周明，王慧茹，陳洋，王敏，潘健

作者單位：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）輸血科，安徽 合肥 230001

在臨床上除了ABO 血型系統(tǒng)外，Rh 血型系統(tǒng)最為復(fù)雜，已發(fā)現(xiàn)的抗原有54種，Rh血型抗體檢出率較高常引起免疫溶血性輸血反應(yīng)（HTR）、造成疑難交叉配血及紅細(xì)胞輸注無(wú)效［1-2］，在新生兒溶血?。℉DN）中Rh 系統(tǒng)約占34.56%。2015年10 月我國(guó)積極開(kāi)展應(yīng)對(duì)人口老齡化行動(dòng)，實(shí)施全面二孩政策，目前調(diào)查孕產(chǎn)婦Rh血型抗體的檢出率及特異性分布情況，對(duì)于既往有不明原因流產(chǎn)提示、預(yù)防免疫溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血病具有重要的臨床意義。筆者選擇了4 680 例孕產(chǎn)婦，采用微柱凝膠抗球蛋白技術(shù)進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查及鑒定，共檢出56 例Rh 血型不規(guī)則抗體，調(diào)查5 種Rh 血型抗體的檢出率及發(fā)生規(guī)律，同時(shí)分析新生兒溶血病檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本與母親血清中特異性的抗體臨床意義。今后除Rh（D）相容性輸血外推進(jìn)Rh（CE）抗原相容性輸血，對(duì)預(yù)防免疫溶血性輸血反應(yīng)及新生兒溶血病具有非常重要的臨床意義，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年10月至2018年6月中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）申請(qǐng)備血的孕產(chǎn)婦4 680例為觀察組，年齡范圍為18～43 歲，年齡（27.3±5.6）歲。妊娠次數(shù)1～4 次，妊娠（2.2±1.2）次；另選取4 590 例申請(qǐng)備血的男性病人為對(duì)照組，年齡范圍為0～48 歲，年齡（34.3±4.6）歲。病人或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書(shū)。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 儀器試劑篩選不規(guī)則抗體細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和譜紅細(xì)胞（上海市血液生物技術(shù)公司生產(chǎn)）、2-Me（2-巰基乙醇）；美國(guó)強(qiáng)生抗人球蛋白微柱凝膠卡（Ortho Clinical Diagnostics 公司）及血型專用孵育器、離心機(jī)；單克隆抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e血清（長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)公司生產(chǎn)）。

1.3 紅細(xì)胞不規(guī)則抗體篩查自身對(duì)照管及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號(hào)管均無(wú)凝集者表明未檢出紅細(xì)胞不規(guī)則抗體；自身對(duì)照管無(wú)凝集，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號(hào)管中至少有一管出現(xiàn)凝集者表明受檢者血清（血漿）含同種免疫性紅細(xì)胞不規(guī)則抗體。

1.4 紅細(xì)胞不規(guī)則抗體特異性鑒定取微柱凝膠抗球蛋白卡2張（12微孔），在12個(gè)微孔下分別標(biāo)記為1～10、自身對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。在標(biāo)記為1～10的10個(gè)微孔中分別加入1～10號(hào)配組譜紅細(xì)胞（濃度1%）各50 μL，自身對(duì)照加入1%自身紅細(xì)胞懸液50 μL、陽(yáng)性對(duì)照加入1%O型RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞懸液50 μL，在標(biāo)記為1～10 及自身對(duì)照的微孔中各加入受檢者血清（血漿）50 μL，陽(yáng)性對(duì)照孔中加入IgG抗D試劑50 μL。如12個(gè)微孔均為陽(yáng)性者為非特異性抗體或同時(shí)伴有特異性抗體，1～10 號(hào)微孔中有1 或多個(gè)微孔陽(yáng)性者為特異性杭體，可根據(jù)陰、陽(yáng)性反應(yīng)格局，對(duì)照譜紅細(xì)胞抗原譜判定抗體特異性。

1.5 Rh血型抗體免疫球蛋白類型鑒定鹽水介質(zhì)法測(cè)定IgM 類血型抗體效價(jià)，效價(jià)與裂解前具有相應(yīng)血型抗原的紅細(xì)胞無(wú)變化者為IgG 類抗體，效價(jià)與裂解前具有相應(yīng)血型抗原的紅細(xì)胞有變化者為IgM類，效價(jià)與裂解前有所降低、但仍有凝集反應(yīng)為IgG+IgM抗體。

