于盼盼，楊忠杰，郭麗娜，王單單，田會(huì)東，程鐵峰，王瑞

作者單位：1漯河市中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南 漯河 462300；2河南大學(xué)藥學(xué)院，河南 開封 475000

蒼耳子為菊科植物蒼耳的干燥成熟帶總苞的果實(shí)，具有散風(fēng)寒、通鼻竅、祛風(fēng)濕的功效，用于風(fēng)寒頭痛、鼻鼽、鼻淵、風(fēng)疹瘙癢、濕痹拘攣［1］。蒼耳子已報(bào)道的主要化學(xué)成分有揮發(fā)油類、甾醇類、倍半萜內(nèi)酯類、水溶性苷類、酚酸及其衍生物、黃酮類、蒽醌類及其他化合物［2-6］。現(xiàn)代藥理研究表明蒼耳子有抗微生物、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗過(guò)敏作用，另外還有研究表明其具有抗腫瘤作用、對(duì)免疫系統(tǒng)的、心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)也有一定的影響［7-11］。中藥是多成分、多途徑和多靶點(diǎn)協(xié)同作用的復(fù)雜體系，因其化學(xué)成分復(fù)雜，使得中藥的深入研究困難重重，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則為重要復(fù)雜成分研究提供了新的思路和方法。網(wǎng)絡(luò)藥理

學(xué)基于“藥物-靶點(diǎn)-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)，從整體角度、系統(tǒng)性預(yù)測(cè)藥物多成分和多靶點(diǎn)的關(guān)系，強(qiáng)調(diào)從“單靶標(biāo)”向“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”模式發(fā)展［12］。本文自2018年10月至2019年3月采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對(duì)蒼耳子主要活性組分與作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期為蒼耳子進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 成分篩選本研究通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）檢索蒼耳子的所有化學(xué)成分。含有相關(guān)的化學(xué)成分為111個(gè)。對(duì)所檢索化學(xué)成分進(jìn)行篩選，化合物口服生物利用度（OB）篩選閾值為OB≥30%，化合物類藥性（DL）篩選閾值為DL≥0.15。通過(guò)條件篩選，111個(gè)化合物分子中有14個(gè)符合條件，將其作為候選化合物。

1.2 候選化合物“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建采用TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/target.php）在線靶標(biāo)預(yù)測(cè)平臺(tái)，對(duì)其候選化合物名稱進(jìn)行檢索，整理其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，并在Uniprot（https：//www.uniprot.org）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化基因名，所有靶點(diǎn)均為人源，最終整合化學(xué)成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。將虛擬篩選出的候選化合物和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)得到的靶點(diǎn)基因輸入Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape 3.7.0是一款可以圖形化顯示網(wǎng)絡(luò)并可進(jìn)行分析和編輯的軟件。

1.3 對(duì)成分靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集與成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https：//david.ncifcrf.gov）對(duì)所預(yù)測(cè)的化學(xué)成分靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集，以P＜0.01 對(duì)所富集的通路進(jìn)行篩選，并通過(guò)Omicshare 3.0（http：//www.omicshare.com）進(jìn)行可視化處理。利用Cytoscape 3.7.0對(duì)所富集的通路進(jìn)行成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建。分析成分、靶點(diǎn)和通路的相互作用，采用Cytoscape 中插件Network Analyzer 對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 OB和DL預(yù)測(cè)以O(shè)B≥30%和DL≥0.15作為蒼耳子活性成分的篩選條件，共篩選出14個(gè)候選化合物，其中4個(gè)化合物MOL007326［Cynarin（e）］、MOL008647（Moupinamide）、MOL011169（Peroxyergosterol）、MOL011676（carboxyatractyloside）在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到相關(guān)靶點(diǎn)，故共獲得蒼耳子的主要候選化合物10個(gè)，候選化合物基本信息如表1所示。

2.2 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖分析根據(jù)篩選所得到的10 個(gè)候選化合物與其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0進(jìn)行成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，如圖1所示。該圖包括86 個(gè)節(jié)點(diǎn)（10 個(gè)活性成分和76 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)）和108條線，其中藍(lán)色圓形代表候選化合物，綠色方形代表相關(guān)靶點(diǎn)，線表示活性成分和相關(guān)靶點(diǎn)的關(guān)系。度值（Degree）和介數(shù)值（betweenness）可反映節(jié)點(diǎn)的重要性，本圖中節(jié)點(diǎn)的大小表示度值的大小。

表1 蒼耳子預(yù)測(cè)的10個(gè)候選化合物信息

圖1 蒼耳子主要化合物-靶點(diǎn)（C-T）網(wǎng)絡(luò)圖

從圖1 中可知，化合物MOL000358（β-谷甾醇）有最多的潛在靶標(biāo)（36 個(gè)），其次是MOL000471（蘆薈大黃素）和MOL000011（黃花菜木脂素A）分別有23和18個(gè)潛在靶標(biāo)，靶點(diǎn)較多的活性成分可能在蒼耳子的藥理功能中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究表明，β-谷甾醇具有抗氧化、降低膽固醇、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用［13］；蘆薈大黃素具有心血管保護(hù)、保肝、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、皮膚調(diào)理、免疫調(diào)節(jié)及瀉下等藥理作用［14］，黃花菜木脂素A具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抑制平滑肌收縮、降血脂等作用［15］。在相關(guān)靶點(diǎn)中，細(xì)胞核受體共激活劑2（NCOA2），前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2），孕酮受體（PGR）的度值分別為6、5、4，表明活性成分在靶點(diǎn)上具有協(xié)同作用。其中PTGS2 是經(jīng)典炎癥靶點(diǎn)，與5個(gè)化合物相互作用，可能是蒼耳子發(fā)揮藥效的關(guān)鍵靶標(biāo)。其中19 個(gè)靶點(diǎn)至少與兩個(gè)活性成分相連，說(shuō)明了蒼耳子發(fā)揮藥效是多靶點(diǎn)協(xié)同作用的結(jié)果。

