方松城，林釗宇，葉志佳，劉志國(guó)

作者單位：1東莞東華醫(yī)院口腔科，廣東 東莞 523110；2中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院口腔頜面頭頸外科，廣東 廣州 510000；3中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，廣東 廣州 510000

舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤，也是最常見的口腔鱗狀細(xì)胞癌之一，其惡性程度高，預(yù)后差［1］。傳統(tǒng)放化療常因腫瘤細(xì)胞耐藥或毒副作用大而導(dǎo)致治療效果差，研究和開發(fā)新的抗癌藥物，有效治療舌鱗癌是臨床研究的一個(gè)重點(diǎn)，中藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥，近年來(lái)在抗腫瘤方面具有獨(dú)特作用［2］。隱丹參酮（Cryptotanshinone，CT）是從傳統(tǒng)中藥丹參中提取出的有效成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化等活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒副作用，不僅能阻礙腫瘤細(xì)胞增殖，而且可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞程序性死亡，從而在一定的程度上阻礙腫瘤細(xì)胞侵襲和防止其向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)隱丹參酮可抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞活性、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4-5］。隱丹參酮還能誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG-2 細(xì)胞凋亡［6］；此外，隱丹參酮可以抑制舌鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7］。G 蛋白偶聯(lián)受體55（G protein-couple receptor 55，GPR55）在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生理代謝過(guò)程中具有重要作用，有研究表明GPR55 在鱗癌中過(guò)量表達(dá)，能增強(qiáng)鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)、侵襲、遷移等能力［8］。GPR55在喉鱗癌組織中高表達(dá)，并且與分化程度和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率有關(guān)，沉默GPR55 明顯抑制Hep-2 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［9］。GPR55 還能促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展［10］。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是細(xì)胞中的一個(gè)重要信號(hào)通路，在細(xì)胞的分化、增殖和凋亡以及細(xì)胞癌變、腫瘤侵襲等病理過(guò)程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用［11］。本文自2017年1月至2018年1月研究隱丹參酮對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制是否與GPR55和Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料舌鱗癌細(xì)胞SCC4購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibico 公司；LipofectamineTM2000 購(gòu)自Sigma 公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；MTT試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、BCA 試劑盒、RIPA 蛋白裂解液、SDS-PAGE 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；pcDNA-GPR55、si-GPR55載體質(zhì)粒均購(gòu)自金瑞斯生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 舌鱗癌細(xì)胞SCC4用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%二氧化碳飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3 d換液一次，待細(xì)胞融和至80%左右時(shí)，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物處理與分組 當(dāng)細(xì)胞融和至80%左右時(shí)，將細(xì)胞傳代接種至96 孔板中，用不同濃度的隱丹參酮（0、2、4、8、16、32 μmol/L）處理舌鱗癌細(xì)胞，分別記為0 CT 組、2 CT 組、4 CT 組、8 CT 組、16 CT組、32 CT 組；將pcDNA-con，pcDNA-GPR55、分別轉(zhuǎn)染至未經(jīng)任何處理的舌鱗癌細(xì)胞中，記為pcDNAcon組，pcDNA-GPR55組；將si-con、si-GPR55轉(zhuǎn)染至舌鱗癌細(xì)胞后用8 μmol/L 的隱丹參酮處理，分別記為CT+si-con 組、CT+si-GPR55 組，以未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照（NC），轉(zhuǎn)染均按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 在各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時(shí)加入20 μL（5 g/L）的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO 振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度（OD）值。細(xì)胞增殖抑制率（%）＝1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/空白對(duì)照組OD 值×100%。每組重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔，即樣本數(shù)n＝9。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，PBS 漂洗2 次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書，先后加入Annexin V-FITC 和PI 避光孵育。流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm 處的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 qRT-PCR 檢 測(cè)GPR55 mRNA的表達(dá)水平收集0 CT組、4 CT組、8 CT組細(xì)胞，研磨充分后加入Trizol 試劑提取總RNA，微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系，以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95 ℃30 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液裂解，4 ℃，12 000g離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜；加入二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣品重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.00 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的CT 對(duì)TSCC 細(xì)胞增殖的影響MTT 法檢測(cè)顯示，0 CT組、2 CT組、4 CT組、8 CT組、16 CT 組、32 CT 組細(xì)胞增殖抑制率分別為（0.00±0.02）%、（25.04±2.50）%、（68.56±5.86）%、（85.44±8.54）%、（88.25±8.82）%、（80.11±8.01）%，與不含隱丹參酮的細(xì)胞相比，不同濃度隱丹參酮處理組TSCC細(xì)胞的增殖抑制率均顯著升高（F＝284.028，P＜0.05）?？梢姡[丹參酮抑制TSCC細(xì)胞的增殖。

