余龍霞，吳 香，李新福，張萬剛，李 聰，徐寶才,,3,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095；2.江蘇雨潤肉食品有限公司，肉品加工與質(zhì)量控制國家重點實驗室，江蘇 南京 211806；3.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601）

低溫肉制品是采用較低溫度（68～85 ℃）進(jìn)行熱加工使其中心溫度達(dá)到68～72 ℃并保持30 min，在嚴(yán)格的低溫車間（0～4 ℃）中生產(chǎn)，低溫冷鏈下運輸、銷售，最大限度地保留了肉制品原有風(fēng)味的一類熟肉制品[1]。這類產(chǎn)品因加工溫度低導(dǎo)致殺菌不徹底，且后續(xù)的切片工藝中可能存在二次污染，使得產(chǎn)品貨架期短[2]。近年來，超高壓殺菌在肉制品中的應(yīng)用研究越來越多。超高壓殺菌技術(shù)在延長肉制品貨架期的同時，能最大程度保持產(chǎn)品原有風(fēng)味、營養(yǎng)價值、感官品質(zhì)及質(zhì)構(gòu)特性[3-4]。 但是韓衍青[5]研究發(fā)現(xiàn)，即使在經(jīng)過600 MPa超高壓處理的低溫切片火腿中，仍然有部分細(xì)菌存活，成為制約其貨架期的優(yōu)勢菌群，綠色魏斯氏菌（Weissella viridescens）即為其中一種。Patterson等[6]從超高壓處理后的雞肉制品中分離到的優(yōu)勢腐敗菌主要為綠色魏斯氏菌。Diez等[7]應(yīng)用變性梯度凝膠電泳技術(shù)分析了超高壓處理后血腸中的微生物多樣性變化，確定綠色魏斯氏菌和腸膜明串珠菌是優(yōu)勢耐壓腐敗菌。因此該菌已成為目前證實的超高壓低溫肉制品中的典型腐敗菌。

綠色魏斯氏菌除能夠耐受超高壓處理外，其他不利條件如有機酸處理也無法徹底將其殺滅[8-9]。當(dāng)僅使用超高壓處理時，一些耐壓微生物在1 000 MPa壓力下仍能存活，而超高壓結(jié)合一定的溫度（high pressure thermal sterilization，HPTS）處理后使其很快失活[10]。

高芳[11]采用40～50 ℃結(jié)合300～500 MPa對接種綠色魏斯氏菌（106～107CFU/g）的煙熏火腿超高壓處理5～20 min，通過建立熱壓結(jié)合處理對耐壓腐敗菌的失活動力學(xué)模型，最終確定熱壓結(jié)合處理參數(shù)為壓力350 MPa、溫度50 ℃、保壓時間10 min。韓衍青[5]研究了超高壓處理和熱處理后綠色魏斯氏菌的生理狀態(tài)變化，探索了兩種滅菌方法對微生物抑制機制的不同之處。高瑀瓏等[12]用熒光偏振技術(shù)測定大腸桿菌細(xì)胞膜經(jīng)超高壓作用后熒光偏振度和微黏度的變化，研究了超高壓處理對大腸桿菌細(xì)胞膜的損傷情況和超高壓滅活細(xì)菌的機制。陸海霞等[13]通過3 種分光光度法測定超高壓處理對細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響，明確了超高壓處理對細(xì)菌細(xì)胞膜損傷作用和致死機理。對于超高壓致死細(xì)菌和熱處理致死細(xì)菌的機理已有一定的研究，但是關(guān)于熱壓結(jié)合處理對綠色魏斯氏菌的致死機制的研究鮮見報道。

本研究以前人實驗為基礎(chǔ)，在高芳[11]優(yōu)化出的最優(yōu)熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）條件的前提下，對綠色魏斯氏菌進(jìn)行超高壓處理和熱壓結(jié)合處理，從細(xì)菌存活率、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜通透性改變等方面探究最優(yōu)的熱壓結(jié)合處理在致死細(xì)菌過程中發(fā)揮的作用，以期為耐壓腐敗菌失活模型的商業(yè)化進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠色魏斯氏菌從低溫火腿中分離，經(jīng)生理生化及 16S rDNA鑒定。