2.3 潛在靶點(diǎn)富集分析為闡明蒼耳子中主要成分的作用機(jī)制，采用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所預(yù)測(cè)的76個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析共得到85 條通路，根據(jù)P＜0.001 進(jìn)行篩選，篩選所得通路共37 條，涉及癌癥信號(hào)通路（Pathways in cancer）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路（Neuroactive ligand-receptor interaction）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/AKT（蛋白激酶B）信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、乙肝（Hepatitis B）、鈣離子信號(hào)通道（Calcium signaling pathway）、甲狀腺激素信號(hào)通路（Thyroid hormone signaling pathway）、癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、小細(xì)胞肺癌（Small cell lung cancer）等，見表2。

表2 富集分析中通路信息（前10條通路）

利用Omicshare 平臺(tái)對(duì)靶標(biāo)命中數(shù)量排名前20的通路進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖2。通路富集中度值較大的神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路（Neuroactive ligand-receptor interaction）、乙肝（Hepatitis B）和癌癥信號(hào)通路（Pathways in cancer），可能是蒼耳子發(fā)揮其神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及抗腫瘤作用的主要作用通路。另外通路富集中P值排名前二十的通路中有10個(gè)與腫瘤相關(guān)，5個(gè)與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，預(yù)測(cè)蒼耳子作用靶點(diǎn)的通路可能在治療腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)上也有優(yōu)勢(shì)。

圖2 蒼耳子主要成分富集通路氣泡圖（前20）

2.4 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治霾捎肅ytoscape 3.7.0 對(duì)所篩選得到的10 個(gè)成分、37 條通路以及其相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。共得到節(jié)點(diǎn)99個(gè)（包括9個(gè)化合物，53個(gè)靶點(diǎn)，37個(gè)通路），邊413條，見圖3。其中一個(gè)化合物、23個(gè)靶點(diǎn)未富集到通路。對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，結(jié)果顯示排名前十的靶點(diǎn)分別為PIK3CG，RELA，TP53，PRKCA，CASP3，CASP9，TNF，BCL2，JUN，BAX等靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)具有較高的度值，說(shuō)明這些靶點(diǎn)在蒼耳子發(fā)揮抗腫瘤、抗炎、免疫系統(tǒng)作用等藥效的過(guò)程中具有重要作用。

圖3 蒼耳子“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

度值最大的通路PIK3CG 是磷脂酰肌醇3-OH激酶（PI3K）的一個(gè)催化亞基，參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、炎癥反應(yīng)［16］，另外該基因的沉默可導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展［17］。RELA是NF-κB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的一個(gè)亞型，NF-κB 通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2 細(xì)胞因子的比例，可降低IgE的表達(dá)，進(jìn)而影響變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生發(fā)展［18］。體現(xiàn)了蒼耳子治療疾病的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用。

3 討論

蒼耳子現(xiàn)有研究主要為抗腫瘤、抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖等［19］，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)蒼耳子的活性成分、作用靶點(diǎn)、主要信號(hào)通路等方面的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了分析。共篩選出10個(gè)候選化合物，相關(guān)靶點(diǎn)76 個(gè)，相關(guān)通路共37 條。度值前三的候選化合物為β-谷甾醇、蘆薈大黃素、黃花菜木脂素A，β-谷甾醇具有抗腫瘤、抗炎、降膽固醇等活性［20］；蘆薈大黃素可以明顯改善NASH 肝細(xì)胞的脂肪變性、炎癥浸潤(rùn)等病理?yè)p害［21］。度值前三的靶點(diǎn)為PIK3CG，RELA，TP53，其中PIK3CG 在心肌梗死、血栓形成及動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病中起著重要作用［22］，預(yù)示蒼耳子可能具有治療心血管疾病的作用。作用靶點(diǎn)參與的作用通路涉及神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、乙肝、免疫系統(tǒng)及抗腫瘤等通路，其中有10條與腫瘤相關(guān)，5 條與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。由此可推斷蒼耳子可通過(guò)炎癥、免疫等通路起到散風(fēng)寒、通鼻竅、祛風(fēng)濕的功效。同時(shí)本研究顯示，蒼耳子還可能通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤等通路發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)及抗腫瘤等作用，為蒼耳子進(jìn)一步深入探討作用機(jī)制及研究方向奠定了良好基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)蒼耳子的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和相關(guān)通路進(jìn)行了探索性研究。研究結(jié)果初步驗(yàn)證了蒼耳子的基本藥理學(xué)作用和相關(guān)機(jī)制，并為進(jìn)一步深入探討作用機(jī)制奠定了良好基礎(chǔ)。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新興的藥物研究手段，還存在一定的局限性，依托數(shù)據(jù)庫(kù)以數(shù)據(jù)研究為基礎(chǔ)對(duì)其藥效進(jìn)行研究，還需要更多藥理實(shí)驗(yàn)研究才能將得出的結(jié)論應(yīng)用于臨床。同時(shí)，本研究在篩選化合物中存在局限性，可能導(dǎo)致主要成分篩選不充分，藥理作用研究不全面；中藥在炮制前后成分可能發(fā)生改變，并且藥效、毒性也會(huì)不同，藥效及機(jī)制研究不明確，尚需進(jìn)一步深入研究探討。