丁亮，武謙虎，凌美，盛健惠，張建軍，彭國平，李存玉，黃春帆

作者單位：1南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000

藥物性肝損傷（Drug-Induced Liver Injury，DILI）是指因藥物或其代謝產(chǎn)物的毒性作用、或機(jī)體對藥物產(chǎn)生過敏反應(yīng)而對肝臟引發(fā)的損害。DILI 分辨率定義為肝臟生化指標(biāo)值恢復(fù)正?；虻陀贑IOMS 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)［1］，調(diào)查顯示每年10 萬居民中大約有14～24 人在藥物治療過程中可引發(fā)DILI，占藥品不良反應(yīng)例數(shù)的3%～9%。DILI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，致病因子較多，且大多數(shù)取決于藥物理化性質(zhì)和宿主因子的相互作用［2］。由于抗結(jié)核藥物致肝損傷的病程在臨床實(shí)踐中難以觀察，因此有必要建立抗結(jié)核藥物致肝損傷的動物模型。利福平可誘發(fā)肝細(xì)胞型和膽汁淤積型肝損害，異煙肼可誘發(fā)肝酶過高，抗結(jié)核藥所致的肝損傷已成為最嚴(yán)重毒副作用之一［3］。護(hù)肝益肺方為鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院肺科協(xié)定方。該方由女貞子、五味子、甘草、虎杖、黃芪等12 味中藥組成，具有護(hù)肝解毒，斂肺止咳等功效，用于防治抗結(jié)核藥所致肝損害。既往研究表明，護(hù)肝益肺顆粒對異煙肼、利福平所致藥物性肝損害小鼠均有保護(hù)作用［4］。本文自2018年3月至2019年3月研究了護(hù)肝益肺方對異煙肼+利福平所致藥物性肝損害小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用藥物試劑及儀器設(shè)備

1.1.1 要藥物及試劑 利福平注射液（沈陽雙鼎制藥有限公司，生產(chǎn)批號18070201），規(guī)格：5 mL：0.3 g；異煙肼注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號1704231），規(guī)格：100 mg：2 mL；水飛薊賓葡甲胺片（江蘇中興藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號171207-314），規(guī)格：50 毫克/片，以1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）制成混懸液；羧甲基纖維素鈉購于辰昊聚合物科技有限公司；75%乙醇消毒液及甲醛組織固定液購于上海雷布斯儀器設(shè)備有限公司。

1.1.2 護(hù)肝益肺方、護(hù)肝方的制備 護(hù)肝益肺方組成：女貞子10 g、五味子10 g、甘草10 g、虎杖20 g、黃芪30 g、三七5 g、胡黃連6 g、白頭翁6 g、炙百部15 g、白及10 g；護(hù)肝方組成：女貞子10 g、五味子10 g、甘草10 g、虎杖20 g、胡黃連6 g、白頭翁6 g。取兩副方劑三倍藥材量，將藥材粉碎成粗粉，置適宜煎器中，加水浸沒藥材，浸泡適宜時間后，加熱至煮沸，分離煎出液，藥渣煎出2 次，合并各次煎出液，濃縮至適宜濃度（給藥量0.1 mL/10 g藥材）。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 15R 型臺式冷凍離心機(jī)（貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司生產(chǎn)），羅氏cobas 8 000全自動生化分析儀（羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司生產(chǎn)），Synergy2酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司生產(chǎn)），制冰機(jī)（江蘇冰歐新能源科技有限公司生產(chǎn)），-20 ℃冰箱（廣東福意電器有限公司生產(chǎn)），石蠟切片機(jī)（貝諾醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)），顯微鏡（Olympus，日本生產(chǎn)）。

1.2 藥理實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物選擇與飼養(yǎng) 70 只SPF 級ICR 小鼠，2～3 周齡，體質(zhì)量20～22 g，雌雄各35 只，購于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（蘇）2018-0049。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于屏障設(shè)施內(nèi)、正常喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料。動物房內(nèi)溫、濕度調(diào)節(jié)：溫度21～26 ℃，相對濕度45%～70%。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后靜脈注射給藥。本研究對動物處置符合動物倫理學(xué)原則。