平板計數(shù)瓊脂、M R S 瓊脂、M R S 肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1,2-丙二醇（分析純） 國藥集團化學(xué)制劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FR-400A型手壓式塑料薄膜封口機 上海森和包裝器材有限公司；SPF-S-1L-100-850-9-W型超高壓處理 裝置 英國Stansted Fluid Power公司；Scan 1200自動影像分析菌落計數(shù)器 法國Interscience公司；FP1100-C全自動細(xì)菌生長記錄儀 芬蘭Bioscreen公司；3000N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；JEM-1011透射電子顯微鏡 日本JEOL公司；EM UC7超薄切片機 德國徠卡公司；M2e多功能酶標(biāo)儀 德國MD公司；Accuri C6流式細(xì) 胞儀 美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

挑取綠色魏斯氏菌單菌落接種于5 mL MRS肉湯中，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取1 mL活化好的菌懸液接種于50 mL MRS肉湯中，30 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期。取培養(yǎng)好的菌懸液8 000h g、4 ℃離心5 min，棄上清液，用pH 7.0磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重復(fù)洗滌菌體3 次，調(diào)整菌懸液濃度至108～109CFU/mL。

1.3.2 菌懸液超高壓及熱處理

超高壓處理[14]：將裝有菌懸液的包裝袋置于超高壓加壓釜中，放入超高壓儀器中，處理介質(zhì)為體積分?jǐn)?shù)30% 1,2-丙二醇，壓力為350 MPa，處理溫度為25 ℃，保壓處理10 min，處理時間不包括升壓和卸壓所需時間，每個樣品平行3 次。

熱壓結(jié)合處理[11]：同超高壓處理步驟，設(shè)置處理溫度為50 ℃。

1.3.3 復(fù)蘇生長曲線的測定

吸取100 μL超高壓處理及熱壓結(jié)合處理的菌懸液于5 mL MRS肉湯中混勻，吸取200 μL菌懸液于96 孔板內(nèi)，每組3 個平行孔。將96 孔板置于全自動細(xì)菌生長記錄儀中，設(shè)置溫度為30 ℃，每隔2 h測一次。未處理組為未經(jīng)過處理的菌懸液，以MRS培養(yǎng)基為空白。

1.3.4 綠色魏斯氏菌存活率測定

將經(jīng)過1.3.2節(jié)處理后的菌懸液（兩重復(fù)），各無菌取樣0.5 mL進(jìn)行梯度稀釋，選擇3 個合適的稀釋度，未處理樣品用MRS培養(yǎng)基，超高壓處理樣品和熱壓結(jié)合處理后樣品采用薄層平板培養(yǎng)基[16]。采用平板涂布法進(jìn)行乳酸菌菌落總數(shù)的計數(shù)[17]，檢測限為1 CFU/mL。綠色魏斯氏菌數(shù)量以lg（CFU/mL）表示。存活率表示 為lg（N/N0），其中N0和N分別代表處理前和處理后的菌落數(shù)（CFU/mL）[18]。對數(shù)存活率為負(fù)值，數(shù)值越小，表示菌的失活率越高。

1.3.5 掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察

掃描電子顯微鏡觀察參考錢天樂[19]和莘似韻[20]等的處理方法，樣品經(jīng)過固定、干燥、脫水、置換、冷凍干燥后離子濺射鍍金，電子顯微鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)。透射電子顯微鏡觀察參考高瑀瓏等[21]的處理方法，上述脫水樣品進(jìn)行包埋、切片、染色后用透射電子顯微鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)。設(shè)置未處理的菌懸液和經(jīng)90 ℃加熱10 min的菌懸液為未處理組，以對比確定實驗組菌體的結(jié)構(gòu)變化。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)分析

