黃杰庭，許 茹，廖 峭，王 敏，單振剛，尤慶柱，戎 霞,4，付涌水,4

1 廣州血液中心，廣州 510095； 2 廣州市醫(yī)學(xué)重點實驗室(血液安全重點實驗室)，廣州 510095；3 韶關(guān)市第一人民醫(yī)院 耳鼻喉科，廣東 韶關(guān) 512000； 4 南方醫(yī)科大學(xué) 檢驗與生物技術(shù)學(xué)院輸血醫(yī)學(xué)系，廣州 510515

我國是HCV高流行地區(qū)，約有1000萬感染者[1]，其中75%～85%的感染者發(fā)展為慢性丙型肝炎(CHC)，后者有可能進一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、甚至肝癌或肝衰竭等[1-2]。HCV感染已經(jīng)成為我國不容忽視的公共衛(wèi)生問題。

HCV具有高度異質(zhì)性，根據(jù)基因序列的差異程度可分為7種基因型和超過80種亞型，HCV準確分型的金標準是基于病毒全長序列的系統(tǒng)進化分析[3]。目前主要通過分區(qū)段擴增和一代測序，把各段序列進行拼接得到HCV全長序列[4]。然而，由于HCV基因組的高度變異，這種方法不易獲得病毒全長序列，而且分區(qū)段擴增的策略增加了實驗操作的工作量和工作難度。此外，一代測序的靈敏度較低，僅能檢測豐度超過15%的突變或變異。因此，建立一種快速且高靈敏度的HCV全長序列測定方法，仍是當(dāng)前HCV研究熱點之一。

近年來，多種針對HCV的直接抗病毒藥物(direct-acting antivirals, DAA)已進入臨床應(yīng)用[5]。我國從2016年4月開始陸續(xù)引進和批準sofosbuvir等6種DAAs上市[6]。此前的標準治療方案為聚乙二醇干擾素聯(lián)合ribavirin，與其相比，DAA治療方案具有更高的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response, SVR)率、療程短和不良反應(yīng)少等優(yōu)點[5]。然而，仍有部分感染者未獲得SVR或出現(xiàn)停藥后復(fù)發(fā)，與基線耐藥相關(guān)置換(resistance associated substitution, RAS)密切相關(guān)[7]。命名RAS需要確定對應(yīng)的HCV蛋白以及氨基酸位點。以NS3 Q80K為例，RAS的首字母(Q)為野生型氨基酸，然后是氨基酸的位置(NS3蛋白的第80位)，后面跟的字母表示耐藥突變的氨基酸(K)[7]。體外研究[7]表明，NS3 Q80K可使simeprevir的抗病毒作用降低10倍；臨床使用daclatasvir聯(lián)合sofosbuvir治療HCV基因3型感染者時，無NS5A基線RAS患者的12周SVR率高達92%，而存在NS5A基線RAS患者則僅有54%。因此，對HCV感染者在進行個體化DAA治療前檢測基線RAS以選擇最佳藥物組合和治療方案，尤為重要。

本課題組在前期研究中通過基因片段擴增，發(fā)現(xiàn)1例獻血者可能感染了HCV 3b亞型。該亞型在廣州地區(qū)十分少見。在Genbank數(shù)據(jù)庫中，HCV 3b亞型的全長序列僅有13條，其中分離自中國的僅有2條。研究[8]發(fā)現(xiàn)感染HCV 3型(主要為3a亞型)的患者中，NS5A Y93H和A30K兩個基線RAS的頻率均為5%～10%。本研究采用二代測序法(next generation sequencing，NGS)分析該獻血者的HCV全長序列和基線RAS，為HCV 3b在廣州地區(qū)的分子流行病學(xué)研究和DAA治療方案的制訂提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 實驗編號為2584的無償獻血者(男性，30歲)于2016年7月在廣州血液中心參與無償獻血，血液篩查顯示其抗-HCV和HCV RNA呈反應(yīng)性，無HBV、HIV和梅毒螺旋體感染，ALT水平升高(203 IU/ml)。1個月后對該獻血者隨訪，抽取靜脈血5 ml，EDTA抗凝，離心后將血漿置-20 ℃保存，用于HCV RNA定量和NGS。本研究方案經(jīng)由廣州血液中心醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(編號：廣州血液中心醫(yī)倫〔2019〕第40號)，研究對象簽署知情同意書。