1.6 Rh血型抗體效價(jià)測(cè)定取出裂解后的0.1 mL血清依次倍比稀釋，配成8，16，32，64，128，256，512，1 024，采用抗球蛋白方法分別加入Rh 抗體的對(duì)應(yīng)抗原的紅細(xì)胞，離心后觀察結(jié)果并記錄其效價(jià)。

1.7 新生兒溶血病試驗(yàn)直接抗球蛋白試驗(yàn)（DAT）：取病兒紅細(xì)胞懸液50 μL洗滌后做DAT；紅細(xì)胞放散試驗(yàn)：取病兒壓積紅細(xì)胞1～2 mL用生理鹽水洗滌4次，最后一次洗液放入另一試管留作對(duì)照，用洗滌后的壓積紅細(xì)胞56 ℃熱放散。微柱凝膠抗球蛋白法使血漿及紅細(xì)胞放散液分別與篩選細(xì)胞反應(yīng)，檢測(cè)紅細(xì)胞不規(guī)則抗體，方法同不規(guī)則抗體的特異性鑒定。

2 結(jié)果

2.1 Rh血型不規(guī)則抗體在我院備血標(biāo)本的檢出率及分布情況就診孕產(chǎn)婦共備血4 680 例，Rh 血型抗體在初篩不規(guī)則抗體陽(yáng)性標(biāo)本中檢出56例（檢出率為1.20%），56 例抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e 孕產(chǎn)婦中，有妊娠史者48 例（占85.71%），其中妊娠2 次以上24例（占42.86%）；有輸血史者5例（占8.93%）；既有妊娠史又有輸血史者3例（占5.36%）。4 590例申請(qǐng)備血的男性病人，檢出Rh 血型抗體者共16 例（檢出率為0.35%），有輸血史者12 例（占75.00%）。Rh 血型不規(guī)則抗體檢出率及在就診人群中的分布情況見(jiàn)表1。

2.2 孕產(chǎn)婦檢出Rh血型不規(guī)則抗體特異性分布特異性分布為：抗-E 33 例（58.92%）、抗-D 10 例（17.86%）、抗-c 7 例（12.50%）、抗-cE 5 例（8.93%）、抗-C 1例（1.79%），見(jiàn)表2。

表1 Rh血型不規(guī)則抗體在研究人群中檢出率及分布情況/例（%）

表2 孕產(chǎn)婦Rh血型不規(guī)則抗體特異性分布

2.3 56 例Rh 血型抗體類型抗體免疫球蛋白類型：37 例（66.07%）為IgG、13 例（23.21%）為IgG+IgM、6 例（10.71%）為IgM，在37 ℃下均可與相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，說(shuō)明具有臨床意義。

2.4 檢出Rh 血型抗體的效價(jià)情況其中效價(jià)為512 者2 例（均為IgG），效價(jià)為256 者4 例（均為IgG），效價(jià)為128 者7 例（均為IgG），效價(jià)為64 者16例，效價(jià)為32 者20 例，效價(jià)為32～4 者7 例，檢出的56例抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e效價(jià)介于4～512，效價(jià)64以上均為IgG。

2.5 新生兒溶血病的結(jié)果56例Rh血型抗體陽(yáng)性的孕產(chǎn)婦中，新生兒紅細(xì)胞直接抗球蛋白試驗(yàn)（DAT）及紅細(xì)胞放散試驗(yàn)均為陽(yáng)性，新生兒溶血病試驗(yàn)鑒定放散液抗體與其母親Rh 血型抗體完全一致，證實(shí)10例新生兒的血清抗體通過(guò)胎盤凝集破壞胎兒紅細(xì)胞，IgG抗-D 4例，IgG抗-E 3例，IgG抗-c 2例，IgG抗-cE 1例，見(jiàn)表3。

確診Rh-HDN 診斷病例占同時(shí)期檢出的26 例Rh-HDN 病兒的38.46%。10 例所產(chǎn)新生兒被診斷為Rh-HDN，新生兒涵蓋ABO系統(tǒng)血型抗原和Rh系統(tǒng)的5種抗原，病兒臨床表現(xiàn)為貧血進(jìn)行性加重、黃疸（＞340 μmol/L）和出血傾向，血漿中均檢出Rh血型抗體，2例檢出高效價(jià)IgG抗-D的孕婦其中查閱病歷并詢問(wèn)病史，1 例多次習(xí)慣性流產(chǎn)，1 例出現(xiàn)不明原因晚期妊娠終止（孕齡＞28 周）。另外6 例孕婦Rh血型抗體效價(jià)均＞64，所產(chǎn)新生兒黃疸出現(xiàn)早進(jìn)展快，嚴(yán)重病兒出現(xiàn)低蛋白血癥、嗜睡、角弓反張等核黃疸癥狀。有1例既無(wú)妊娠史又無(wú)輸血史者檢出Rh血型抗體，其產(chǎn)生原因不明。