熒光染色標(biāo)記：染色方法參考孔曉雪等[22]對大腸桿菌的染色方法。吸取超高壓處理、熱壓結(jié)合處理的菌懸液各1 mL，8 000h g，4 ℃離心5 min，棄上清液，用PBS重新懸浮至106CFU/mL菌懸液，分別進(jìn)行碘化丙啶（propidium iodide，PI）單染、細(xì)胞增殖示蹤熒光探針（carboxyflourescein diacetate-succinimidyl ester，CFDA-SE） 單染及PI和CFDA-SE雙染。每個樣品重復(fù)3 次。染色在避光條件下進(jìn)行，染色結(jié)束后，8 000h g、4 ℃離心5 min，用PBS洗滌2 次去除過量的染色劑，重新懸浮，放置冰上備流式細(xì)胞分析。樣品從染色完成到流式細(xì)胞儀上機檢測時間間隔控制在1 h之內(nèi)。

流式細(xì)胞儀檢測[23]：CFDA-SE綠色熒光信號采集通過（530f 30）nm的帶通濾光片，在FL-1通道被收集，PI紅色熒光信號采集通過（650f 13）nm的帶通濾光片，在FL-3通道被收集。CFDA-SE和PI熒光信號的強度分別以熒光FL-1和FL-3表示。

1.3.7 菌體細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)泄漏量的測定

將超高壓處理和熱壓結(jié)合處理的菌懸液于4 ℃、6 000h g離心15 min，收集上清液，使用紫外分光光度計測定260 nm（核酸）和280 nm（蛋白質(zhì)）波長處的吸光度[24]，每組設(shè)置3 個平行，未處理的菌懸液為未處理組。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析、Duncan’s多重比較檢驗和t檢驗進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理和熱壓結(jié)合處理對細(xì)菌生長特性的影響

通過測量綠色魏斯氏菌熱壓結(jié)合處理前后的生長曲線來研究細(xì)菌的生長情況。圖1中當(dāng)吸光度達(dá)到最大并保持穩(wěn)定時，表明菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，圖2的一階導(dǎo)數(shù)圖中當(dāng)縱坐標(biāo)達(dá)到最大時表明菌體生長進(jìn)入對數(shù)期。由圖2可看出，綠色魏斯氏菌未經(jīng)處理的正常菌株從6 h開始進(jìn)入對數(shù)期，在12～14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600nm為1.16；超高壓處理（350 MPa、25 ℃）后菌株從10 h進(jìn)入對數(shù)期，穩(wěn)定期在16～18 h，此時OD600nm為1.07；熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）后菌株從22 h進(jìn)入對數(shù)期，穩(wěn)定期在28～30 h，此時OD600nm為0.94。

圖 1 超高壓和熱壓結(jié)合處理前后綠色魏斯氏菌的生長曲線Fig. 1 Growth curves of W. viridescens treated or not treated by UHP or HPTS

圖 2 超高壓和熱壓結(jié)合處理前后綠色魏斯氏菌生長曲線的一階導(dǎo)數(shù)圖Fig. 2 First derivative of the growth curves of W. viridescens treated or not treated by UHP or HPTS