1.2 HCV RNA定量 研究對象的隨訪血漿標本送至廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心進行HCV RNA定量，采用實時熒光定量PCR法(Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan，德國羅氏診斷有限公司)。

1.3 血漿病毒核酸的提取 采用Ng等[9]報道的方法，將血漿標本經(jīng)0.45 μm濾器過濾去除細胞碎片后，取120 μl加入核酸酶混合物(RNase One Ribonuclease，普洛麥格生物技術(shù)有限公司；Turbo DNase，賽默飛世爾科技有限公司)于37 ℃孵育1.5 h以去除游離核酸。隨后使用QIAamp viral RNA mini kit(凱杰生物工程有限公司)，按照說明書的步驟提取病毒RNA。

1.4 序列非依賴性擴增 采用Ng等[9]報道的方法，以帶有9個隨機堿基(N)和18個固定堿基的逆轉(zhuǎn)錄引物(GCCGACTAATGCGTAGTCNNNNNNNNN)，采用SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis Kit(賽默飛世爾科技有限公司)將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后采用Platinum Taq Hot-Start PCR Master Mix(賽默飛世爾科技有限公司)對cDNA進行PCR擴增，PCR引物序列與逆轉(zhuǎn)錄引物的18個固定堿基一致。

1.5 二代測序(NGS) 上述PCR產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技有限公司，采用Illuminate Hiseq進行2×150 bp雙末端測序。

1.6 測序數(shù)據(jù)的處理分析 參照Thomson等[10]報道的方法，對NGS獲得的原始序列(Raw reads)，采用Babraham Bioinformatics(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk)的FastQC和Trim_galore分別去除低質(zhì)量序列和引物/接頭序列，得到高質(zhì)量序列(HQ reads)。后者經(jīng)Bowtie程序(http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml)處理去除人類基因組序列，余下的序列通過Tanoti(http://bioinformatics.cvr.ac.uk/tanoti.php)與187條HCV全長參考序列比對得到HCV reads。最后將HCV reads通過Tanoti的從頭組裝(de novo assembly)拼接得到HCV全長序列。該序列已上傳至Genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，進入號為MN385583。通過HCV-GLUE(http://hcv.glue.cvr.ac.uk/#/aboutGlueProject)進行RAS分析[10]。

1.7 HCV基因分型 采用本課題組此前建立的方法[4]，通過MEGA7.0，將2584號標本的序列和HCV各基因型/亞型參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，獲得準確基因分型。

2 結(jié)果

2.1 NGS測序結(jié)果 2584號標本的HCV RNA定量為1.57×107IU/ml。NGS共獲得8.4 Gb數(shù)據(jù)，raw reads數(shù)為56 092 306。去除引物序列、接頭序列以及低質(zhì)量序列后，高質(zhì)量序列(HQ)數(shù)為40 694 590，占72.5%。HCV reads數(shù)為33 295 509，占HQ reads的81.8%。

2.2 HCV全長序列分析 如圖1所示，2584號標本的HCV reads拼接后得到的序列對HCV基因組的覆蓋率為100%，即獲得病毒全長序列，平均測序深度為488 007。

圖1 2584號標本HCV核苷酸位點的測序深度

2.3 病毒基因分型 通過MEGA7.0對2584號標本的病毒全長序列和參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)。HCV基因1型-7型(gt1-gt7)形成7個不同的簇。2584號標本(紅點)位于HCV gt3的簇上，與13株3b亞型同源性最高，形成獨立分支，表明此標本屬于3b亞型。從3b的分支(圖2右)可見2584號標本和另外2株分離自中國的序列均位于C簇上，明顯獨立于A簇和B簇，提示我國的HCV 3b可能具有獨特的分子流行病學(xué)特征。

2.4 RAS分析 2854號標本的NS3、NS5A和NS5B RAS如表1所示。其中NS5A Q/A30K和L31M的豐度分別為99.16%和98.37%，屬于高豐度RAS。此外，還發(fā)現(xiàn)了10個低豐度RAS(<0.5%)，包括NS3 Y56H、Q80K、Q80R和A156G，NS5A M28G、Q/A30G、L31F和Y93H，以及NS5B S282T和V321A。