2.2 不同濃度CT對(duì)TSCC細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（表1，圖1A）顯示，與隱丹參酮濃度為0 的組相比，濃度為4 μmol/L 和8 μmol/L 的隱丹參酮組TSCC 細(xì)胞的凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（表2，圖1B）顯示，與隱丹參酮濃度為0 的組相比，濃度為4 μmol/L 和8 μmol/L的隱丹參酮組TSCC 細(xì)胞中Bax 的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）?？梢姡[丹參酮促進(jìn)TSCC細(xì)胞凋亡。

圖1 隱丹參酮對(duì)TSCC細(xì)胞凋亡的影響：A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B為蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

表1 不同濃度隱丹參酮（CT）對(duì)TSCC細(xì)胞凋亡的影響/

表1 不同濃度隱丹參酮（CT）對(duì)TSCC細(xì)胞凋亡的影響/

注：與0 CT組比較，aP＜0.05

2.3 不同濃度CT 對(duì)GPR55 表達(dá)的影響qRTPCR 和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖2，表2）顯示，與隱丹參酮濃度為0 的組相比，隱丹參酮濃度為4 μmol/L 和8 μmol/L 的隱丹參酮組TSCC細(xì)胞中GPR55 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）?？梢姡[丹參酮促進(jìn)GPR55的表達(dá)。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)不同濃度隱丹參酮（CT）處理TSCC細(xì)胞后GPR55蛋白表達(dá)

表2 不同濃度隱丹參酮（CT）對(duì)GPR55表達(dá)的影響/

表2 不同濃度隱丹參酮（CT）對(duì)GPR55表達(dá)的影響/

注：與0 CT組比較，aP＜0.05

2.4 高表達(dá)GPR55抑制TSCC細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究MTT法檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示，與pcDNA-con組相比，pcDNA-GPR55組TSCC細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示，與pcDNA-con組相比，pcDNA-GPR55組TSCC細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖3，表3）顯示，與pcDNA-con組相比，pcDNA-GPR55組TSCC細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平顯著降低，Bax、GPR55表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）?？梢?，高表達(dá)GPR55抑制TSCC細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)GPR55、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

2.5 低表達(dá)GPR55 可以逆轉(zhuǎn)CT 對(duì)TSCC 細(xì)胞增殖和凋亡的影響MTT 法檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示，與NC 組相比，CT 組TSCC 細(xì)胞增殖抑制率顯著升高；與CT+si-con 組相比，CT+si-GPR55 組TSCC 細(xì)胞增殖抑制率顯著降低（P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示，與NC 組相比，CT 組TSCC 細(xì)胞凋亡率顯著升高；與CT+si-con 組相比，CT+si-GPR55 組TSCC 細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖4，表4）顯示，與NC 組相比，CT組TSCC 細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低，Bax 表達(dá)水平顯著升高；與CT+si-con 組相比，CT+si-GPR55組TSCC細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平顯著升高，Bax、GPR55 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。可見，低表達(dá)GPR55可以逆轉(zhuǎn)CT對(duì)TSCC細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)的作用。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)GPR55、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)β-catenin 蛋白表達(dá)結(jié)果（圖5）顯示，與NC 組（0.75±0.08）相比，CT組TSCC細(xì)胞中β-catenin表達(dá)水平（0.26±0.03）顯著降低；與CT+si-con 組（0.30±0.03）相比，CT+si-GPR55 組TSCC 細(xì)胞中β-catenin 表達(dá)水平（0.62±0.06）顯著升高（F＝176.212，P＜0.05）。