在超高壓處理（350 MPa、25 ℃）和熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）后，綠色魏斯氏菌到達(dá)穩(wěn)定期的時間均延后。超高壓處理（350 MPa、25 ℃）后，菌種進(jìn)入對數(shù)期的時間延遲4 h，且達(dá)到穩(wěn)定期的時間也延后4～6 h，但是經(jīng)歷過這段時間的恢復(fù)后其吸光度可以達(dá)到之前的水平（P＞0.05）。但熱壓結(jié)合（350 MPa、50 ℃）處理后綠色魏斯氏菌在前12 h內(nèi)的生長速率為0，進(jìn)入對數(shù)期的時間比超高壓處理（350 MPa、25 ℃）延后12 h，且菌株的最大生長濃度也不能達(dá)到未處理或超高壓處理時的水平（P＜0.05）。結(jié)果表明，綠色魏斯氏菌可以耐受350 MPa的超高壓，在后續(xù)適宜的培養(yǎng)環(huán)境中，菌種的生長在遲滯一段時間后可以恢復(fù)到原來的狀態(tài)。但是經(jīng)過熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）后，細(xì)菌的遲滯期延長，并且其生長的濃度不能恢復(fù)到原來的水平。因此，超高壓協(xié)同熱處理對部分的綠色魏斯氏菌造成了不可逆的損傷，即使在適宜的環(huán)境及充足的營養(yǎng)條件下，也不能恢復(fù)生長。

2.2 超高壓處理和熱壓結(jié)合處理對細(xì)菌存活率的影響

表 1 綠色魏斯氏菌的存活率Table 1 Survival rates of W. viridescens

通過測定綠色魏斯氏菌的存活率來探究熱壓結(jié)合處理殺菌的效果。由表1 可以看出，經(jīng)熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）后菌體數(shù)量由超高壓處理（350 MPa、25 ℃）時的7.67（lg（CFU/mL））顯著下降到5.71（lg（CFU/mL））（P＜0.05），熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）后綠色魏斯氏菌的存活率較經(jīng)過超高壓處理（350 MPa、25 ℃）后存活率顯著下降 （P＜0.05），說明熱壓結(jié)合處理能顯著降低綠色魏斯氏菌的存活率。因此，熱壓結(jié)合處理使細(xì)胞處于死亡狀態(tài)或亞致死狀態(tài)而不可計數(shù)。

2.3 掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡結(jié)果

圖 3 綠色魏斯氏菌掃描電子顯微鏡圖Fig. 3 Scanning electron microscopic examination of W. viridescens

通過掃描電子顯微鏡可直觀的觀察細(xì)菌形態(tài)的變化。以未經(jīng)任何處理和熱處理（90 ℃、10 min）的綠色魏斯氏菌為未處理組，確定細(xì)菌外觀的變形程度。由圖3可看出，綠色魏斯氏菌未經(jīng)處理組樣品細(xì)胞具有典型的桿狀外型，胞體表面光滑規(guī)整，菌體飽滿，邊緣線條流暢，未見細(xì)胞破損情況。熱處理后，部分細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)破損、缺失和凹陷，少部分細(xì)胞外部結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重變形。超高壓處理（350 MPa、25 ℃）與未處理組外觀基本相似，絕大部分菌體飽滿，菌體表面有不同程度的輕微凹陷，細(xì)胞膜、壁完整，少部分菌體出現(xiàn)井噴現(xiàn)象（圖3B中箭頭指出），細(xì)胞膜破裂，表面有黏附物。熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）后，菌體外觀和表面結(jié)構(gòu)有顯著變化，大部分細(xì)胞外部結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重變形，表面出現(xiàn)褶皺，細(xì)胞邊緣粗糙，無飽滿感。細(xì)胞膜本身具有一定的流動性和彈性[25]，但是超高壓處理和熱壓結(jié)合處理后細(xì)菌細(xì)胞表面的凹陷并沒有恢復(fù)，說明熱壓結(jié)合處理的協(xié)同作用會破壞細(xì)胞膜的彈性，使大部分綠色魏斯氏菌外部形態(tài)發(fā)生了顯著性變化，其結(jié)構(gòu)變形加劇，從而表面出現(xiàn)嚴(yán)重褶皺。

圖 4 綠色魏斯氏菌透射電子顯微鏡圖Fig. 4 Transmission electron microscopic examination of W. viridescens