1.2.2 動物分組及待測樣本采集 動物分組：將70只ICR 種小鼠分為7 組，雌雄各半。正式給藥前一日備好墊料、飼料、水，分組?？瞻讓φ战M：正常飲水、喂飼料；模型組：靜脈注射給聯(lián)用藥（劑量：100 mg/kg異煙肼+400 mg/kg利福平，連續(xù)給藥2周）；陽性對照組：靜脈注射給藥（水飛薊賓葡甲胺片配成75 mg/mL的混懸液，換算成給藥量750 mg/kg，連續(xù)給藥2周）；全方低劑量組：（劑量：5 g生藥/kg，連續(xù)靜脈注射給藥2周）；全方高劑量組：（劑量：10 g生藥/kg，連續(xù)靜脈注射給藥2周）；護(hù)肝低劑量組：（劑量：2 g生藥/kg，連續(xù)靜脈注射給藥2周）；護(hù)肝高劑量組：（劑量：4 g生藥/kg，連續(xù)靜脈注射給藥2周）。除空白對照組外，其余組小鼠每天上午9 點(diǎn)左右給予100 mg·kg-1·d-1異煙肼＋400 mg·kg-1·d-1利福平混合藥液；每天下午3點(diǎn)（6 h后）針對陽性對照組及方劑組給保護(hù)藥，模型組和空白組同時間靜脈注射給生理鹽水。各組灌胃體積均為0.1 ml/10 g，均正常飲水、喂飼料。第14天禁食不禁水24 h，第2天稱重。

實(shí)驗(yàn)取材：從小鼠眼眶內(nèi)眥靜脈采血收集，用離心管裝至0.5～0.7 mL用于血液中生化指標(biāo)的檢測；在超凈臺中取肝臟，取整塊肝組織樣本、稱濕重，統(tǒng)一取肝左葉用10%甲醛浸泡裝于離心管中用于肝組織病理切片制作，迅速剪取肝右葉用于肝勻漿制備。

1.2.3 肝組織病理切片的制作及觀察 統(tǒng)一取肝左葉，用生理鹽水洗滌后放入甲醛中固定2 d，待其脫水后，經(jīng)修樣、石蠟包埋，再切成厚度5 μm 的肝組織病理切片，HE 染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

1.2.4 肝勻漿的制作及檢測 統(tǒng)一取肝右葉，用生理鹽水進(jìn)行勻漿，制成10%勻漿液，于離心機(jī)中離心10 min（轉(zhuǎn)速4 000 r/min、溫度4 ℃），分離上清液。將分離的勻漿液-20 ℃保存待測。肝勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）含量的測定，均按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 血清生化指標(biāo)的檢測 由鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科使用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）及總膽紅素（TBIL）的含量。1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進(jìn)行檢驗(yàn)。計量資料用的是方差分析和t檢驗(yàn)，以表示；計數(shù)資料用的是χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 觀察小鼠外貌、體重和行為的差異空白對照組：毛色順白，行動敏捷，食量正常，體質(zhì)量偏重且增長迅速；模型對照組：毛色無明顯變化，行動較正常組遲緩，食量偏小，排泄物呈紅色至橘紅色、較稀薄；陽性對照組：毛色無明顯變化，行動正常，食欲正常。各組體重均穩(wěn)定增長，雄鼠體重較雌鼠增長較快，模型組較正常組體重增長略緩慢，陽性對照組與各保肝組體重均穩(wěn)步增長且增重明顯。

2.2 觀察小鼠肝臟形態(tài)的變化實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后將肝臟取出，用生理鹽水洗去肝表面的血漬，肉眼觀察肝臟整體?？瞻捉M：小鼠肝臟表觀呈暗紅色近似紅褐色，彈性較好。模型組：外觀有所改變，肝臟明顯腫大，顏色呈淡黃，部分肝臟表面有大量土黃色小點(diǎn)聚集，與暗紅色明顯不同，邊緣切面組織略寬略鈍，觸感柔軟，明顯有油膩感、彈性不足，其中個別肝臟表面黃色小點(diǎn)程度較嚴(yán)重，面積較大，初步論證為脂肪肝變性明顯。陽性對照組及其他保肝方組中，小鼠肝臟均比模型組質(zhì)量減輕，并無明顯腫脹，肝臟組織邊緣略尖窄、切面較薄，觸摸手感較柔軟。但保肝方中，尤其以低劑量組中，仍有個別小鼠肝臟有油膩感，切面組織較其他略微寬鈍。

2.3 小鼠肝臟生化指標(biāo)檢測結(jié)果由表1可看出，模型組的TBIL、ALP 均大于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明利福平、異煙肼藥物聯(lián)用所致急性藥物性肝損害的模型建立成功。在護(hù)肝益肺方及拆分后的護(hù)肝方中，ALT 與AST 與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，陽性對照組（水飛薊賓葡甲胺片）、各方劑組的TBIL、ALP 均小于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明水飛薊賓葡甲胺片、護(hù)肝益肺方及拆分后的護(hù)肝方對模型小鼠的肝損傷均有保護(hù)作用。可見，拆分后的護(hù)肝方對TBIL、ALP 的降低能力優(yōu)于陽性組，而護(hù)肝益肺全方的解毒能力與陽性組持平。

