趙明理，劉雷，曹建西，崔琳

作者單位：河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，河南 鄭州 450000

食管癌是全球第八大最常見的腫瘤，也是腫瘤相關(guān)死亡的第六大常見原因［1-2］。食管癌的發(fā)病因素主要包括吸煙、飲酒、環(huán)境因素及對食管造成損傷的各種慢性刺激等［3］。近年來，盡管食管癌的治療方式與方案得到極大的發(fā)展，然而食管癌治療的遠(yuǎn)期效果仍難令人滿意［4］。微RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、衰老、凋亡、轉(zhuǎn)移等多種細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。miR-346 是一種新發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中具有促癌或抑癌作用的miRNA［6-8］，然而其在食管癌中的機制研究尚未明了。本研究擬通過觀察miR-346 對食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探討其可能的分子作用機制，為miR-346 靶向治療食管癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集2016年10月至2017年4月河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科存檔的食管癌癌標(biāo)本和癌旁標(biāo)本6對，所有病例均經(jīng)病理證實。所有病人均為首次確診病例。病人術(shù)前均未行任何輔助治療，標(biāo)本取出后立即至于液氮罐內(nèi)保存。本研究獲本院倫理委員會批準(zhǔn)，病人對研究方案簽署知情同意書。

1.2 材料人正常食管黏膜上皮細(xì)胞株HET-1A和4種食管癌細(xì)胞株（TE-1、Eca109、Eca9706、KYSE150）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。DMEM 培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基和FBS購自美國Gibco公司。Trizol試劑盒購自美國Invitrogen 公司。qPCR 相關(guān)試劑盒購自美國Promega 公司。PCR 引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。miR-346慢病毒及空載病毒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒購自美國Sigma公司。細(xì)胞凋亡試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。一抗β-actin、Yes 相關(guān)蛋白1（YAP1）及細(xì)胞周期蛋白E（Cyclin E）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白1（cIAPl）購自美國CST公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、感染及分組HET-1A和TE-1培養(yǎng)于 含10% 胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，Eca109、Eca9706 和KYSE150 培養(yǎng)于含10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以TE-1為感染對象，感染miR-346慢病毒的TE-1細(xì)胞組為實驗組，轉(zhuǎn)染空載慢病毒的細(xì)胞組為陰性對照組。具體方法：以對數(shù)生長期的TE-1 細(xì)胞為感染對象，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%，將miRNA346 慢病毒或空載慢病毒感染TE-1 細(xì)胞。24 h后更換培養(yǎng)液，供后續(xù)實驗。

1.4 qPCR 檢測miR-346 和YAP1 基因表達(dá)水平根據(jù)Trizol 試劑盒說明書提取組織或細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照qPCR試劑盒說明書，以U6或GAPDH 分別進行qPCR 擴增檢測miR-346 和YAP1基因表達(dá)水平，擴增數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進行定量統(tǒng)計分析。GAPDH 引物序列（5′～3′）：Forward GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，Reverse Primer GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。YAP1 引物序列（5′～3′）：Forward TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA，Reverse TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT。

1.5 MTT 法檢測感染后的兩組TE-1 細(xì)胞，胰酶消化后接種于96 孔板，于接種后1、2、3、4 d 分別進行MTT 檢測。具體檢測：在每個時間點，每孔加入20 μL MTT 溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩10 min。酶標(biāo)儀檢測每孔在490 nm 波長處的吸光度（optical delnsity，OD），繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 集落形成實驗取生長狀態(tài)良好的兩組細(xì)胞，胰酶消化、制備單細(xì)胞懸液，以1 000 個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)10 d，隔天更換新鮮培養(yǎng)基。10 d后棄上清，甲醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，洗去多余染液，觀察統(tǒng)計集落數(shù)量。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡收集感染后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗2遍，加入200 μL凋亡結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC溶液和10μl PI溶液，避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測10 000個細(xì)胞，統(tǒng)計凋亡比例。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測收集感染后的兩組細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解提取總蛋白，定量后分別取兩組蛋白樣本50 μg 進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉液封閉2 h，4 ℃一抗孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，ECL 顯影劑發(fā)光顯影反應(yīng)，以β-actin 作為內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)對照，每組實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-346 在臨床食管癌組織中的表達(dá)水平qPCR 檢測結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，miR-346 在食管癌組織中的表達(dá)量明顯下降（2.20±0.32 比0.89±0.14，P＜0.01）。見圖1。

圖1 miR-346在食管癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2 miR-346 在正常食管黏膜上皮細(xì)胞和食管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-346在4種食管癌細(xì)胞（TE-1、Eca109、Eca9706 和KYSE150）中的表達(dá)量（0.22±0.02、0.45±0.08、0.65±0.08、0.53±0.04）均顯著低于正常人食管黏膜上皮細(xì)胞HET-1A（1.06±0.36），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中TE-1細(xì)胞中miR-346下降的最為明顯。見圖2。

2.3 miR-346 在兩組細(xì)胞中的相對表達(dá)量慢病毒感染TE-1細(xì)胞后，實驗組的miR-346顯著高于對照組（265.75±78.78比1.06±0.36，P＜0.01）。

圖2 miR-346在正常食管黏膜上皮細(xì)胞和食管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.4 miR-346 對細(xì)胞活力的影響自第3 天開始，與對照組相比，miR-346 慢病毒感染的TE-1 細(xì)胞的活力顯著降低（1.37±0.06比0.93±0.06），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 miR-346對TE-1細(xì)胞活力的影響