通過透射電子顯微鏡可直觀地觀察細(xì)菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。由圖4可看出，未處理組綠色魏斯氏菌顯示菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰。細(xì)胞壁邊緣整齊，表面光滑，呈現(xiàn)較規(guī)則的桿狀，菌體細(xì)胞質(zhì)分布均勻。熱處理后細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重變形，且細(xì)胞內(nèi)的白色不透明聚集增多。超高壓處理（350 MPa、25 ℃）后的綠色魏斯氏菌菌體細(xì)胞開始變形，但是能基本維持正常形狀，大部分菌體細(xì)胞質(zhì)均勻分布，部分細(xì)胞開始出現(xiàn)白色不透明聚集。經(jīng)熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）的菌體細(xì)胞嚴(yán)重變形，大部分菌體已無正常菌體細(xì)胞的桿狀，細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜層次模糊，極少數(shù)菌體細(xì)胞質(zhì)均勻分布。部分菌體細(xì)胞中心出現(xiàn)大面積透電子區(qū)[19]（圖4C中箭頭指出），同時也出現(xiàn)了大面積的白色不透明區(qū)域，可能與細(xì)胞質(zhì)蛋白變性有關(guān)，這與Moussa等[26]的研究結(jié)果相一致。說明熱壓結(jié)合處理使綠色魏斯氏菌的內(nèi)部蛋白質(zhì)變性并產(chǎn)生大面積的透電子區(qū)，使菌體失去正常的生理功能。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果

2.4.1 單染分析結(jié)果

綠色魏斯氏菌經(jīng)超高壓處理（350 MPa、25 ℃）和熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）后流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見圖5和表2，未處理組綠色魏斯氏菌也有極少部分菌體被PI染色和不被CFDA-SE染色。熱處理（95 ℃、30 min）后，絕大多數(shù)綠色魏斯氏菌均能被PI染色。由表2可知，在經(jīng)過熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）之后，被PI染色的綠色魏斯氏菌數(shù)量較超高壓處理（350 MPa、25 ℃）顯著增加（P＜0.05）。PI染色可反映菌體細(xì)胞膜完整性，CFDA-SE染色可反映胞內(nèi)酯酶活性。說明熱壓結(jié)合處理使菌體細(xì)胞膜破壞嚴(yán)重，菌體受損程度加劇，死亡細(xì)胞和膜受損嚴(yán)重的細(xì)胞顯著增加 （P＜0.05）。未處理組綠色魏斯氏菌均為CFDA-SE染色陽性；熱處理（95 ℃、30 min）后，80%左右綠色魏斯氏菌都為CFDA-SE染色陰性。但是綠色魏斯氏菌經(jīng)超高壓處理（350 MPa、25 ℃）和熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）后，細(xì)胞仍然表現(xiàn)為CFDA-SE染色陽性，表明綠色魏斯氏菌的胞內(nèi)酯酶活性對350 MPa的超高壓并不敏感，這與韓衍青[5]的研究結(jié)果一致，而且熱壓結(jié)合處理中的熱處理也對酯酶活性無顯著影響（P＞0.05）。

圖 5 綠色魏斯氏菌經(jīng)超高壓處理后的CFDA-SE和PI熒光單參數(shù)直方圖Fig. 5 Fluorescence histograms of FL1 (CFDA-SE fluorescence) and FL3 (PI fluorescence) of W. viridescens cell suspensions after UHP and HPTS stained with CFDA-SE or PI

表 2 經(jīng)CFDA-SE和PI熒光染色后M2區(qū)域中綠色魏斯氏菌比例Table 2 Proportion of W. viridescens cell counts in M2 region through staining with CFDA-SE or PI

2.4.2 多參數(shù)流式細(xì)胞雙染色分析結(jié)果

采用PI和CFDA-SE雙染可以通過流式細(xì)胞二維圖譜獲取關(guān)于菌體的生理生化信息[27-28]。各門代表的細(xì)胞生理生化狀態(tài)見表3。圖6和表4描述了設(shè)門分析后經(jīng)PI和CFDA-SE 雙染色的綠色魏斯氏菌在各門中的數(shù)量分布情況。