2.4 小鼠肝臟病理學(xué)檢查對肝損害小鼠模型肝臟組織病理學(xué)的影響：正常對照組小鼠肝組織無明顯病理改變；模型組肝細(xì)胞發(fā)生廣泛的脂肪樣變性，細(xì)胞質(zhì)疏松及混濁腫脹，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞可見少量點(diǎn)狀和灶狀壞死。陽性對照組及護(hù)肝方各劑型組僅個別肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死，肝細(xì)胞變性壞死程度較造模組輕，匯管區(qū)可見少量炎細(xì)胞浸潤，見表2。

通過在光鏡下對各組小鼠肝組織病理切片進(jìn)行觀察。空白組：切片上每個肝小葉紋路清楚，小葉中間的中央靜脈呈放射狀排列，無病變發(fā)生。門管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰、結(jié)締組織易辨認(rèn)，小葉間靜、動脈及小葉間膽管無明顯病變發(fā)生。肝細(xì)胞常規(guī)排列，辨認(rèn)清晰，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞未見明顯急性肝炎、肝硬化、肝膿腫等病生理變化（圖1A）。模型組：可清晰地觀察到脂肪變性，肝竇變得狹窄，可見肝細(xì)胞體積擴(kuò)增，聚集排列雜亂，小的脂肪空泡環(huán)繞在細(xì)胞核四周，脂肪空泡體積大小不一，充斥在整個細(xì)胞質(zhì)中（圖1B）。陽性對照組：可依稀分辨出一些散在的脂肪變性，以微泡型脂肪變性居多，有些區(qū)域幾乎無脂肪性小泡，屬輕度脂肪性病變（圖1C）。全方低劑量組：肝細(xì)胞氣球性樣變，細(xì)胞腫脹變性，細(xì)胞質(zhì)淡染。以微泡型和小泡型的脂肪變性居多，且數(shù)量稍多、屬中度變性。10例病理切片中，有4例表現(xiàn)出中度脂肪性病變，量化指標(biāo)有所緩和但藥效不及高劑量組明顯（圖1D）。全方高劑量組：依稀分辨出微小氣泡較多，存在很輕微的脂肪性變性，可忽略不計（圖1E）。護(hù)肝低劑量組：也可分辨出一些散在的脂肪變性，以微泡型脂肪變性居多、按小泡數(shù)量屬輕度到中度病變（圖F）。護(hù)肝高劑量組：存在很輕微的脂肪性變性，可忽略不計，整體效果優(yōu)于護(hù)肝常量組（圖1G）。

圖1 各組小鼠肝病理學(xué)變化光鏡圖：A為空白對照組（HE染色，×100）；B為模型組（HE染色，×100）；C為陽性對照組（HE染色，×100）；D為全方低劑量組（HE染色，×100）；E為全方高劑量組（HE染色，×100）；F為護(hù)肝低劑量組（HE染色，×100）；G為護(hù)肝高劑量組（HE染色，×100）

2.5 護(hù)肝益肺方對小鼠肝勻漿GSH、SOD、MDA的影響由表3可看出：陽性對照組、各方劑組中的SOD、GSH均高于模型組，MDA均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明水飛薊賓葡甲胺片、護(hù)肝益肺方及護(hù)肝方對肝損傷模型小鼠肝勻漿中的SOD、GSH 有升高作用，MDA 有降低作用。在陽性組與各方劑組的比較中，可見全方高劑量組對升高SOD、GSH及降低MDA水平的調(diào)控能力與水飛薊賓葡甲胺片持平，而護(hù)肝高劑量組對肝損傷模型小鼠肝勻漿中各指標(biāo)的調(diào)控作用更優(yōu)。

3 討論

半個世紀(jì)來，利福平、異煙肼、吡嗪酰胺等作為一線抗結(jié)核藥物常被臨床使用，但因其肝毒性引發(fā)的藥物性肝損傷常影響到抗結(jié)核治療方案的實(shí)施。治療過程中由于藥物的毒性損害或?qū)λ幬锏倪^敏反應(yīng)所致的藥物性肝損傷，臨床多表現(xiàn)為四肢乏力、黃疸、惡心厭油、肝臟腫大、肝區(qū)疼痛等［5］。