3 討論

人類紅細(xì)胞有30 多個(gè)血型系統(tǒng)，Rh 血型系統(tǒng)是最為復(fù)雜，表達(dá)的血型抗原多達(dá)54 個(gè)，與臨床密切相關(guān)的5 種抗原是D、E、C、c、e 等，其中D 抗原性最強(qiáng)，還存在弱D和部分D等變異體，臨床輸血較為復(fù)雜。女性因?yàn)槿焉锾杭t細(xì)胞經(jīng)胎盤進(jìn)入母體或RhCE非同型輸血等同種免疫刺激而產(chǎn)生同種抗體，引起嚴(yán)重的免疫溶血性輸血反應(yīng)及新生兒溶血病概率會(huì)明顯增加。臨床上不規(guī)則抗體陽(yáng)性和嚴(yán)重的新生兒溶血病病例多由Rh血型抗體引起，臨床表現(xiàn)為新生兒惡性貧血、胎兒水腫、黃疸，嚴(yán)重的導(dǎo)致核黃疸，在新生兒溶血病的發(fā)病方面，新生兒溶血病臨床癥狀與Rh 血型抗體數(shù)量、效價(jià)、胎兒致敏情況和胎兒代償能力密切相關(guān)［3］，嚴(yán)重者可致死胎因此預(yù)防和治療意義重大。早期新生兒溶血病的產(chǎn)前診斷通過(guò)羊水穿刺獲取胎兒細(xì)胞，但費(fèi)用高耗時(shí)長(zhǎng)，侵入性檢查對(duì)胎兒具有一定危險(xiǎn)。對(duì)于妊娠史、輸血史和流產(chǎn)史的夫婦Rh血型檢測(cè)和產(chǎn)前動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)孕產(chǎn)婦體內(nèi)Rh血型抗體變化極有必要。

表3 產(chǎn)婦和新生兒血型血清學(xué)結(jié)果

本研究中人群中抗-E的比率較高，而抗-D的比率較低，另外4 680 例孕產(chǎn)婦中Rh 血型抗體的檢出率為1.2%，Rh血型抗體所占比率依次為：抗-E 33例（58.92%）、抗-D 10例（17.86%）、抗-c 7例（12.50%）、抗-cE 5例（8.93%）、抗-C 1例（1.79%）。孕產(chǎn)婦中檢出的紅細(xì)胞血型不規(guī)則抗體均多于男性，這與國(guó)內(nèi)外多篇文獻(xiàn)報(bào)道一致［4］。分析原因有兩個(gè)：①男女體內(nèi)激素調(diào)節(jié)的內(nèi)分泌系統(tǒng)及妊娠等生理原因的免疫狀態(tài)不同，病人中多數(shù)女性有2次以上妊娠史，機(jī)體接受外界的免疫刺激機(jī)會(huì)多。②自身免疫系統(tǒng)紊亂產(chǎn)生Rh“類似抗體”，臨床可見(jiàn)抗-Ce、抗-c、抗-Ec、抗-e 等自身抗體［5］。2000年起《臨床輸血技術(shù)規(guī)范》第四章第5 條明確要求“常規(guī)檢查病人Rh（D）血型”，故抗-D 產(chǎn)生減少，僅占Rh 系統(tǒng)的15.63%，但其它RhCE 抗原檢測(cè)未作要求，尤其是E抗原性僅次于D，刺激依然存在，導(dǎo)致抗-E（c）占Rh的71.88%，研究表明我國(guó)漢族人群RhE陰性頻率遠(yuǎn)高于RhD陰性頻率，一次隨機(jī)受RhE同種免疫概率高于RhD 2.47 倍［6］，故建議輸血前首先將RhE 作為孕婦常規(guī)檢測(cè)且RhDE同型輸血，將會(huì)大大降低抗-E產(chǎn)生的概率，減少不良反應(yīng)發(fā)生。