表 3 各門中代表的微生物生理生化狀態(tài)Table 3 Gate designation of cells stained with CFDA-SE and PI

圖 6 超高壓處理后綠色魏斯氏菌經(jīng)CFDA-SE和PI雙染設(shè)門分析的 流式細(xì)胞二維點圖Fig. 6 Flow cytometric fluorescence dot plots of W. viridescens with UHP and HPTS in response to CFDA-SE/PI stained cells

表 4 門“LR”和門“UR”中綠色魏斯氏菌的比較Table 4 Comparison of percent cell counts in Gate “LR” and “UR” by flow cytometry

如圖6所示，未處理組絕大多數(shù)綠色魏斯氏菌存在于“LR”門，少部分細(xì)胞膜輕微損傷存在于“UR”門，還有極少部分細(xì)胞未被染料染色存在于“LL”門中。經(jīng)過超高壓處理（350 MPa、25 ℃）后，細(xì)胞膜完整的菌體減少，細(xì)胞膜受損或者細(xì)胞破碎的數(shù)量顯著增多 （P＜0.05），表現(xiàn)為門“LR”中的綠色魏斯氏菌數(shù)量逐漸向“UR”門遷移，表明在酯酶活性不改變的情況下，細(xì)胞膜破損的菌體數(shù)量增多（P＜0.05）。經(jīng)熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）后，“UR”門中的菌體數(shù)量比超高壓處理（350 MPa、25 ℃）組顯著增加（P＜0.05），而且與超高壓處理（350 MPa、25 ℃）相比，“UR”門中增加的菌體數(shù)量基本等于與超高壓處理（350 MPa、25 ℃）相比“LR”門減少的菌數(shù)量，說明熱壓結(jié)合處理中的熱處理不會改變綠色魏斯氏菌的酯酶活性，但是會使細(xì)胞膜損傷。

2.4.3 熱壓結(jié)合處理對細(xì)胞生理狀態(tài)的影響

計算超高壓處理（350 MPa、25 ℃）和熱壓處理（350 MPa、50 ℃）后綠色魏斯氏菌的正常菌數(shù)占未處理組正常菌數(shù)的比例，其中傳統(tǒng)平板計數(shù)法的結(jié)果是指不同處理組的TAL平板計數(shù)結(jié)果與未處理組的MRS平板計數(shù)結(jié)果的比值，設(shè)定未處理組為100%；流式細(xì)胞檢測法的結(jié)果是指不同處理組“LR”門菌體比例與未處理組“LR”門菌體比例的比值，同樣設(shè)定未處理組為100%。

圖 7 綠色魏斯氏菌流式細(xì)胞法和傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)法的比較結(jié)果Fig. 7 Viability assessment of W. viridescens using flow cytometry versus plate count method

由圖7 可知， 綠色魏斯氏菌經(jīng)超高壓處理（350 MPa、25 ℃）和熱壓處理（350 MPa、50 ℃）之后，由流式細(xì)胞方法得出的計數(shù)結(jié)果均極顯著高于傳統(tǒng)計數(shù)（P＜0.01）。對比超高壓處理（350 MPa、25 ℃）、熱壓處理（350 MPa、50 ℃）后流式細(xì)胞檢測方法與傳統(tǒng)計數(shù)存活率結(jié)果的差值更小，說明溫度的處理會進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜，促進(jìn)PI的染色。結(jié)果表明，流式細(xì)胞方法檢測到的正常菌顯著高于傳統(tǒng)平板計數(shù)法，原因是一部分處于亞致死狀態(tài)的細(xì)菌細(xì)胞膜受損不嚴(yán)重，PI染料未能結(jié)合染色，呈現(xiàn)正常菌的狀態(tài)，但是不能培養(yǎng)計數(shù)。從而進(jìn)入“有活力但不可培養(yǎng)”狀態(tài)[29]。

