)檢查確定，不能確定復(fù)發(fā)的按不復(fù)發(fā)計(jì)，對(duì)于失訪或因非腫瘤原因?qū)е碌乃劳霭磩h失數(shù)據(jù)計(jì)，隨訪截止時(shí)間為2016年10 月。統(tǒng)計(jì)分析5年總生存期（overall survival，OS）和5年無病生存率（disease-free survival，DFS）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較/單因素分析采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)于單因素分析中P≤0.10 的因素代入Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析預(yù)后的獨(dú)立影響因素。以Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法比較生存率的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 胃癌病人臨床病理學(xué)特征及與DCLK1表達(dá)的關(guān)系DCLK1 主要在胃組織的細(xì)胞漿內(nèi)呈棕黃色顆粒，DCLK1在癌旁正常組織和胃癌組織中均有表達(dá)，見圖1。

267 例胃癌組織中有232 例呈陽性表達(dá)，其中192 例為高表達(dá)，40 例為低表達(dá)，35 例為陰性。138例癌旁正常胃組織中有58例呈現(xiàn)陽性表達(dá)，其中36例為高表達(dá)，22 例為低表達(dá)，80 例陰性。胃癌組織中DCLK1總體表達(dá)率（86.9%，232/267）及高表達(dá)率（71.9%，192/267）均高于癌旁正常組織（42.0%，58/138；26.1%，36/138），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。見表1。

表1 DCLK1在胃癌及癌旁正常胃組織中的表達(dá)率/例（%）

DCLK1高表達(dá)與病人性別、年齡，腫瘤大小，位置等無關(guān)（P＞0.05）；與腫瘤分化程度，浸潤深度，神經(jīng)侵犯，脈管侵犯，淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期等臨床病理因素有關(guān)（P＜0.05），見表2。

2.2 影響胃癌病人預(yù)后的Cox 分析將上述幾個(gè)單因素存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的自變量分別賦值（DCLK1低表達(dá)＝1，DCLK1高表達(dá)＝2；分化程度低＝1，分化程度高/中＝2；浸潤深度T1/T2＝1，T3/T4＝2；脈管侵犯＝1，脈管未侵犯＝2；淋巴轉(zhuǎn)移＝1，淋巴未轉(zhuǎn)移＝2），生存分別賦值為生存＝1，死亡＝0，無復(fù)發(fā)生存分別賦值為：復(fù)發(fā)生存＝1，無復(fù)發(fā)生存＝0，將自變量和因變量納入Cox分析，用Forward Conditional 逐步回歸分析，找出影響預(yù)后的獨(dú)立因素。

對(duì)5年OS 的Cox 分析顯示：DCLK1 表達(dá)、分化程度，浸潤深度和臨床分期是總生存（OS）的獨(dú)立影響因素，見表3。對(duì)5年無復(fù)發(fā)生存率（DFS）的Cox分析顯示：DCLK1 表達(dá)，分化程度，淋巴轉(zhuǎn)移，臨床分期是5年無復(fù)發(fā)生存率的獨(dú)立影響因素，見表4。

表2 DCLK1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 Cox多因素回歸分析胃癌OS的影響因素

表4 Cox多因素回歸分析胃癌DFS的影響因素

2.3 DCLK1表達(dá)水平與病人生存預(yù)后分析截至2016年10月，267例病人中共有23例失訪，5例死于其他疾病，其中高表達(dá)組失訪12例，2例死于其他疾病，低表達(dá)組失訪11例，3例死于其他疾病。自手術(shù)之日起至死亡或隨訪截止，最長生存期為125.32個(gè)月，最短生存期5.6個(gè)月，中位生存期為32.68個(gè)月。DCLK1高表達(dá)組5年總生存率為56.10%，無病生存率為39.70%，中位生存期為26.38個(gè)月；DCLK1低表達(dá)組5年總生存率為68.90%，無病生存率為47.70%，中位生存期為42.63個(gè)月。Kaplan-Meier 生存分析顯示（圖2），與DCLK1 低表達(dá)的病人相比，DCLK1 高表達(dá)的胃癌病人的5年總生存率（χ2＝4.232，P＝0.040）和5年無病生存率（χ2＝3.905，P＝0.048）均較差。

圖2 Kaplan-Meier法分析DCLK1表達(dá)對(duì)胃癌病人5年總生存率和無病生存率的影響：A為總生存率；B為無病生存率

3 討論

在世界范圍，胃癌的發(fā)生率和死亡率在過去幾十年中雖然下降，但依然是排名第四的最常見的惡性腫瘤，排名第二的癌癥相關(guān)致死因素，是人類健康的重大威脅［5-6］。手術(shù)切除是唯一可能根治胃癌的治療方法，特別是對(duì)于處于疾病早期的胃癌病人［7］。但是對(duì)于許多胃癌病人來說，早期癥狀不典型，確診時(shí)已經(jīng)處于疾病晚期階段，由于腫瘤轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)率很高，晚期胃癌病人通常在術(shù)后24個(gè)月內(nèi)發(fā)生死亡，預(yù)后很差［8-9］。為了提高胃癌早期診斷，有必要發(fā)展更加可信的生物標(biāo)志物以預(yù)測(cè)病人臨床結(jié)局。

微管相關(guān)蛋白DCLK1 最早被發(fā)現(xiàn)是小腸毛細(xì)胞（tuft cell）標(biāo)志［10］，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)DCLK1標(biāo)記腸道和胰腺腫瘤干細(xì)胞［11-12］，結(jié)腸癌和胰腺癌的發(fā)生和進(jìn)展依賴DCLK1陽性細(xì)胞［11，13-15］。肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和食管癌等癌癥中均高表達(dá)DCLK1［12，16-19］。DCLK1 的表達(dá)對(duì)于腫瘤干細(xì)胞、癌癥生長及轉(zhuǎn)移均具有重要作用［20-22］。但是DCLK1 在胃癌中的表達(dá)以及對(duì)胃癌診斷治療預(yù)后的意義研究的較少。本研究通過免疫組化檢測(cè)比較了267 例胃癌組織及138 例癌旁正常組織中DCLK1 的表達(dá)，分析DCLK1 表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明，胃癌組織中DCLK1 高表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，DCLK1 高表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床病理因素有關(guān)。Fan 等［23］的研究結(jié)果表明：DCLKl 高表達(dá)的肝癌病人無病生存期明顯縮短（HR＝1.546，95%CI：1.330～1.725）。梁東等［24］研究發(fā)現(xiàn)DCLKl 高表達(dá)的肝癌病人3年無瘤生存率（16.7%）明顯低于低表達(dá)者（46.2%）。孟慶彬等［25］的研究結(jié)果提示：胃癌病人中DCLKl 高表達(dá)者的5年生存率和5年無瘤生存率分別為39.0% 和37.0%，明顯低于DCLKl 低表達(dá)者的65.8% 和64.5%，以上研究報(bào)道均提示DCLKl 高表達(dá)的病人預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示：胃癌病人中DCLK1高表達(dá)組5年總生存率和無復(fù)發(fā)生存率均低于DCLK1 低表達(dá)組。Cox 分析提示，DCLK1 高表達(dá)是胃癌病人總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率的獨(dú)立影響因素，提示DCLKl 高表達(dá)的胃癌病人預(yù)后較差，同上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。

綜上所述，DCLK1 是胃癌潛在的生物標(biāo)記分子，可以作為一種新的胃癌的靶標(biāo)，開發(fā)新的診治方法以及判斷預(yù)后的方法。