Rh血型抗體通常采用凝聚胺或抗球蛋白鑒定，本研究中56 例陽(yáng)性標(biāo)本采用微柱凝膠抗球蛋白方法靈敏度高，未發(fā)現(xiàn)漏檢，免疫球蛋白類型多為IgG也有IgM。Rh 抗體溶血主要為血管外溶血，具有臨床意義多數(shù)抗體最佳反應(yīng)溫度為37℃，除了單一血型抗體外，還會(huì)ABO 系統(tǒng)等其他紅細(xì)胞系統(tǒng)合并Rh 系統(tǒng)的溶血病。在檢出56 例孕婦血漿中的Rh血型抗體，其中2例Rh血型抗體效價(jià)均≥512發(fā)生了流產(chǎn)史、輸血史甚至宮內(nèi)死胎，1 例Rh 血型抗體效價(jià)均≥128 出現(xiàn)2 次以上晚期妊娠終止（孕周＞28周），1 例Rh 血型抗體效價(jià)均≥64 多次習(xí)慣性流產(chǎn)。分娩的新生兒有10 例被證實(shí)其紅細(xì)胞具有臨床意義，母體被來(lái)自胎兒的紅細(xì)胞致敏產(chǎn)生Rh 血型抗體，自母體經(jīng)胎盤進(jìn)入新生兒血液循環(huán)的Rh血型抗體造成病兒溶血性貧血、缺氧、心衰，嚴(yán)重者宮內(nèi)死胎，是Rh-HDN最主要的致病抗體。Rh-HDN中抗-c的重要性僅次于抗-D，可能引起嚴(yán)重新生兒溶血病，抗-C、抗-E、抗-e不常引起新生兒溶血病，即便發(fā)生也比較輕。其余5例紅細(xì)胞未被抗體致敏的新生兒母親血漿Rh 血型抗體效價(jià)均≥64，紅細(xì)胞血型抗體的效價(jià)的高低與機(jī)體免疫次數(shù)有相關(guān)性，抗體的效價(jià)與臨床意義也密切相關(guān)，胎兒紅細(xì)胞Rh抗原顯示出劑量效應(yīng)，其致敏能力越強(qiáng)、次數(shù)越多抗體效價(jià)越高，其導(dǎo)致輸血免疫溶血性輸血反應(yīng)及新生兒溶血病的程度也越嚴(yán)重。因此對(duì)于檢出高效價(jià)IgG型Rh 抗體的孕婦，妊娠中晚期每2 周監(jiān)測(cè)，制定本實(shí)驗(yàn)室危險(xiǎn)臨界值，作為產(chǎn)前診斷評(píng)估胎兒發(fā)生新生兒溶血病的嚴(yán)重程度可能性、制定合理的干預(yù)預(yù)防措施［7］，效價(jià)≥512可行血漿置換治療。

目前國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)醫(yī)院臨床輸血前只進(jìn)行RhD 檢測(cè)，本研究檢出抗-D 占Rh 血型抗體的8.33%，國(guó)內(nèi)2015～2018年報(bào)道的免疫溶血性輸血反應(yīng)及新生兒溶血病病例中由抗-D 引起的病例均高于我們［8-9］，臨床輸血施行ABO 系統(tǒng)和RhD 同型輸注，RhD陰性受血者基本接受RhD陰性紅細(xì)胞的同型輸注，所以經(jīng)輸血所致同種免疫性抗-D 越來(lái)越少。然而Rh系統(tǒng)擁有豐富而復(fù)雜的遺傳多態(tài)性，同樣表現(xiàn)Rh 陰性的個(gè)體因人種不同而有不同的遺傳結(jié)構(gòu)；另一方面由抗原陰性率和免疫原強(qiáng)度推測(cè)，抗-E 及抗-cE 成為相對(duì)多見(jiàn)的不規(guī)則抗體，相關(guān)報(bào)道也證明表達(dá)在同一條多肽鏈上的RhC/c 和RhE/e的原因使抗-E及抗-cE致免疫溶血性輸血反應(yīng)及新生兒溶血病增多［10-12］，隨機(jī)輸血中E抗原和c抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG抗體概率最大［13］，抗-E除了在Rh系統(tǒng)抗體中占主要比例外，在病人所有紅細(xì)胞血型意外抗體的比例中亦是最高。Rh 系統(tǒng)抗體常共同出現(xiàn)已經(jīng)產(chǎn)生抗-E 的DCe/DCe（R1R1）個(gè)體可能已經(jīng)產(chǎn)生抗-e，但其抗-c較弱而未檢測(cè)出，輸入E陰性而c 陽(yáng)性的紅細(xì)胞也會(huì)引起急性或遲發(fā)性溶血反應(yīng)。因此我們建議在有妊娠史輸血史的孕產(chǎn)婦、反復(fù)輸血者、疑難交叉配血的特殊人群中，增加Rh 血型抗原分析的輸血策略，研究Rh抗原E、C、c、e在本地區(qū)的頻率分布，建立抗-c、抗-e 稀有血型供血群，選擇不含相應(yīng)抗原或Rh血型相同血液進(jìn)行輸注，對(duì)保障孕產(chǎn)婦輸血安全和降低Rh-HDN意義重大。