2.5 細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)類物質(zhì)泄漏量的變化

圖 8 不同處理綠色魏斯氏菌細(xì)胞紫外吸收物質(zhì)的泄漏量Fig. 8 Leakage of UV-absorbing substances out from W. viridescens cells with different treatments

細(xì)胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)泄漏量的變化：由于核酸中含有嘌呤、嘧啶堿基，蛋白質(zhì)中含酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)，這些結(jié)構(gòu)都具有共軛雙鍵（—Cü C＝Cü C＝C—）， 所以在紫外光區(qū)有強烈的光吸收作用，核酸和蛋白質(zhì)的最大吸收峰分別在260 nm和280 nm附近。因此采用最大吸收峰的強度來確定細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)物質(zhì)的泄漏情況。

由于高溫?zé)崽幚硎辜?xì)胞膜被破壞，呈全透性，胞內(nèi)核酸、蛋白物質(zhì)基本完全流出，故選用90 ℃處理30 min的綠色魏斯氏菌作為陽性對照，檢測膜通透性[24]。 由圖8可以看出，超高壓處理（350 MPa、25 ℃）后綠色魏斯氏菌上清液中核酸（260 nm）的泄漏量與未處理組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），說明350 MPa的超高壓處理對細(xì)胞膜通透性影響不顯著（P＞0.05）。而當(dāng)綠色魏斯氏菌經(jīng)熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）后，上清液中核酸、蛋白的泄漏量與未處理組和超高壓處理組（350 MPa、25 ℃）都顯著增加（P＜0.05），說明熱壓結(jié)合處理增加了細(xì)胞膜的通透性，使更多的核酸蛋白物質(zhì)流出到細(xì)胞外，從而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。但經(jīng)熱壓處理（350 MPa、50 ℃）后上清液中的泄漏程度仍與熱處理（90 ℃、30 min）相比存在顯著差異（P＜0.05），說明熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）對細(xì)胞膜的通透性影響并未達(dá)到熱處理的程度，殺滅機理與熱處理的殺滅機制不完全相同[30]。結(jié)果表明，協(xié)同熱處理能夠增大細(xì)胞膜的通透性，使得更多的細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白物質(zhì)流出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡，這與周敏等[31]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本實驗通過對細(xì)菌生長特性、形態(tài)特征、細(xì)胞膜通透性等生理指標(biāo)的檢測，探討了超高壓處理（350 MPa、25 ℃）和熱壓結(jié)合處理（350 MPa、50 ℃）對綠色魏斯氏菌細(xì)胞膜的損傷和細(xì)胞膜通透性的不同影響，明確了熱壓結(jié)合處理在（350 MPa、50 ℃）滅菌過程中所起的作用。

熱壓結(jié)合處理能顯著降低綠色魏斯氏菌的存活率，并且使綠色魏斯氏菌在后續(xù)營養(yǎng)充足的培養(yǎng)條件下無法完全恢復(fù)；在形態(tài)結(jié)構(gòu)變化方面，熱壓結(jié)合處理會使菌體表面出現(xiàn)嚴(yán)重褶皺，使細(xì)胞內(nèi)白色不透明聚集增多，協(xié)助熱處理引起的細(xì)胞膜損傷及內(nèi)含物質(zhì)變性凝固是導(dǎo)致微生物死亡的關(guān)鍵原因；在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)方面，熱壓結(jié)合處理可以通過改變細(xì)胞膜的通透性顯著提高受傷菌或死亡菌比例（P＜0.05），通過比較流式細(xì)胞檢測結(jié)果確定了溫度的升高使菌體的死亡率增加，細(xì)胞膜通透性增大導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)流出細(xì)胞外，可能影響細(xì)胞的正常代謝。

綜上所述，熱壓結(jié)合處理使細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化、細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增大和核酸蛋白質(zhì)的流失是綠色魏斯氏菌致死致傷的重要原因，其中細(xì)胞膜通透性的改變和菌體內(nèi)含物變性凝固是主要原因。