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)

3 討論

舌鱗狀細(xì)胞癌具有易早期轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，死亡率高，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，開發(fā)療效更好的腫瘤藥物以有效防止疾病復(fù)發(fā)，最終提高患者生存率是亟需的［12］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮具有顯著的抗腫瘤效果，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮通過(guò)抑制STAT3 的磷酸化而抑制舌鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7］；隱丹參酮還能抑制人肺腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。以上研究均表明隱丹參酮具有抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的隱丹參酮處理后，舌鱗狀癌細(xì)胞中細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低，Bax表達(dá)水平顯著升高。Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，Bax是促凋亡因子，Bcl-2是抑凋亡因子，Bax高表達(dá)和Bcl-2低表達(dá)水促進(jìn)細(xì)胞凋亡［15］。表明隱丹參酮可抑制舌鱗狀癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

據(jù)報(bào)道G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-couple receptor，GPCR）與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種惡性（bleeding on probing，BOP）陽(yáng)性（+），X 線牙片顯示生物學(xué)行為密切相關(guān)［16］。GPR55是GPCR家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)GPR55減少了體內(nèi)外胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［17］。敲低GPR55 促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和黏附［18］；lncRNA H19 通過(guò)調(diào)控GPR55 抑制舌鱗癌增殖、遷移與侵襲［19］。以上研究結(jié)果表明GPR55在腫瘤中可能是一個(gè)抑癌因子，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)GPR55，細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率顯著升高，CyclinD1、Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低，Bax 表達(dá)水平顯著升高。CyclinD1 是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子，其高表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞過(guò)度增殖而導(dǎo)致癌變，低表達(dá)可控制癌細(xì)胞增殖［20］。說(shuō)明過(guò)表達(dá)GPR55 可抑制舌鱗狀癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)隱丹參酮處理后GPR55表達(dá)水平升高，而低表達(dá)GPR55 逆轉(zhuǎn)了隱丹參酮對(duì)舌鱗狀癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。說(shuō)明，隱丹參酮可能通過(guò)調(diào)控GPR55表達(dá)影響舌鱗狀癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

表3 高表達(dá)GPR55抑制TSCC細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究/

表3 高表達(dá)GPR55抑制TSCC細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究/

注：與pcDNA-con組比較，aP＜0.05

表4 低表達(dá)GPR55可以逆轉(zhuǎn)CT對(duì)TSCC細(xì)胞增殖和凋亡的影響/

表4 低表達(dá)GPR55可以逆轉(zhuǎn)CT對(duì)TSCC細(xì)胞增殖和凋亡的影響/

注：與NC組比較，aP＜0.05；與CT+si-con組比較，bP＜0.05

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，β-catenin 表達(dá)下調(diào)顯著抑制舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［21］。沉默β-catenin 抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞SCC12增殖［22］。而激活Wnt/β-catenin通路可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移［23］。在本實(shí)驗(yàn)中，隱丹參酮處理舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞后Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin的表達(dá)顯著降低，且隱丹參酮抑制了舌鱗狀癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。說(shuō)明隱丹參酮可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路而抑制舌鱗狀癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，低表達(dá)GPR55 逆轉(zhuǎn)了隱丹參酮對(duì)β-catenin 表達(dá)的抑制作用。提示，隱丹參酮可能通過(guò)GPR55調(diào)控Wnt/βcatenin信號(hào)通路進(jìn)而影響舌鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展。

綜上所述，隱丹參酮可抑制舌鱗狀癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控GPR55 及Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。將可為舌鱗狀細(xì)胞癌的治療提供新思路和新靶點(diǎn)。