目前已有多種肝損傷動物模型：化學(xué)性肝損傷動物模型、藥物性肝損傷動物模型、免疫性肝損傷動物模型、酒精性肝損傷動物模型等。生物性方法要求實(shí)驗(yàn)條件高且費(fèi)用昂貴，限制其應(yīng)用。免疫性方法是通過免疫方法造成肝損傷，主要用于通過免疫機(jī)制所致肝損傷的藥物研究?；瘜W(xué)性方法通過化學(xué)性肝毒物質(zhì)，如四氯化碳、對乙酰氨基酚等致肝損傷。對乙酰氨基酚是運(yùn)用最為廣泛的一種造模藥物，在常規(guī)治療作為解熱鎮(zhèn)痛藥時是相對安全的、但長期或過量使用易造成肝中心小葉壞死，嚴(yán)重會惡化成急性肝功能衰竭［6］。酒精性方法發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜［7］，通過酒精灌胃，具有簡易方便成本低等特點(diǎn)，但安全性不易把控、小鼠易死亡。如何建立更優(yōu)質(zhì)有效的肝損傷動物模型，尚需進(jìn)一步的研究和改進(jìn)，為研究肝病發(fā)病機(jī)制、篩選保肝藥物等奠定基礎(chǔ)。當(dāng)然，以抗結(jié)核藥制備肝損傷動物模型，用于評價對抗結(jié)核藥所致肝損傷保護(hù)作用，更具有科學(xué)和臨床實(shí)際意義［8］。利福平單用可導(dǎo)致膽紅素升高，通過協(xié)同作用加重異煙肼所引起的肝損傷。抗結(jié)核藥所引起的肝損傷與對乙酰氨基酚和四氯化碳不同，對于ALT和AST增高不明顯、但對于TBIL和ALP有明顯的升高作用，均會不同程度出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫，羽毛樣、脂肪變性［9］。故本實(shí)驗(yàn)以利福平+異煙肼干預(yù)制備肝損傷模型，并評價護(hù)肝益肺方對其的肝保護(hù)作用。

表1 護(hù)肝益肺方水提物對肝損害小鼠模型肝臟生化指標(biāo)影響/（U/L，）

表1 護(hù)肝益肺方水提物對肝損害小鼠模型肝臟生化指標(biāo)影響/（U/L，）

注：與模型組比較，aP＜0.05，ALT為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，ALP為堿性磷酸酶，TBIL為總膽紅素

表2 護(hù)肝益肺方水提物對肝損害小鼠模型肝組織病理的影響

表3 護(hù)肝益肺方水提物對肝損害小鼠的GSH、SOD、MDA的影響（n＝10）

肝臟是脂肪轉(zhuǎn)化的場所，需要經(jīng)過肝靜脈運(yùn)輸?shù)缴眢w的各個部位，肝淤血導(dǎo)致肝靜脈不能及時的運(yùn)輸走脂肪，肝細(xì)胞中的脂肪變性變?yōu)槊黠@［10］。本實(shí)驗(yàn)的肝臟病理檢查結(jié)果顯示，由利福平+異煙肼干預(yù)制備的模型組均不同程度出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫，羽毛樣、脂肪變性。脂肪變性較為嚴(yán)重的切片中可觀察伴有大量慢性炎性細(xì)胞充斥在肝細(xì)胞中、個別可見散在的膽汁淤積等現(xiàn)象。有的切片中還出現(xiàn)微小脂肪性病毒，體積不大但數(shù)量較多；中央靜脈周圍變形較明顯，匯管區(qū)脂肪變性不明顯，屬重度脂肪性病變。以上表明由利福平+異煙肼干預(yù)制備的肝損傷小鼠模型制備成功，且符合抗結(jié)核藥作用特點(diǎn)。經(jīng)護(hù)肝益肺全方及護(hù)肝方治療后，小鼠肝臟僅個別肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死，肝細(xì)胞變性壞死程度較造模組輕，匯管區(qū)僅見少量炎細(xì)胞浸潤，表明護(hù)肝益肺全方及護(hù)肝方對抗結(jié)核藥所致小鼠肝細(xì)胞性損傷具有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)生化檢測結(jié)果顯示：護(hù)肝益肺方全方及拆方過后的護(hù)肝方能顯著降低抗結(jié)核藥造成的藥物性肝損害小鼠血清ALP、TBIL升高的水平；能顯著升高藥物性肝損害小鼠肝勻漿中SOD、GSH 降低的水平且能抑制肝組織中MDA的升高；文獻(xiàn)報道護(hù)肝益肺方藥中部分中藥能降低藥物性肝損害小鼠肝組織變性、甚至壞死的程度，具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用［11］。表明護(hù)肝益肺顆粒全方能對異煙肼+利福平聯(lián)用所致藥物性肝損傷小鼠發(fā)揮較好的肝保護(hù)作用，且作用機(jī)制與抗氧化作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報道復(fù)方中藥對異煙肼致肝損害保護(hù)作用相吻合，這為中藥復(fù)方與抗結(jié)核藥聯(lián)用治療結(jié)核病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。而實(shí)驗(yàn)后續(xù)中，將繼續(xù)研究護(hù)肝益肺方藥其他提取物對抗結(jié)核藥致肝損害的保護(hù)作用。