注：虛線方框為3b亞型，紅點標示為2584號標本。

表1 2584號標本的RAS分析

3 討論

HCV的基因型/亞型與病毒的傳播途徑，感染的發(fā)生、發(fā)展和治療方案密切相關(guān)，而且在不同地域的分布存在明顯差異。本研究的2584號標本屬于3b亞型，在廣州則較為少見，僅占HCV慢性感染者的5%[11]。受分段擴增和一代測序的限制，HCV 3b的全長序列很難獲得，迄今我國僅有2條3b全長序列上傳到Genbank。本研究采用NGS和生物信息學(xué)分析方法，成功獲得2584號標本的全長序列。與基于一代測序的傳統(tǒng)方法相比，本方法具有以下優(yōu)點：(1)采用序列非依賴性擴增，避免了特異性引物在擴增時引入偏倚；(2)大大減少了實驗操作的工作量和工作難度；(3)超大的數(shù)據(jù)量；(4)更高的靈敏度以檢測低豐度變異。

DAA因具有高SVR水平、不良反應(yīng)發(fā)生率低以及縮短治療時間等優(yōu)勢，已被認為是治療CHC的首選藥物[12]。根據(jù)藥物作用靶點的不同，DAA分為NS3/4A蛋白酶抑制劑、NS5A抑制劑和NS5B聚合酶抑制劑[5]。然而亦有DAA治療無效的病例報告，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)與RAS密切相關(guān)。這些RAS發(fā)生在患者所用DAA的靶基因上，導(dǎo)致藥物敏感性下降甚至無效[7]。通過臨床證據(jù)和體外試驗，目前已鑒定出約50個RAS[12]。HCV不同基因型/亞型之間的RAS和基因耐藥屏障不盡相同[7]?；€RAS影響著臨床治療方案的確定，包括DAA的選擇和療程的長短等。歐洲肝病學(xué)會建議，采用DAA治療CHC患者前需進行RAS檢測，尤其是選擇NS5A抑制劑前應(yīng)檢測NS5A 24～93位氨基酸序列是否含有基線RAS[12]。本研究在2584號標本發(fā)現(xiàn)NS5A Q/A30K和L31M兩個高豐度RAS，可能會導(dǎo)致對daclatasvir等6種DAAs無效。筆者也分析了Genbank的13條HCV 3b的全長氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其中12條也攜帶Q/A30K和L31M，1條攜帶Q/A30K，提示攜帶兩個基線RAS的3b亞型病毒株出現(xiàn)的頻率可能相當(dāng)高。值得注意的是，雖然這兩個RAS導(dǎo)致3b亞型對NS5A抑制劑耐藥已在體外試驗中被證實，但未見相關(guān)臨床報道。這可能與3b亞型少見于歐美國家有關(guān)。此外，雖然一般認為RAS的豐度超過15%才會影響DAA的療效，但亦有研究[13-14]指出，低豐度RAS在DAA的選擇壓力下可成為優(yōu)勢毒株導(dǎo)致治療無效或復(fù)發(fā)。本實驗在2584號標本檢測到10個低豐度RAS(<0.5%)。由于有著足夠的測序深度，這些RAS的reads均>25，表明不是測序錯誤，而是病毒序列中真實存在的變異。后續(xù)研究擬對該獻血者進行隨訪，尤其是DAA治療后的病毒核酸定期監(jiān)測，以了解低豐度RAS是否影響該獻血者的DAA療效。

本研究建立的基于NGS的HCV全長序列測定和RAS分析方法可進行進一步優(yōu)化。對于病毒載量高的標本，后續(xù)試驗在保證序列拼接質(zhì)量的前提下，可適當(dāng)降低NGS數(shù)據(jù)量和測序深度，以獲得更好的成本效益。此外，近年來，以單分子測序為技術(shù)核心的第三代測序技術(shù)(third generation sequencing, TGS)迅速發(fā)展。TGS最主要的優(yōu)勢在于超長的讀長，可達30 kb甚至超過100 kb，遠遠超過NGS的100～400 bp[15]。超長的讀長使得序列拼接更準確，也使得病毒準種的研究成為可能。然而，就當(dāng)前技術(shù)水平而言，TGS尚未能廣泛應(yīng)用于HCV或其他研究，主要是因為TGS在文庫構(gòu)建和測序的過程中沒有核酸擴增的步驟，因而對待測樣本的核酸濃度要求相當(dāng)高。從血漿中提取的病毒核酸，濃度往往很難達到TGS建庫要求。此外，TGS的測序錯誤率較高，不適用于測定基因組變異程度很高的HCV序列。總之，NGS是目前測定HCV全長序列的最好方法，但隨著技術(shù)水平的不斷發(fā)展，TGS有著更廣闊的應(yīng)用前景。