2.5 miR-346 對細(xì)胞增殖能力的影響通過統(tǒng)計實驗組TE-1細(xì)胞的集落數(shù)目和大小，實驗組集落的數(shù)目及大小明顯低于對照組（232.3±37.40比82.55±9.66，P＜0.01）。結(jié)果表明，miR-346 過表達(dá)能有效抑制TE-1細(xì)胞的增殖能力。

2.6 miR-346 對細(xì)胞凋亡的影響實驗組TE-1 細(xì)胞的凋亡率顯著多于對照組（8.26%±0.80%比0.94%±0.28%，P＜0.01），提示過表達(dá)miR-346具有誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞凋亡的作用。

2.7 miR-346靶基因預(yù)測結(jié)果microRNA.org-Targets and Expression 在線預(yù)測軟件（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）顯示，miR-346 與YAP1 mRNA 3′UTR區(qū)域存在結(jié)合位點。見圖4。

2.8 qPCR 檢測YAP1 mRNA 表達(dá)實驗組TE-1細(xì)胞中YAP1 mRNA 較對照組表達(dá)量明顯下降（0.44±0.11比1.00±0.04，P＜0.01）。

2.9 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果與對照組相比，實驗組TE-1 細(xì)胞中YAP1、Cyclin E 和cIAPl 蛋白表達(dá)量顯著下降。見圖5。

圖5 兩組細(xì)胞中Yes相關(guān)蛋白1（YAP1）及細(xì)胞周期蛋白E（Cyclin E）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白1（cIAPl）蛋白的表達(dá)情況

3 討論

miRNA是由20-24個核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA，屬于基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，miRNA在機體內(nèi)廣泛存在，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)域的互補序列相結(jié)合，起到抑制靶基因表達(dá)的作用［9］。若miRNA 與靶基因完全互補配對，導(dǎo)致靶基因mRNA的降解；若miRNA與靶基因不能完全互補配對，則導(dǎo)致靶基因mRNA翻譯的抑制［10］。miRNA、靶基因及表型之間存在復(fù)雜相互作用，miRNA已經(jīng)成為各種疾病診斷、治療效果、預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。近年來研究表明，miR-145-5p、miR-130a、miR-99a等［11-13］眾多miRNA參與食管癌的發(fā)生發(fā)展。

miR-346 參與多種疾病的病理過程。在糖尿病腎病小鼠模型中，miR-346 作為SMAD3/4 的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過減少腎組織中SMAD3/4 表達(dá)，改善了糖尿病腎病小鼠小鼠的腎功能，延緩糖尿病腎病的進展，miR-346 可能作為糖尿病腎病治療的靶標(biāo)分子。miR-346 通過靶向Bcl-6 基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)CD4（+）CXCR5（+）T 細(xì)胞數(shù)量，并且可能在Graves 病的發(fā)病過程起重要作用［14］。miR-346在多種腫瘤中發(fā)揮明顯的促癌或抑癌作用。miR-346在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)升高，通過干擾SRCIN1 基因的表達(dá)促進皮膚鱗狀細(xì)胞癌的增殖和遷移［15］。miR-346通過靶向抑制SRCIN1 基因的表達(dá)，促進乳腺癌細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，并減少細(xì)胞凋亡，同時降低降低乳腺癌細(xì)胞對多西紫杉醇的化學(xué)敏感性［16］。Argonaute 2 蛋白對于miRNA 的活性至關(guān)重要，miR-346可增強Argonaute 2蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致其他miRNA的活性增加，并促進宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲［17］。miR-346 通過靶向抑制BRMS1 基因的表達(dá)，促進鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲［6］。miR-346在非小細(xì)胞肺癌中屬于致癌性miRNA，通過調(diào)控XPC基因的表達(dá)，促進非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移［7］。肝細(xì)胞癌組織中miR-346 表達(dá)顯著下調(diào)，且與腫瘤大小和TNM分級有關(guān)，miR-346通過干擾SMYD3基因的表達(dá)抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，同時Cox 比例風(fēng)險分析表明miR-346的低表達(dá)是HCC的獨立預(yù)后因素［8］。miR-346在食管癌中的研究尚未見報道。

圖4 miR-346與YAP1 mRNA 3′UTR互補配對區(qū)域

我們發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-346 后食管癌細(xì)胞的活力和增殖能力顯著下降，細(xì)胞凋亡顯著上升，miR-346 具有抑制食管癌細(xì)胞生長的作用。通過microRNA.org-Targets and Expression 在線預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)，YAP1 可能是miR-346 的靶基因。YAP1 是一種癌基因，在多種腫瘤中表現(xiàn)為高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［18］。YAP1 是Hippo-YAP 通路負(fù)向調(diào)控的下游效應(yīng)分子，Hippo-YAP 信號通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的抑癌作用。當(dāng)Hippo-YAP 信號通路失活時，YAP1 表達(dá)上調(diào)［19］。YAP1 mRNA 和蛋白在食管癌組織中明顯上調(diào)，且YAP1 與食管癌的轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)［20］。我們發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-346 后的食管癌細(xì)胞中YAP1 基因表達(dá)下降。高表達(dá)的YAP1 可誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白E（Cyclin E）和細(xì)胞凋亡抑制蛋白1（cIAPl）等基因的表達(dá)，促進細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［21-22］。Cyclin E 和cIAPl蛋白表達(dá)變化與文獻(xiàn)一致。

總之，本組實驗結(jié)果提示，miR-346在食管癌組織以及食管癌細(xì)胞株中均呈低表達(dá)，能明顯抑制食管癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，其可能機制是干擾YAP1 基因的表達(dá)。miR-346 或許可成為治療食管癌的新靶點。